Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Общие сведения о болезни 10
1.2 Таксономия вируса 11
1.3 Физико-химические свойства вируса 11
1.4 Особенности эпизоотологии и патогенез 12
1.5 Диагностика и классификация штаммов вируса ИБК 13
1.6 Инфекционная активность вируса ИБК 19
1.7 Иммунитет 23
1.7.1 Пассивный иммунитет 23
1.7.2 Активный иммунитет 24
1.8 Контроль и профилактика ИБК 27
1.9 Заключение по обзору литературы 31
2. Собственные исследования 33
2.1 Материалы 33
2.2 Методы исследования 36
2.2.1 Оценка эпизоотической ситуации 36
2.2.2 Подготовка вируссодержащего материала 36
2.2.3 Определение условий культивирования штамма QX вируса ИБК на куриных эмбрионах 36
2.2.4 Репродукция вируса на культурах клеток 36
2.2.5 Титрование вируса 36
2.2.6 Определение степени антигенного родства 37
2.2.7 Оценка патогенных свойств штамма QX 38
2.2.8 Оценка протективной функции вакцины из штамма
HI20 серотипа Mass против заражения штаммом QX 38
2.2.8.1 Тест на цилиостаз 38
2.2.8.2 Выделение нуклеиновой кислоты
2.2.8.3 ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и
секвенирование фрагмента гена S1 39
2.2.9 Статистическая обработка результатов экспериментов 39
3. Результаты собственных исследований 40
3.1 Вирус ИБК генотипа QX. Эпизоотическая ситуация 40
3.2 Культивирование вируса ИБК штамма QX в КЭ и в культурах клеток 44
3.3 Оценка антигенной чистоты рабочих расплодок 51
3.4 Изучение антигенной «удаленности» штамма QX по отношению к другим штаммам вируса ИБК 53
3.4.1 Исследование гомологичной нейтрализующей активности иммунных сывороток крови кур 54
3.4.2 Оценки антигенной удаленности штамма QX по отношению к другим штаммам вируса ИБК 56
3.4.3 Сравнение антигенных свойств вируса ИБК штаммов QX и L1148 в реакциях с сыворотками к вирусам Н120, 4/91, D27, и QX 63
3.5 Патогенные свойства штамма QX 65
3.6 Использование теста на цилиостаз и ПЦР для оценки результативности вакцинации (протективного действия) вакцины 71
3.7 Обсуждение результатов исследования. 80
4. Выводы 88
5. Практические предложения 89
6. Список литературы
- Диагностика и классификация штаммов вируса ИБК
- Определение условий культивирования штамма QX вируса ИБК на куриных эмбрионах
- Изучение антигенной «удаленности» штамма QX по отношению к другим штаммам вируса ИБК
- Использование теста на цилиостаз и ПЦР для оценки результативности вакцинации (протективного действия) вакцины
Диагностика и классификация штаммов вируса ИБК
Вирус ИБК - оболочечный, округлой или плеоморфной формы вирус размером 80-120 нм в диаметре. Геном вируса состоит из одноцепочечной РНК, которая образует комплекс с нуклеокапсидным белком (N). Билипидная оболочка клеточной мембраны окружает нуклеокапсид вириона, что делает вирион чувствительным к липидным растворителям, например, хлороформу [113]. Комплекс РНК и нуклеокапсидный белок (спиральный нуклеокапсид) окружен мембраной. Оболочка вируса содержит три вирусных белка: белок шипов (S), гликопротеин типа I, который формирует на поверхности вируса пепломеры, напоминающие корону, мембранный белок (М) и гидрофобный оболочечный белок (Е). Также известен ряд неструктурных белков вируса, которые участвуют в стадии репликации [121].
