Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Иммунобиологические свойства вакцины против кампилобактериоза крупного рогатого скота в зависимости от компонентного состава Герасимов Сергей Вадимович

Работа не может быть доставлена, но Вы можете
отправить сообщение автору



Герасимов Сергей Вадимович. Иммунобиологические свойства вакцины против кампилобактериоза крупного рогатого скота в зависимости от компонентного состава: диссертация ... кандидата Ветеринарных наук: 06.02.02 / Герасимов Сергей Вадимович;[Место защиты: ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»], 2018.- 138 с.

Содержание к диссертации

Введение

1.Обзор литературы 12

1.1. Краткая историческая справка о кампилобактериозе 12

1.2. Морфологические свойства микроорганизмов рода Campylobacter 15

1.3. Культурально-биохимические свойства микроорганизмов рода Campylobacter 17

1.4. Антигенная структура микроорганизмов рода Campylobacter 19

1.5. Патогенность микроорганизмов рода Campylobacter 21

1.6. Устойчивость микроорганизмов рода Campylobacter в окружающей среде 25

1.7. Распространение микроорганизмов рода Campylobacter 26

1.8. Патогенез при кампилобактериозе 29

1.9. Клинические признаки и течение кампилобактериоза 31

1.10. Патологоанатомические изменения при кампилобактериозе 32

1.11. Диагностика кампилобактериоза 33

1.12. Лечение, меры борьбы и профилактики при кампилобактериозе 38

1.12.1.Специфическая профилактика кампилобактериоза 38

1.12.1.1.Адъюванты 39

1.12.2. Общие меры борьбы и профилактики при кампилобактериозе 50

2. Собственные исследования 54

2.1. Материалы и методы 54

2.1.1. Материалы 54

2.1.2. Методы 57

2.1.2.1.Приготовление вакцины 57

2.2.2.2. Изучение иммунобиологических свойств полученной вакцины 61

2.2. Результат исследований 65

2.2.1. Культивирование возбудителя Campylobacter fetus subspecies fetus, накопление биомассы возбудителя 65

2.2.2. Отработка режима инактивации возбудителя кампилобактериоза, подбор инактиватора и оптимальной его концентрации, контроль инактивации 70

2.2.3. Подбор адъювантов для изготовления инактивированных вакцин против кампилобактериоза 75

2.2.4.Сравнительные лабораторные испытания свойств полученных образцов вакцины: стабильности, длительности прививочного иммунитета, безвредности, реактогенности, иммуногенности и антигенной активности 77

2.2.5. Влияние полученных образцов вакцины против кампилобактериоза на уровень общего белка и белковых фракций в крови морских свинок 89

2.2.6. Экономическое обоснование 96

3. Обсуждение результатов 100

Заключение 110

Практические предложения 112

Список сокращений и условных обозначений 113

Список использованной литературы 114

Приложения 130

Введение к работе

1.1 Актуальность темы

Кампилобактериоз – зоонозная бактериальная инфекция животных многих видов, представляет собой актуальную проблему как для ветеринарной, так и для гуманной медицины во всём мире (Шумилов К.В., Скляров О.Д., 1999; Каравайчик А.Л., 2001; Новикова О.Б., 2004; Гришина В.А., Красовская Т.М., 2010; Elbrissi A. et all, 2017). Значительный вклад в изучение кампилобактериоза животных и птицы внесли отечественные ученые Шумилов К.В., Скляров О.Д., Триленко П.А., Белик В.В., Голиков А.В., Трубицкий А.Н., Новикова О.Б., Савин И.С. и другие исследователи.

Поражающий крупный рогатый скот штамм Сampylobacter fetus subspecies fetus обладает тропизмом к репродуктивной системе скота, вызывает хронические вагиниты, метриты и орхиты, аборты и проблемы с осеменением коров. Перечисленное выше приводит к выбраковке животных, значительным экономическим потерям (Шумилов К.В., Скляров О.Д., 1999).

В условиях Северо-Западного региона РФ в течение последних 10 лет
выполнен комплекс бактериологических, микроскопических исследований
биоматериала и патологического материала и серологических исследований в РА
по диагностике кампилобактериоза у различных видов животных. Установлена
высокая степень кампилобактерионосительства. Выявлено превалирующее

влияние в инфекционном процессе подвидов C. jejuni sbsp. jejuni и C.fetus sbsp. fetus. (Кузьмин В.А., Гришина В.А., 2016; Сухинин А.А., Гришина В.А., 2008).

