Введение к работе
1.1. Актуальность темы
Высокопатогенный грипп птиц – высококонтагиозное вирусное генерализованное заболевание птиц, характеризующееся высокой смертностью, сопровождается кровоизлияниями и воспалительными процессами во внутренних органах, мозге и коже, гибель птицы может достигать 100%. Высокопатогенный грипп птиц (ВПГП) относится к болезням, подлежащим обязательному уведомлению Всемирной организации здравоохранения животных [3, 6, 12].
В 2003-2004 гг. резко обострилась ситуация в странах Юго-Восточной Азии и Дальнего Востока в связи с возросшим количеством случаев регистрации вспышек ВПГП подтипа H5N1 среди домашних птиц [9]. В результате эпизоотии ВПГП H5N1 2003-2004 гг. погибло 60 человек, потери среди домашних птиц составили 150 миллионов голов [7]. С начала 2005 г. случаи выявления ВПГП регистрировали в Китае, Тайланде, Вьетнаме, Гонконге, Индонезии и Камбодже [7, 9, 15].
Вирус гриппа (ВГ) подтипа H5N1 является патогенным для широкого круга диких, в том числе водоплавающих птиц [4, 8, 14, 15]. Данный факт был установлен в течение эпизоотии гриппа птиц А/H5N1 в странах юго-восточной части Азии, а затем и Европы в 1996-2007 гг. Особенно масштабной была вспышка ВПГП H5N1 в популяции диких водоплавающих птиц провинции Qinghai (северо-запад Китая) [4]. Вирус генетически близкородственный штаммам, выделенным в северо-западном Китае, вызвал вспышки болезни среди диких и домашних птиц в России в 2005-2007 гг., а так же странах Европы и Африки. [1, 2, 11, 13].
В период с 2008 по 2010 годы на территории Российской Федерации (РФ) спорадически выявляли изоляты вируса ВПГП/H5N1, генетически отличные от изолятов подгруппы Qinghai. При этом в 2009-2010 гг. ВПГП/H5N1 регистрировали только у диких птиц в Республике Тыва.
Следует отметить, что для детального молекулярно-генетического анализа изолятов вируса гриппа птиц (ВГП) необходимо определить полную первичную структуру генома, что является достаточно трудоемким и длительным процессом. Однако далеко не всегда требуется столь детальная генетическая характеристика. При этом, в литературных источниках, посвященных генетическому анализу изолятов ВПГП/H5N1, неоднократно описаны молекулярные детерминанты, определяющие такие важные биологические свойства вируса, как рецепторную специфичность, патогенность для различных видов животных, резистентность к медицинским препаратам, применяемым для профилактики и лечения гриппа в здравоохранении [5, 7, 16, 17].
Тем не менее, до настоящего времени не разработаны методы, позволяющие при проведении эпизоотологического расследования охарактеризовать ключевые свойства исследуемых изолятов ВГП в достаточно сжатые сроки, без проведения полного сиквенса генома изолята. Такая экспресс-характеристика «полевых» штаммов ВГП позволит своевременно корректировать планы противоэпизоотических мероприятий и избежать необоснованных финансовых расходов, что особенно важно в условиях рыночной экономики.
Для осуществления молекулярно-генетической характеристики целесообразно разработать и применять на практике методы по определению первичной структуры генома исследуемых изолятов ВГП, а также определению нуклеотидных последовательностей фрагментов генов (PB2, H, N, M, NS), включающих генетические маркеры, обуславливающие биологические свойства изолятов вируса ВПГП A/H5N1, выделенных на территории РФ в последние годы (2005-2010 гг.). В зависимости от поставленной задачи, использование данных методов позволит с максимальной степенью эффективности охарактеризовать молекулярно-генетические свойства исследуемых изолятов вируса ВПГП/H5N1.
1.2. Степень разработанности проблемы.
В результате многочисленных исследований установлено, что генетические маркеры, влияющие на биологические свойства изолятов вируса ВПГП A/H5N1, выделенных на территории РФ в последние годы определены нуклеотидными последовательностями генов PB2, H, N, M и NS.
Всемирной организацией здравоохранения животных рекомендованы к применению в диагностической практике утвержденные и соответствующие ее стандартам протоколы ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ, позволяющие быстро выявить и идентифицировать ВГП [12]. Среди них указаны несколько систем для индикации ВГП с праймерами на ген М, а также системы идентификации различных подтипов, особенно H5, H7.