Плотность частиц вируса в растворе хлористого цезия составляет 1,24 г/мл. Большинство штаммов вируса ИБК инактивируются в течение 15 минут при 56С или за 90 минут при 45С. Автоклавирование и воздействие микроволн губительно сказывается на инфекционной активности вируса, но вирусная РНК может быть обнаружена в ОТ-ПЦР. Вирус в составе экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ) куриных эмбрионов (КЭ) может остаться жизнеспособным в течение многих лет при минус 30С, а в лиофилизированном виде - до 50 лет. Вирус ИБК может быть выделен из инфицированных тканей, консервированных в 50% глицерине, что стоит учитывать при транспортировке образцов для исследования. Некоторые штаммы вируса устойчивы при рН 3, тогда как некоторые в кислой среде инактивируются. В культуре клеток вирус более стабилен при рН 6,0-6,5 чем при рН 7,0-7,5. Вирус эфирлабильный, но некоторые штаммы сохраняют активность после воздействия 20% эфира (4С, 18 ч). Воздействие 50% хлороформом при комнатной температуре в течение 10 мин и 0,1% дезоксихолатом натрия (4С, 18 ч) полностью инактивирует вирус [144]. Вирус ИБК чувствителен к наиболее распространенным дезинфицирующим средствам, в том числе 0,05% или 0,1% бетапропиолактону [63] или 0,1% формалину. Бетапропиолактон не влияет на антигенные свойства вируса [145, 56].
ИБК - заболевание преимущественно кур (Gallus gallus domesticus), но ученым удавалось выделить вирус от фазанов, цесарок, индеек, голубей и гусей с различными патологиями [24, 43]. Воротами инфекции являются верхние дыхательные пути, где вирус реплицируется в эпителиальных тканях органов дыхания, а также вирус может реплицироваться в других органах, имеющих эпителиальные клетки (почки, яйцевод, придатки, пищевод, железистый желудок, слепокишечные миндалины, бурса Фабрициуса).
Источником болезни является больная птица, выделяющая вирус в окружающую среду с экскретами. Заражение в основном происходит воздушно-капельным путем или контактно через обслуживающий персонал или инвентарь. Мнения ученых о трансовариальной передаче вируса расходятся [119]. Неодинаково мнение исследователей и о роли петушков в распространении вируса, т.к ряд племенных хозяйств не применяет профилактическую вакцинацию петушков [37, 151]. Ученым удавалось выделить вирус ИБК из семенников и спермы [36]. Некоторые авторы связывали эпидидимиты и камни в придатках семенников с воздействием вируса ИБК [119, 151]. Показана также чувствительность птиц к болезни в зависимости от породы [39, 41, 144]. Влияние сезонности на развитие болезни в условиях промышленного птицеводства не имеет большого значения, так как птиц выращивают круглогодично, а зоогигиенические нормы практически одинаковы во всех временных промежутках. Несмотря на высокую чувствительность к дезинфектантам и повсеместно проводимую специфическую профилактику в настоящее время не существует стран, благополучных по ИБК. Некоторые штаммы вируса способны вызывать болезнь у 100% поголовья, а смертность может достигать 20% [124]. Болезнь распространена по всему миру, однако существуют эндемичные штаммы, характерные для той или иной географической зоны в определенное время.
В последнее время все чаше в литературе встречаются научные статьи по тематике молекулярной эпизоотологии ИБК в мире [25, 137, 138]. Ученым удается определить молекулярно-генетические свойства штаммов вируса ИБК, выделенных еще в 40-х годах прошлого столетия [74].
Диагностика ИБК основана на выделении вируса и определении специфического иммунного ответа серологическими методами. Наиболее часто в лабораторной практике используется вирусовыделение в КЭ, в трахеальной органной культуре (ТОК), в культуре клеток, молекулярно-генетические и серологические методы исследований. Успешная диагностика инфекции зависит от ряда факторов, в том числе от времени отбора проб от момента возникновения болезни, от уровня иммунитета к вирусу в момент заражения, от количества отобранных проб, от вида и качества проб, от генетических особенностей птицы, от способа содержания птицы [82]. Все штаммы вируса ИБК могут быть выделены из дыхательных путей в высоких концентрациях, особенно из трахеи в течение первых 3-5 дней после заражения. Вследствие того, что титр вируса значительно снижается на второй неделе после заражения, обнаружение вируса в этот период времени становится практически невозможным. При хроническом течении ИБК наибольшую диагностическую ценность имеют пробы слепокишечных миндалин и смывы из прямой кишки, нежели пробы респираторных органов [29, 35, 60, 128, 178]. Для повышения эффективности диагностики ИБК в качестве одного из методов рекомендуют использовать восприимчивых индикаторных птиц, содержать которых рекомендуют в течение недели совместно с другими птицами [94].