Для успешной борьбы с кампилобактериозом крупного рогатого скота применяется вакцина. Однако она не является абсолютно безопасной. Поэтому усовершенствование вакцины путем подбора инактиватора минимизирующего подобные явления и адъюванта для повышения ее антигенных и иммуногенных свойств является актуальной задачей.

1.2 Степень разработанности проблемы

В рамках профилактических мероприятий по борьбе с кампилобактериозом крупного рогатого скота применяется гидроокись алюминиевая формол-вакцина

против кампилобактериоза на основе культуры бактериальных клеток Сampylobacter fetus subspecies fetus.

Однако, используемый при производстве вакцины инактиватор (формалин) обладает токсическими свойствами, провоцирует аллергические и воспалительные реакции в организме животного, кроме того, требует усиленной защиты дыхательных путей (респиратор) и кожных покровов (прорезиненные толстые перчатки) специалиста при работе с ним (ГН 2.2.5.1313-03 от 30.12.2003 №76; ГН 1.1.725-98 от 23.12.1998 №32; Р.Я.Мешкова, 2008; Н. Ковалев, П. Красочко, 2017).

Кроме того, необходим поиск новых сочетаний адъювантов, способных динамично, безопасно повышать антигенные и иммуногенные свойства вакцины.

1.3 Цель и задачи исследования

Цель данной работы заключалась в изучении иммунобиологических свойств инактивированной вакцины против кампилобактериоза крупного рогатого скота в зависимости от компонентного состава.

Для осуществления цели были поставлены следующие задачи:

подобрать оптимальную питательную среду для культивирования штамма Campylobacter fetus subspecies fetus в целях выделения чистой культуры и подготовки достаточного количества биомассы возбудителя как основы при изготовлении вакцины против кампилобактериоза крупного рогатого скота;

отработать способ инактивации возбудителя Campylobacter fetus subspecies fetus: подобрать инактивирующий агент и оптимальную его концентрацию при изготовлении вакцины против кампилобактериоза, оценить полноту инактивации возбудителя;

- подобрать адъювант для изготовления вакцины против кампилобактериоза,

- отработать процесс совмещения адъюванта с инактивированной биомассой
возбудителя Campylobacter fetus subspecies fetus;

- провести лабораторные испытания по оценке иммунобиологических свойств
полученной вакцины против кампилобактериоза: стабильность, длительность
прививочного иммунитета, безвредность, реактогенность, иммуногенность и
антигенная активность.

1.4 Научная новизна результатов исследований

Получена экспериментальная питательная среда для культивирования Campylobacter fetus subspecies fetus с добавлением эритроцитов барана.

Определены ее преимущества по сравнению с известными аналогами.

Подопытные образцы вакцины, изготовленные из данной культуры, отвечали необходимым требованиям, предъявляемым к биологическим препаратам.

Впервые проведена полная инактивация штамма Campylobacter fetus subspecies fetus препаратом теотропин. Определены оптимальные параметры инактивации: процентные соотношения теотропина к общей массе препарата. Показаны преимущества нового метода относительно известной инактивации указанного штамма соединениями формалина, а также относительно инактивации штамма соединениями аминоэтилэтиленимина.

Впервые в качестве адъюванта при изготовлении вакцины против кампилобактериоза на основе культуры штамма Campylobacter fetus subspecies fetus использованы гидроокись алюминия и масляный адъювант (состоящий из эмульгатора (биологически инертное кремнийорганическое соединение цетил-ПЭГ/ППГ-10/1-диметикон) – 1,5% и масляной основы - вакцинное масло "М" по ТУ 381011224 – 98,5%). Определены оптимальные режимы добавления адъювантов в препарат, процентные соотношения адъювантов к общей массе препарата.

Подана заявка на изобретение «Способ инактивации возбудителя

кампилобактериоза крупного рогатого скота» (дата публикации заявки 05.10.2017г. Бюлл. №28).

Получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы заявки на изобретение «Способ получения гидроокись алюминиевой масляной тео-вакцины против кампилобактериоза» (заявка № 2016129877/10(046477).

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая и практическая значимость работы состоит в расширении знаний применения теотропина в качестве инактиватора штамма Campylobacter fetus subspecies fetus и нового сочетания адъювантов.

Подобран оптимальный состав питательной среды для культивирования возбудителя.

Установлена эффективность и безопасность применения теотропина в
качестве инактиватора Campylobacter fetus subspecies fetus и нового сочетания
адъювантов. Предложенный образец инактивированной гидроокись

алюминиевой-масляной-тео-вакцины против кампилобактериоза более

эффективен, безопасен и более целесообразен, чем известный аналог гидроокись алюминиевая-формол-вакцина.

Разработаны «Методические рекомендации по диагностике и профилактике кампилобактериоза крупного рогатого скота» (одобрены ученым советом ФГБОУ ВО «СПбГАВМ» и утверждены Заместителем Председателя Правительства, председателем комитета по агропромышленному и рыбохозяйственному комплексу Ленинградской области 30.05.2017г.).

Разработаны «Временная инструкция по изготовлению и контролю
гидроокись алюминиевой масляной тео-вакцины против кампилобактериоза
крупного рогатого скота» и «Временное наставление по применению гидроокись
алюминиевой масляной тео-вакцины против кампилобактериоза крупного
рогатого скота» (утверждены ректором ФГБОУ ВО «СПбГАВМ» и согласованы с
Начальником Управления ветеринарии – главным государственным

ветеринарным инспектором Ленинградской области 29.11.2017г.).

Теоретические и практические разработки диссертации используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии, вирусологии и иммунологии; и эпизоотологии ФГБОУ ВО СПбГАВМ.

Гидроокись алюминиевая масляная тео-вакцина рекомендована для внедрения в ветеринарную практику.

Работа проводилась в соответствии с тематическим планом-заданием на
выполнение научно-исследовательских работ по заказу Министерства сельского
хозяйства Российской Федерации за счет средств федерального бюджета в 2017
году по теме: «Разработать систему мероприятий по профилактике
кампилобактериоза крупного рогатого скота с использованием

усовершенствованной вакцины».

1.6 Методология и методы исследования

Работа построена на методологических принципах, учитывающих:

  1. Патогенность, морфологические, культурально-биохимические свойства возбудителя кампилобактериоза крупного рогатого скота Campylobacter fetus subspecies fetus;

  2. Питательность и насыщенность питательных сред, их пригодность для культивирования возбудителя Campylobacter fetus subspecies fetus;

  3. Стабильность, длительность прививочного иммунитета, безвредность, реактогенность, иммуногенность и антигенная активность вакцины против кампилобактериоза крупного рогатого скота;

  4. Сравнительные свойства различных инактиваторов и адъювантов, входящих в состав различных образцов вакцины против возбудителя кампилобактериоза крупного рогатого скота Campylobacter fetus subspecies fetus;

  5. Вид лабораторного (подопытного) животного, породные и половозрастные особенности, характер и условия содержания и кормления, вероятные факторы заражения кампилобактериозом. Объектом исследования являлись морские свинки.

В диссертационной работе были применены следующие методы:
бактериоскопический, бактериологический, биологический, клинический,

биохимический, статистический.

1.7 Положения, выносимые на защиту

  1. Использование экспериментальной питательной среды с добавлением эритроцитов барана для культивирования возбудителя Campylobacter fetus subspecies fetus;

  2. Применение теотропина в качестве инактивирующего агента и подбор оптимальной его концентрации при изготовлении вакцины против кампилобактериоза, оценка полноты инактивации возбудителя Campylobacter fetus subspecies fetus;

  3. Дополнительное использование масляного адъюванта для изготовления вакцины против кампилобактериоза с целью усиления иммуногенных свойств

гидроокиси алюминия, технология совмещения адъювантов с

инактивированной биомассой возбудителя Campylobacter fetus subspecies fetus;
4. Оценка иммунобиологических свойств полученной вакцины против

кампилобактериоза: стабильность, длительность прививочного иммунитета, безвредность, реактогенность, иммуногенность и антигенная активность.