В то же время определение полных нуклеотидных последовательностей генома изолятов ВГП и их детальная молекулярно-генетическая характеристика являются приоритетными задачами для референтных лабораторий, осуществляющих диагностику ГП. Кроме того, для обеспечения возможности принятия своевременных мер по профилактике и ликвидации ГП необходимо на основании данных о молекулярных детерминантах определяющих биологические свойства ВГП разрабатывать методы, позволяющие делать прогнозы развития эпизоотической ситуации.
1.3. Цели и задачи исследований
Изучить молекулярно-генетические свойства вирусов гриппа птиц, выделенных на территории РФ, с помощью оптимизированного метода определения первичной структуры генома и разработать метод определения молекулярных детерминант патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса гриппа.
В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:
- оптимизировать метод определения первичной структуры генома изолятов ВГП/H5N1 генетической подгруппы Qinghai на основе ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования;
- определить полные нуклеотидные последовательности генома изолятов ВГП/H5N1, выделенных в 2005-2006 гг. и изучить их молекулярно-генетические свойства;
- осуществить сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генома изолятов вируса ВПГП/H5N1, выделенных в 2008-2010 гг. в России, с таковыми изолятов ВГП подтипа H5N1, выявленных и выделенных в странах Евразии в течение 2008-2011 гг.
- разработать метод, позволяющий охарактеризовать молекулярные детерминанты патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса ВПГП A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования.
1.4. Научная новизна исследований
Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома 5 изолятов ВГП/H5N1, выделенных на территории РФ в течение 2005-2006 гг., и изучены их молекулярно-генетические свойства.
Оптимизирован метод определения первичной структуры генома изолятов ВГП/H5N1 генетической подгруппы Qinghai на основе ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования.
Разработан метод определения молекулярных маркеров патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса ВПГП A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования с оригинальной системой праймеров.
1.5. Практическая значимость работы
Получены малекулярно-генетические характеристики 5 изолятов вируса гриппа птиц, выделенных на территории Российской Федерации.
Разработаны «Методические положения по определению первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 генетической подгруппы Qinghai c помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования», которые утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 19.01.2012 г.
Разработаны «Методические положения по определению молекулярных детерминант патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования», которые утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 19.01.2012 г.
1.6. Соответствие диссертации паспорту научной специальности
В соответствии с формулой специальность 06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» представляет собой область науки, изучающая систематику, структуру, физиологию, биохимию, генетику, экологию патогенных микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов), имеющих ветеринарное значение, эпизоотологические и экологические закономерности возникновения, распространения инфекционных болезней и иммунологию сельскохозяйственных, домашних и диких животных, изучающая и разрабатывающая методы, средства и организационные основы диагностики, лечения, профилактики и ликвидации этих болезней. В диссертационной работе приведены результаты исследований по разработке методов определения полных нуклеотидных последовательностей изолятов вируса ВПГП/H5N1, а также генетических маркеров, обуславливающих биологические свойства вируса, на основе ПЦР, их применению в лабораторной диагностике болезни, а также изучению молекулярно-биологических свойств изолятов ВГП.
Результаты научного исследования соответствуют пунктам 1, 4, 5 паспорта специальности.
1.7. Апробация результатов работы
Результаты исследований по теме диссертации заслушаны и обсуждены на заседаниях учёного совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2008-2011 гг. Основные материалы диссертации были опубликованы и доложены на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010» (г. Москва, 2010 г.), Международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых – в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2010 г.).
1.8. Публикации научных исследований
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 2 работы опубликованы в изданиях, включенных в перечень ВАК РФ.
1.9. Основные положения, выносимые на защиту:
Метод определения первичной структуры генома изолятов ВГП/H5N1 генетической подгруппы Qinghai на основе ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования, позволяющий сократить количество амплифицируемых фрагментов генома.
Первичная структура генома изолятов ВГП/H5N1 генетической подгруппы Qinghai, выделенных в РФ в 2005-2006 гг.
Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генома изолятов вируса ВПГП/H5N1, выделенных в 2008-2010 гг. в России, с таковыми изолятов ВГП подтипа H5N1, выявленных и выделенных в странах Евразии в течение 2008-2011 гг.
Метод определения молекулярных маркеров патогенности и рецепторной специфичности изолятов вируса ВПГП A/H5N1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования, позволяющий охарактеризовать ряд молекулярно-генетических свойств вируса данного подтипа в сжатые сроки.
1.10. Структура и объем диссертации
Похожие диссертации на Изучение первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1, выделенных на территории Российской Федерации