Прямые методы обнаружения вируса. Вирусовыделение является основным методом диагностики вируса ИБК. Вирус ИБК хорошо размножается в 10-дневных куриных эмбрионах и в высоких титрах накапливается в ЭЭЖ КЭ через 48-60 ч после заражения [16, 101]. При этом чувствительность эмбрионов к одному и тому же вирусу ИБК может быть неодинаковой [68, 157]. Выделение вируса и его серологическую идентификацию довольно успешно проводят также в ТОК [62]. Эта культура не требует предварительной адаптации вируса, но имеет высокую чувствительность. Обычно о положительной реакции судят по замедлению или прекращению двигательной активности реснитчатого эпителия, которое наступает через 3-4 сут после инокуляции, в зависимости от штамма и дозы вируса [8, 59].
Для вирусовыделения ИБК также успешно используют различные культуры клеток, но цитопатическое действие (ЦПД) и бляшки наблюдаются только в первично трипсинизированных тканях эмбрионов кур [91]. Иногда для репликации вируса и проявления ЦПД необходимо провести адаптацию вируса к данной культуре путём проведения нескольких пассажей [116]. Otsuki et al. [144] изучали размножение вируса ИБК в различных типах клеток и клеточных линий, включая первично трипсинизированные клетки почки эмбрионов кур, клетки HeLa, ВНК-21. Ими было показано, что только штаммы Beaudette и Holte вызывают ЦПД в культуре клеток ВНК-21, тогда как подобные изменения в культуре клеток HeLa не выявляются. Другими учеными при изучении патогенеза вируса ИБК удавалось адаптировать его к фибробластам эмбрионов кур, к клеткам эпителия трахеи, к культуре клеток Vero [179].
Определение условий культивирования штамма QX вируса ИБК на куриных эмбрионах
Культивирование вируса ИБК в КЭ проводили по общепринятой методике [20]. Вируссодержащий материал вносили в аллантоисную полость в объеме 0,2см с титром инфекционной активности 1000 ЦД50- После заражения отверстия в скорлупе заливали парафином. Овоскопию зараженных эмбрионов проводили через 24 ч после заражения, затем с интервалом не более 6 ч. Гибель эмбрионов до 24 ч считали неспецифической. Через заданный интервал времени от инфицированных эмбрионов отбирали пробы ЭЭЖ и ХАО для исследований.
Репродуктивную способность вируса ИБК в культурах клеток изучали путем выполнения серийных «слепых» пассажей. Первый пассаж вируса ИБК на всех культурах выполняли материалом, инфекционная активность которого составляла -100 ЦД5о/см3. Для следующих пассажей использовали соответствующие культуральные жидкости. Вируссо держащие материалы вносили на освобожденный от среды клеточный монослой в объеме 0,1см3. Далее инфицированную культуру в течение часа выдерживали в термостате при температуре (37,0 ±0,5)С, после чего удаляли инокулят и вносили поддерживающую среду. Параллельно для каждой клеточной линии проводили контроль на исключение неспецифических дегенеративных изменений. Ежедневно проводили микроскопию всех клеточных культур и оценивали морфологическое состояние клеток.
Для оценки инфекционного титра вируса ИБК в качестве чувствительных тест-объектов использовали исследуемые клеточные культуры, выращенные в виде монослоя на дне пенициллиновых флаконов, ТОК в полистироловых плашках и эмбрионы СПФ-кур. Применяли стандартный метод последовательных разведений, при котором разбавление вирусных материалов проводили на питательной среде или на ФБР.
Инфицирование клеточных культур выполняли путем внесения приготовленных разведений вирусных материалов во флаконы с монослоем или в лунки плашек с ТОК. КЭ инокулировали в аллантоисную полость через перфорированную скорлупу с помощью шприца. Отверстие в скорлупе закрывали стерильным парафином. Учитывали ЦПД в монослое культур клеток, цилиостаз в ТОК, гибель КЭ и другие патологоанатомические проявления. Неспецифической реакцией считали гибель КЭ или ЦПД на культуре или в ТОК в период 24 ч после заражения. Расчет величины инфекционного титра вируса проводили по методу Кербера через 7 сут инкубации.