1.8 Личный вклад соискателя

Диссертационная работа представляет собой результат исследований автора за период с 2013 по 2017 год. Большая часть научных исследований, описанных в работе, выполнена аспирантом самостоятельно. У соавторов научных публикаций С.В. Герасимова не имеется возражений против использования в данной работе материалов совместных исследований.

1.9 Степень достоверности и апробация результатов

Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ФГБОУ ВО СПбГАВМ (2013-2017 гг.), научно-практических конференциях: 7-ой Всероссийский инфекционный конгресс, Международный Ветистанбул Конгресс 2015, Международная Конференция в Чикаго 2016, Мечниковские Чтения – 2016, III Симпозиум с международным участием «Интеллектуальная собственность и инновации: лучшие практики» 2017, Евразийская научно-практическая школа-конференция молодых ученых «Технологии нового поколения» 2017. Достоверность результатов исследований подтверждена комиссионными испытаниями (акт комиссионных испытаний, утвержден ректором ФГБОУ ВО СПбГАВМ от 25 апреля 2016 года).

1.10 Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 в изданиях по Перечню ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.

1.11 Объем и структура диссертации

Патогенность микроорганизмов рода Campylobacter

Всестороннее изучение патогенности выделяемых культур кампилобактерий в условиях широкого бактерионосительства кампилобактерий у животных имеет важнейшее значение, т.к. является необходимым для уточнения их роли в этиологии кампилобактериоза (Шихама Я.А. и др., 2008).

Удобной лабораторной моделью для изучения патогенности Campylobacter являются морские свинки (беременные и небеременные). В.В.Белик и соавт. определяли патогенность культур C.jejuni, выделенных у больных c острым желудочно-кишечным расстройством (ОЖКР), новорожденных телят и коров из родильного отделения, на беременных и небеременных морских свинках.

Авторами показано, что все испытуемые культуры C.jejuni оказались патогенными для взрослых морских свинок. При бактериологическом исследовании внутренних паренхиматозных органов павших и декапитированных морских свинок исходные культуры Campylobacter были выделены из печени, головного мозга, костного мозга и селезенки.

Выделение культур Campylobacter наблюдалось при всех дозах заражения, однако было более выражено в первую неделю после введения заражающей взвеси. Проявление инфекции и величина инфицирующей дозы зависят от вирулентности штамма, вида и возраста используемых животных, способа заражения, иммунного состояния организма. Восприимчивость макроорганизма к кампилобактериозу вызывают иммунологические нарушения, в частности различные иммунодефицитные состояния (Bereswill S. et all., 2017). Бактериемия у экспериментально зараженных животных может наблюдаться уже через 3-6 часов и сохраняться до 4 недель.

Campylobacter обладают широким набором факторов вирулентности, вызывающих интоксикацию организма и обеспечивающих развитие различных по клиническим проявлениям патологических процессов (Elbrissi A. et all., 2017). Campylobacter проявляют адгезивную и инвазивную активность. Развитие кампилобактериозной инфекции начинается с попадания возбудителей в пищеварительную или репродуктивную систему макроорганизма и их прикрепления к эпителиальным клеткам, то есть с проявления их адгезивной активности. Прикрепление микроорганизмов к энтероцитам происходит в результате взаимодействия специфических адгезинов бактерий с рецепторами клеток хозяина. У большинства видов кишечных патогенов адгезины локализуются, в первую очередь, на поверхности жгутиков, что доказано многими авторами в экспериментах in vivo и in vitro. Мутантные штаммы с дефектом синтеза жгутиков фагоцитируются гранулоцитами активнее, чем родительские штаммы. Campylobacter обладают несколькими типами адгезинов: как к плазмолемме эпителиальных клеток кишечника, так и к слизи, покрывающей эпителий кишечника. Отдельные штаммы Campylobacter могут различаться и по способности прикрепляться к отдельным видам клеток. При этом степень адгезивности кампилобактеров коррелирует с тяжестью заболевания и клиническими особенностями его течения (Шихама Я.А. и др., 2009).

Патогенные свойства Campylobacter связаны также с наличием у возбудителя высокой активной подвижности и хемотаксиса: они способны проникать через слизь и перемещаться вдоль эпителиальных клеток, при этом установлено, что клетки бактерий сохраняют подвижность в слизи 30-40 минут. Инвазивная активность возбудителей, которые легко проникают через наружную мембрану эпителиальных клеток или через межклеточные промежутки эпителия, имеет большое значение в патогенезе кампилобактериоза. По мнению некоторых авторов С.fetus ssp. jejuni и C.jejuni способны к внутриклеточному размножению с дальнейшей гибелью инвазированных клеток (Esson D. et all, 2016). Способность C.jejuni к внутриклеточной инвазии подтверждается клиническими данными (слизь и кровь в фекалиях) и патоморфологическими изменениями у людей, животных, куриных эмбрионов (воспалительные изменения и отек слизистой оболочки кишечника, дегенеративные изменения клеток эмбрионов).

Большое практическое и теоретическое значение имеет вопрос о токсинах Campylobacter (Liu F. et all., 2016). Как и все грамотрицательные бактерии, Campylobacter обладает эндотоксинами. Известно, что эндотоксин грамотрицательных бактерий - это липополисахарид клеточной стенки. Несмотря на то, что в экспериментах термостабильный эндотоксин Campylobacter способен вызвать геморрагические, некротические изменения кожи в местах введения суспензии бактерий и даже гибель животных, его роль в патогенезе кампилобактериозных энтеритов не может считаться ведущей. Однако, при генитальной форме кампилобактериозной инфекции его значение увеличивается во много раз (Liu F. et all , 2016). Общепризнанной является способность Campylobacter различных видов к продукции термолабильного энтеротоксина, который имеет антигенное родство с холерогеном и энтеротоксином E.coli (Госманов Р.Г., Ибрагимова А.И., 2013).

Кроме эндотоксинов и энтеротоксинов Campylobacter обладают цитотоксинами (цитолитическими токсинами). Исследования по изучению цитопатогенных свойств отечественных штаммов Campylobacter проводили Д.Л.Кирик, Е.А.Шабловская в системе in vitro на перевиваемой клеточной культуре Нер-2, что позволило им дифференцировать кампилобактерий на 3 группы по степени выраженности этого признака (высокоцитопатогенные, цитопатогенные, ацитопатогенные) и судить о вирулентности испытуемых штаммов. Авторы исследовали 196 штаммов бактерий рода Campylobacter различного происхождения. Наличие среди них значительного числа (44,1%) высокоцитопатогенных "куриных" штаммов, по их мнению, предопределило ведущую роль кур в качестве источника кампилобактериозной инфекции.

Анализ Д.Л.Кирик, Е.А.Шабловской цитопатогенной активности плазмидосодержащих штаммов и их безплазмидных клонов показал, что этот критерий вирулентности статистически значимо (р 0,01) увеличивался при потере штаммами плазмид. Авторы предполагали, что процессы формирования полирезистентных к антибиотикам штаммов Campylobacter и уменьшение их цитопатогенной активности (вирулентности) в популяции бактерий идут параллельно и связаны между собой.

Подводя итоги, можно утверждать, что исследования, посвященные изучению адгезивной, инвазивной, токсигенной и цитопатогенной активности бактерий рода Campylobacter, характеризуют вирулентный потенциал этих микроорганизмов и степень их опасности, как эпизоотической, так и эпидемической.

Общие меры борьбы и профилактики при кампилобактериозе

При подтверждении кампилобактериоза у крупного рогатого скота в хозяйствах устанавливают ограничительные мероприятия. Коров с признаками гинекологической патологии лечат антибиотиками путем внутримышечных инъекций и местного применения (внутриматочно). Для лечения быков применяют антибиотики (внутримышечно), и местно - обработку препуциальной полости 3%-ной перекисью водорода и раствором фурацилина (Truyers I. et all., 2014).

Для лечения больных быков применяют пенициллин и стрептомицин, антибиотики эмульгируют в 50-60 мл растительного масла или рыбьего жира. Препараты вводят в препуциальннй мешок после его обработки антисептическими растворами. Одновременно с этим указанные антибиотики в дозе по 4 тыс. ЕД на кг массы животного на 0,5% растворе новокаина 2 раза в сутки инъецируют внутримышечно. После четырехдневного лечения делают перерыв за 5-6 дней. Затем курс терапии повторяют: дважды в сутки внутримышечно вводят окситетрациклин по 5 тыс. ЕД/кг массы животного.