Для постановки реакции нейтрализации использовали ТОК по методике О.А. Чупиной [8] с небольшими модификациями. В основу РН брали стандартный, классический метод, описанный в Руководстве по вирусологии [20]. Титр вируснейтрализующих антител вычисляли по Керберу на основании полного цилиостаза на ТОК и ЦПД в культуре клеток через 5-6 сут инкубации после инокуляции культуры. Вируснейтрализующую активность сыворотки выражали индексом нейтрализации, который представляет собой разность показателей логарифмов титра вируса в присутствии специфической и нормальной сывороток. Оценкой антигенной «близости» штаммов (по сыворотке или по вирусу) считали соотношение гомо- и гетерологичных индексов, установленное в виде доли инфекционного вируса, который не образовал иммунных комплексов в гетерологичной системе (оценка, обратная стандартной величине "г", характеризующей антигенную близость или "родство").
Оценка патогенных свойств штамма QX Патогенные свойства вируса изучали в острых опытах. Для исследования использовали суточных СПФ-цыплят, серонегативных кур-несушек 180-суточного возраста и серонегативных петушков этого же возраста. Для выявления клинического проявления ИБК птиц осматривали 2 раза в день. Регистрировали и отмечали птиц с депрессией, конъюнктивитами, чиханием и с признаками диспноэ. У павших и подвергшихся диагностическому убою птиц проводили некроскопию. С особым вниманием исследовали трахею, легкие, почки и репродуктивные органы. Патогенные свойства вируса для кур-несушек определяли путем сравнения показателей продуктивности до инфицирования и после инфицирования в течение месяца. По окончании опыта также учитывали результаты патологоанатомического изменения внутренних органов.
Для изучения протективных свойств вакцины для цыплят СПФ-кур против заражения штаммом QX провели ряд опытов. Эффективность вакцинации исследовали по следующим параметрам: клинико-патологоанатомическому проявлению болезни, активности ресничек мерцательного эпителия трахеи, наличию вирусного генома в органах-мишенях с помощью ПЦР.
Цилиарная активность мерцательного эпителия трахеи является одним из критериев оценки патогенности вируса ИБК и защищенности цыплят. С целью определения его активности через 6 сут после инфицирования группу цыплят подвергали эвтаназии и препарировали трахею до бифуркации с минимальным травматизмом. Затем трахею помещали в питательную среду ПСС и с помощью бритвенного лезвия готовили срезы колец трахеи (эксплантаты) по 0,5-1 мм. Использовали следующие оценки: 0 - цилиостаз охватывает менее 1/4 периметра внутренней поверхности трахеи, 0,25 - охват не менее 1/4 периметра, 0,50 - охват не менее 1/2 периметра, 0,75 - охват не менее 3/4 периметра, 1,00-охват более 3/4 периметра. Результирующим показателем цилиостаза в данном образце (CS) являлось среднее значение из п - числа единичных оценок (CS=Dcs/n).
ОТ-ПЦР проводили согласно Методическим указаниям [12]. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента гена S1 вируса ИБК осуществляли по методу Сэнгера с использованием флуоресцентно меченных терминирующих нуклеотидов на автоматическом секвинаторе ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США). Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями референс-штаммов вируса ИБК, опубликованными в международной базе данных GenBank с помощью программы BioEdit, версия 7.0.5.3.