Препуций обрабатывают 5%-ной эмульсией фуразолидона. Через месяц после лечебных процедур сперму быка трижды с интервалом в 10 дней подвергают бактериологическому исследованию на кампилобактериоз. При отрицательных результатах исследования быков признают здоровыми (Белик В.В. и др., 1985).

Коров лечат также пенициллином и стрептомицином. Антибиотики по 1 млн ЕД вводят в полость матки в течение 4 дней. Кроме этого инъекцируют внутримышечно стрептомицин по 4 тыс. ЕД на кг массы в сутки. Влагалище орошают раствором фурациллина или риванола.

В целях профилактики болезни быков, находящихся на станциях искусственного осеменения, регулярно исследуют на кампилобактериоз (за одно исследование принимается трехкратный анализ проб препуциальной слизи и спермы, полученных с интервалом в 7-10 дней). Для санации спермы от возбудителя кампилобактериоза в нее вносят антибиотики и сульфаниламиды (Iizumi T. et all., 2016).

Неплохие результаты достигаются при лечении кампилобактериоза эритромицином, как при терапии человека, так и животных разных видов. Тем не менее, для эффективной терапии необходимо предварительное определение in vitro чувствительности к антибиотикам у выделенных штаммов, так как известны случаи резистентности кампилобактеров к эритромицину и тетрациклину (Силина Е.А. и соавт., 2011). В этих целях с наилучшим успехом могут быть использованы ампициллин, стрептомицин, канамицин, пентриксил, теллуристокислый калий, тетрациклин, тиомерсал, фуразолидон, хлортетрациклин, левомицетин, мицерин, мономицин, окситетрациклин, дигидрострептомицин с ампициллином, окситетрациклин с олеандомицином или с фуразолидоном (McDougall S., 2001).

При кампилобактериозе, обусловленном С.fetus s.fetus, применяют левомицетин (хлорамфеникол) по 0,1-0,5 г (3-4 раза в сутки в течение 7-10 дней); хлортетрациклин (окситетрациклин), стрептомицин; цефалоспорины (кефзол, клафоран, фортум, цедекс) и фторхинолоны (энроксил, байтрил, цифран, ципробай) - по 0,25 г 2 раза в сутки в течение 7 дней (Truyers I. et all., 2014).

В ветеринарной практике при лечении и профилактике различных состояний, сопровождающихся эндотоксикозами, которые имеют место и при кампилобактериозе весьма перспективным является применение эфферентных методов. Наиболее физиологичным методом эфферентной терапии является энтеросорбция.

Противоэпизоотическая работа при кампилобактериозе представляет собой систему профилактических и оздоровительных мероприятий в животноводческих хозяйствах, включающую в том числе вакцинацию животных (Временная инструкция о мероприятиях по диагностике, профилактике и ликвидации вибриозов крупного рогатого скота и овец, 1979).

Профилактические мероприятия при кампилобактериозе, вызванном С. fetus, сводятся также к:

- приобретению племенных животных, особенно производителей и спермы, только в благополучных хозяйствах;

- подбору и применению экспресс диагностики кампилобактериоза у животных;

- гинекологическому обследованию племенных животных на кампилобактериозное поражение и носительство;

- изучению количественных и качественных показателей спермопродукции племенных самцов;

- изоляции, лечению или выбраковке племенных производителей, пораженных кампилобактериозом;

- разработке и применению специфических средств профилактики (вакцин, сывороток) против кампилобактериоза;

- недопущению скармливания молодняку молока в сыром виде от животных, больных кампилобактериозом (Санитарные правила СП 3.1.087-96.

Ветеринарные правила ВП 13.4.1307-96).

Отработка режима инактивации возбудителя кампилобактериоза, подбор инактиватора и оптимальной его концентрации, контроль инактивации

В процессе усовершенствования технологии изготовления инактивированной вакцины стояла задача провести инактивацию штамма Campylobacter fetus sbsp. fetus, подобрать инактиватор, более эффективный и безопасный, чем формалин, а также оптимальную его концентрацию по отношению к биомассе возбудителя.

Инактивацию штамма Campylobacter fetus subspecies fetus аминоэтилэтиленимином проводили следующим образом.

Инактивацию проводили аминоэтилэтиленимином в виде 1%-го раствора (из расчета 0,2; 0,4; 0,6 и 0,8 гр. сухого вещества на 100 мл биомассы). Необходимый объём аминоэтилэтиленимина стерильно вносили в смытую биомассу возбудителя. Перемешивали в течение 2 минут. Флаконы запечатывали, помещали в эксикатор для создания бескислородных условий. Эксикатор с флаконами помещали в термостат. Инактивация проходила в бескислородных условиях при 37С в течение 2 суток.

Контроль инактивации осуществляли путем посева полученной инактивированной биомассы на ПЖА, а также микроскопией инактивированных клеток.

Инактивацию штамма Campylobacter fetus subspecies fetus теотропином проводили следующим образом.

Инактивацию проводили теотропином в виде порошка (0,2; 0,3; 0,4 гр. сухого вещества на 100 мл биомассы). Необходимую навеску теотропина стерильно вносили в смытую биомассу возбудителя. Перемешивали в течение 2 минут. Флаконы запечатывали, помещали в эксикатор для создания бескислородных условий. Эксикатор с флаконами помещали в термостат. Инактивация проходила в бескислородных условиях при 37С в течение 2 суток.

В качестве контроля такой же опыт проводили с формалином в конечной концентрации 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5%.

Контроль инактивации осуществляли путем посева полученной инактивированной биомассы на ПЖА, а также микроскопией инактивированных клеток (таблица 1).

В результате проведенных исследований было установлено, что возбудитель Campylobacter fetus subspecies fetus полностью терял свою инфекционную активность через 48 часов инактивации, при конечной концентрации теотропина от 0,3%. Таким образом, полученные результаты показывают, что использованная технология инактивации возбудителя кампилобактериоза достаточно надёжна и может быть использована при изготовлении вакцины.

Что касается испытаний аминэтилэтиленимина как инактивирующего агента Campylobacter fetus subspecies fetus, то нами было установлено, что инактиватор не обеспечивал полную инактивацию возбудителя даже в больших концентрациях (0,8% и выше). Таким образом, дальнейшие испытания аминоэтилэтиленимина были сочтены нецелесообразными.

Влияние полученных образцов вакцины против кампилобактериоза на уровень общего белка и белковых фракций в крови морских свинок

Определение белкового спектра сыворотки крови в рамках иммунологического исследования является одним из критериев общей реактивности и резистентности организма. Это обусловлено тем, что антитела входят в состав гамма-глобулиновой фракции и являются иммунологически изменёнными глобулинами.

Введение различных антигенов приводит к иммунологическим сдвигам в организме, которые находят отражение в изменении белкового обмена, как правило, в сторону увеличения общего количества белка и его фракций.

В рамках нашей работы мы сравнили иммунобиохимические характеристики сыворотки крови морских свинок, вакцинированных гидроокись алюминиевой формол-вакциной и гидроокись алюминиевой масляной тео-вакциной.

Использовали 40 морских свинок 6 месячного возраста, которых разделили на 4 группы по 10 голов в каждой по принципу аналогов. Морские свинки всех групп получали одинаковый рацион.

Контрольная группа (1-ая) морских свинок не вакцинировалась.

Морские свинки 2-ой и 3-ей групп были подкожно вакцинированы гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакциной в следующих дозах:

2 группа – 5 млрд. м.кл. (0,5 мл)

3 группа – 10 млрд. м.кл. (1,0 мл)

Морские свинки 4-ей группы были вакцинированы гидроокись алюминиевой-формол-вакциной в дозе 10 млрд. м.кл. (1,0 мл)

Вакцину вводили морским свинкам подкожно, однократно. В сыворотке крови определяли концентрацию общего белка общепринятым биуретовым методом, соотношение белковых фракций нефелометрическим методом по Оллу и Маккорду и титры специфических антител в реакции агглютинации. Для выявления биохимических реакций организма у морских свинок брали (из сердца) кровь непосредственно перед иммунизацией, а затем через 21 день после вакцинации.