Изучение антигенной «удаленности» штамма QX по отношению к другим штаммам вируса ИБК
При выполнении серологических исследований, задачей которых являлось установление антигенной близости изучаемых штаммов на основе гомо- и гетерологичных индексов нейтрализации, был принят ряд условий, ограничивающих возможное влияние различных неспецифических факторов на результат эксперимента. Принято, что: исходным титром инфекционного вируса данного штамма считать оценку ЦД50, установленную при титровании с 5% нормальной сывороткой кур; иммунные сыворотки в гомо- и гетерологичных реакциях использовать в концентрации 5%; определять гомологичный индекс нейтрализации как соотношение исходного и гомологичного титров данного штамма; гетерологичные индексы нейтрализации определять по сыворотке (при титровании тест-штамма с гетерологичными иммунными сыворотками) и по вирусу (при титровании тест-сыворотки с гетерологичными штаммами вируса); оценкой антигенной удаленности штаммов (по сыворотке или по вирусу) считать соотношение гомо- и гетерологичных индексов нейтрализации, установленное в виде доли инфекционного вируса, который не был нейтрализован в гетерологичной системе (оценка, обратная стандартной величине "г", характеризующей антигенную близость или "родственность"). Принятые обозначения, порядок вычислений первичных данных и производных показателей в виде алгоритма представлен в таблице 4. Таблица 4 - Принятые обозначения, порядок вычислений первичных данных и производных показателей, используемых при установлении антигенной удаленности между штаммами вируса по индексам нейтрализации
Для штаммов QX, HI20, 4/91 и D274 определили исходные титры инфекционного вируса, а также установили оценки остаточной инфекционности в реакциях с гомологичными сыворотками (гомологичные титры) и соответствующие индексы нейтрализации. Результаты приведены в таблице 5.
Из данных таблицы 5 следует, что исходные титры изучаемых штаммов были неодинаковы. Инфекционная активность штамма QX имела существенные различия со всеми остальными материалами (р 0.01). Это обстоятельство, очевидно, определенным образом отразилось и на значениях гомологичных индексов нейтрализации (INhom) Однако следует отметить, что исходная инфекционная активность вируса не была связана с эффективностью гомологичной нейтрализации (Thom.)- Например, установленное для самого активного штамма значение Thom.D274=0,688±0,104
Существенно (р 0,001) Thom.QX=0,063±0,063, соответствующую наименее активному штамму. Таблица 5 - Значения исходных и гомологичных титров вируса, а также оценка гомологичных индексов нейтрализации вируса ИБК штаммов QX, Н120, 4/91 и D2 То. QX-VQXX So Thorn, ox-VQX x SQX lgINhom.OX=lgTo-lgThom.OX
Значения гетерологичных индексов нейтрализации штамма QX, установленные в реакциях с сыворотками SHI20, S4/91, и SD274, И аналогичные оценки, полученные в реакциях сыворотки SQX С гетерологичными штаммами, а также оценки соответствующих показателей их односторонней антигенной удаленности (по сыворотке и по вирусу) представлены в таблицах 6 и 7. Таблица 6 - Значения гетерологичных индексов нейтрализации штамма QX , установленные в реакциях с сыворотками SHI2O? S4/91, и SD27? И оценка соответствующих показателей односторонней антигенной удаленности (l/rs)
Приведенные в таблицах 6 и 7 данные демонстрируют, что все показатели односторонней антигенной удаленности (l/rs и l/rv) штамма QX от исследуемых вариантов вируса ИБК по тесту t=X/m tp o.o5 были значимы. Это свидетельствовало о том, что примененный тип оценок позволял обнаружить и количественно характеризовать искомый эффект антигенных различий. При этом установленные в обеих системах величины 1/г имели определенные различия.
По результатам реакций с гетерологичными сыворотками наибольшая удаленность была установлена для штамма HI20, для которого соответствующий средний показатель составил величину lg(l/rsHi2o) = 3,500. Указанная оценка была достоверно (р 0,01) наибольшей по группе. Также соответствующее штамму Н120 значение lg(l/rv.Hi2o) =5,000 было статистически наибольшим (р 0,01) и в другой системе при дифференциации по вирусу.
Таблица 7 - Значения гетерологичных индексов нейтрализации для SQX , установленные в реакциях со штаммами Унпо? V4/91 и VD274? а также оценки соответствующих показателей односторонней антигенной удаленности (l/rv)
91 и D274 в обеих системах демонстрировали несколько меньшую удаленность от штамма QX. При этом средние оценки lg(l/rs.4/9i)=2,687 и lg(l/rsD274)=2,942, а также lg(l/rv4/9i)=3,583 и lg(l/rvD274)=4,193 были статистически тождественны. Это означало, что степень антигенной близости указанных вариантов вируса ИБК к штамму QX была приближенно одинаковой. Важно отметить, что порядок расположения штаммов по степени удаленности в обеих системах был подобен. Различия использованных систем состояли лишь в масштабах полученных оценок l/rs и l/rv. Это указывало на эквивалентность реакций, происходящих в различных системах. Вероятно, что как антитела, так и вирусный антиген в гетерологичных системах реагировали подобным образом.
Для подтверждения эквивалентности использованных дифференцирующих систем соответственно испытанным штаммам определили средний параметр положения оценок lg(l/rs) и lg(l/rv). С этой целью внутри каждой системы провели ранжирование отмеченных показателей по возрастанию. Таким образом, каждому однократно измеренному значению (х) был присвоен ранг (х— у), характеризующий его параметр положения в данной системе. Далее значения рангов нормировали по общему числу элементов в системе: z=y/(N+l), где: N=En; п - число элементов в одной группе. На этом основании оценка параметра положения приобрела размерность доли (0 z l) и стала независимой от числа элементов в системе (п). После чего для каждого штамма в данной системе определили величину среднего нормированного ранга (Z). Полученные результаты представлены в таблице 8.
Использование теста на цилиостаз и ПЦР для оценки результативности вакцинации (протективного действия) вакцины
Далее исследовали антигенные свойства вируса, адаптированного к культуре клеток RBT. Полученные результаты свидетельствовали, что вирус седьмого пассажа на культуре клеток RBT активно реагировал в РН с сывороткой, имеющей антитела к вирусу ИБК, т.е был нейтрализован специфической сывороткой.
Антигенную чистоту вирусной расплодки подтверждали серологическими методами, при этом исключали присутствие контаминантов, которые могли бы индуцировать антитела у цыплят. С этой целью получали гипериммунные сыворотки от СПФ-цыплят.
Полученную сыворотку исследовали в ИФА и в РТГА с использованием стандартных диагностических наборов для определения антител против вирусов ИБК, ИББ, РЕО, ИЛТ, ИЭП, ССЯ-76, метапневмовируса и M.gallisepticum. Было установлено, что антитела против перечисленных вирусов, а также микоплазм, в сыворотке, полученной на вирус ИБК штамм QX, не регистрировались. Следовательно, предназначенные для экспериментов расплодки вируса ИБК штамм QX контаминантов не содержали.
Вирусы ИБК генотипа QX являются относительно «новыми», недавно появившимися, в настоящее время широко распространёнными в птицеводстве во многих частях мира, вируса ИБК штамм QX был отнесён к генотипу QX на основании генетической структуры, однако другие его свойства были мало исследованы. Таким образом, изучение основных иммунобиологических свойств данного вируса стало предметом следующих исследований.
Задачей следующего этапа работы являлось определение количественных показателей, характеризующих антигенную близость штамма QX по отношению к другим референс-штаммам вируса ИБК, относящимся к разным генетическим группам. В работу были включены штаммы Н120, 4/91, D274 и штамм L1148. В серологических экспериментах по антигенной дифференциации использовали реакцию нейтрализации в варианте постоянной концентрации сыворотки и переменных доз вируса (а-вариант).
Для стандартизации реакции на первом этапе определяли нейтрализующую активность гомологичных сывороток. Испытывали разные концентрации сывороток. Было показано, что наименьшая концентрация антисывороток, при которой в гомологичных реакциях происходила статистически полная нейтрализация инфекционного вируса всех изучаемых штаммов, соответствует 5%. Указанная величина была принята для проведения всех гетерологичных реакций.
Второй этап экспериментов включал в себя проведение реакции перекрестной нейтрализации, где определяли гомо- и гетерологичные индексы нейтрализации. Оценкой антигенной удаленности штаммов (по сыворотке lg(l/rs) или по вирусу lg(l/rv)) считали соотношение гомо- и гереологичных индексов нейтрализации (оценка обратная стандартной величине "г", характеризующей антигенную близость или "родственность"). По результатам реакций с гетерологичными сыворотками наибольшая удаленность была установлена для штамма Н120, для которого соответствующий средний показатель составил величину lg(l/rs.Hi2o) = 3,500. Также соответствующее штамму Н120 значение lg(l/rv.Hi2o) = 5,000 было статистически наибольшим (р 0,01) и в другой системе при дифференциации по вирусу.