Данные о содержании общего белка в сыворотке крови вакцинированных морских свинок и животных контрольной группы представлены в таблице 4.

Анализ полученных данных свидетельствует, что в третьей группе морских свинок, иммунизированных гидроокись алюминиевой-масляной-тео-вакциной в дозе 10 млрд. м.кл. отмечено максимальное нарастание количества общего белка до 53,7 ± 0,7 г/л к 21 дню после иммунизации.

После вакцинации у морских свинок четвертой группы, иммунизированных гидроокись алюминиевой формол-вакциной, отмечено нарастание количества общего белка до 51,4 + 0,38 г/л к 21 дню после иммунизации.

При оценке результатов фракционирования белка сыворотки крови морских свинок группы №3, иммунизированных гидроокись алюминиевой масляной тео-вакциной, отмечалось снижение среднего числа альбуминов, с 44,7 ±1,78% до вакцинации, до 41,8 ±0,75% на 21 день исследования после вакцинации. Также отмечено значительное увеличение фракции гамма-глобулинов: до вакцинации 18,6 ±1,53%, на 21 день до 24,3 ±0,81% и увеличение фракции бетта-глобулинов: до вакцинации 15,3 ± 1,44%, 21 день -до 19,05 ±0,67%.

При оценке результатов фракционирования белка сыворотки крови морских свинок группы №4, иммунизированных гидроокись алюминиевой формол-вакциной, отмечалось снижение среднего числа альбуминов, с 44,7 ± 1,78%, до вакцинации, до 39,6 ±0,69% на 21 день исследования после вакцинации. Также отмечено увеличение фракции гамма-глобулинов: до вакцинации 18,6 ±1,53%, 21 день - до 21,7 ±0,72% и увеличение фракции бетта-глобулинов: до вакцинации 15,3± 1,44%, 21 день - до 16,5±0,86%. Для оценки значимости различий полученных результатов в двух подопытных группах мы использовали t - критерий Стьюдента, рассчитываемый как разность средних значений, поделенная на сумму квадратов ошибок, по формуле

Если значение рассчитанного t - критерия Стьюдента меньше табличного, значит различия сравниваемых величин статистически не значимы. После выполнения расчетов, значение t - критерия оказалось равным:

- при оценке содержания общего белка: t = 2,89;

- при оценке содержания альбуминов: t = 2,16;

- при оценке содержания - глобулинов: t = 2,24;

- при оценке содержания - глобулинов: t = 2,145;

- при оценке содержания - глобулинов: t = 2,21.

Далее мы сравнивали полученные значения t - критерия Стьюдента (2,89; 2,16; 2,24; 2,145 и 2,21) с критическим при р=0,05 значением, указанным в таблице 4: 2,101.

Так как рассчитанное значение критерия больше критического, делаем вывод о том, что наблюдаемые различия статистически значимы (уровень значимости р 0,05).

У морских свинок контрольной группы, а также группы №2, иммунизированных экспериментальным образцом гидроокись алюминиевой масляной тео-вакцины в небольших дозах: 5 млрд. м.кл. (0,5 мл), в течение всего опыта не было отмечено значительных изменений в составе белкового спектра сыворотки крови.

Исходя из полученных результатов установлено, что в ответ на введение гидроокись алюминиевой формол-вакцины и гидроокись алюминиевой масляной тео-вакцины наблюдалось нарастание общего белка в сыворотке крови иммунизированных морских свинок, которое в основном достигалось за счёт увеличения фракции гамма-глобулинов. Учитывая, что антитела находятся, главным образом, в гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови, можно сделать вывод, что изменение белкового спектра сыворотки крови при применении вакцины носит иммуногенный характер, связанный с выработкой антител.

Также необходимо отметить, что после вакцинации морских свинок гидроокись алюминиевой масляной тео-вакцины против кампилобактериоза в дозе 10 млрд. м.кл. (1,0 мл) содержание гамма–глобулинов, а также бетта-глобулинов в сыворотке крови увеличивалось в динамике, и было значительно выше, чем при иммунизации той же вакциной в дозе 5 млрд. м.кл. (0,5 мл), а также гидроокись алюминиевой формол-вакциной в дозе 10 млрд. м.кл. (1,0 мл) (табл. 5).