Варианты 4/91 и D274 в обеих системах демонстрировали несколько меньшую удаленность от штамма QX. При этом средние оценки lg(l/rs.4/9i)=2,687 и lg(l/rs.D274)=2,942, а также lg(l/rv4/9i)=3,583 и lg(l/rvD274)=4,193 были статистически тождественны. Это означало, что степень антигенной близости указанных вариантов вируса ИБК к штамму QX была приближенно одинаковой.
Важно отметить, что порядок расположения штаммов по степени удаленности в обеих системах был подобен. Различия использованных систем состояли лишь в масштабах полученных оценок l/rs и l/rv. Это указывало на эквивалентность реакций, происходящих в различных системах. Вероятно, что как антитела, так и вирусный антиген в гетерологичных системах реагировали подобным образом.
Далее исследовали возможность антигенной дифференциации генетически близких штаммов QX и L1148. Оценивали гетерологичные индексы нейтрализации (lglNhets) штамма L1148, установленные в реакциях с сыворотками SHI20, S4/91, SD274, И SQX. При постановке реакций в качестве положительного контроля параллельно использовали нормальную сыворотку (So). Полученные результаты продемонстрировали, что средние параметры положения индексов нейтрализации (lgIN), полученных в реакциях сывороток SHI20, S4/91, SD27, И SQX СО штаммами QX и L1148, имели высокий уровень совпадения. Следовательно, реакция каждой использованной иммунной сыворотки с указанными штаммами имела близкую количественную характеристику. В биологическом смысле это могло свидетельствовать об подобии антигенных структур данных штаммов.
Для изучения патогенных свойств вируса ИБК штамм QX был проведен острый опыт на СПФ-цыплятах и взрослой птице. По результатам клинических наблюдений, патологоантомического вскрытия и теста на цилиарную активность было устновлено, что штамм имеет широкий тропизм и поражет многие органы и ткани. Изучаемый штамм патогенен для СПФ-цыплят, вызывая поражение респираторных органов и почек. Он также патогенен и для врослой птицы, вызывая поражение органов репродуктивной системы у несушек и петушков.
На заключительном этапе исследований изучали эффективность вакцинации в отношении изучаемого вируса. Оценка напряженности иммунитета при ИБК является непростой задачей и выполняется комплексно. В качестве методов, позволяющих определить наличие инфекционного процесса после повторного введения вируса в организм птицы, использовали тест на цилиостаз и ПЦР. Многие авторы, в том числе и О.А. Чупина [8], отмечали изменение активности мерцательного эпителия трахеи в результате введения вируса ИБК [55, 62, 72]. На основании анализа показателей цилиостаза на интактных (контрольных) птицах было показано, что штамм QX обладает большей «агрессивностью» для эпителиальных клеток респираторного тракта по сравнению со штаммом HI 20 и в большей степени влиял на состояние чувствительных клеток. Также было установлено, что вакцинация гетерологичным штаммом (HI20) не оказывала существенного влияния на репликацию вируса в эпителиальных клетках респираторного тракта.
Использование молекулярно-биологических способов для оценки иммунитета является перспективным подходом. В соответствии с условиями ОТ-ПЦР-РВ значение Ct (цикл амплификации) находится в обратной зависимости от концентрации исходного генетического материала вируса, что и позволило нам оценить накопление вирусного генома в органах иммунных и неиммунных цыплят. Установили, что у обоих штаммов прогнозируемое накопление вируса в трахее интактных птиц было приближенно равным. В границах ошибки измерений соответствующие величины составили от 2,8 до 3,6 ЭИД5о/0,1 см3. При этом на иммунном фоне ожидаемый инфекционный титр для штамма QX составил приближенно 1,5 ЭИД5о/0,1 см3, тогда как для штамма HI20 средняя прогнозируемая оценка титра имела величину не более 0,16 ЭИД5о/0,1 см3.
На этом основании сделали заключение, что влияние иммунной реакции птицы на развитие вируса штамма QX было менее выражено, чем на репродукцию штамма HI20, и коэффициент указанного соотношения составил величину 1,34 ЭИД5о/0,1 см3.