Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Этиология и патогенез ассоциативного урогенитального микоплазмоза собак 10
1.1.1 Этиологическая роль микоплазм в заболеваниях урогенитального тракта у собак 10
1.1.2 Этиологическая роль ассоциаций микоплазм с другими микроорганизмами 15
1.1.3 Пути заражения, клиническая картина ассоциативного урогенитального микоплазмоза собак 19
1.2 Индикация микоплазм из урогенитального тракта собак 25
1.2.1 Микробиологические методы 25
1.2.2 Молекулярно-биологические методы 28
1.3 Средства и методы лечения урогенитального микоплазмоза собак 31
1.3.1 Лечение урогенитальной микоплазменной инфекции 31
1.3.2 Применение гомеопатических препаратов в лечении урогенитальной микоплазменной инфекции 36
2. Собственные исследования 44
2.1 Материалы и методы 44
2.2 Результаты собственных исследований 50
2.2.1 Распространение урогенитальной инфекции у собак в условиях города Новосибирска 50
2.2.1.1 Клинико-эпизоотологические особенности проявления урогенитальной инфекции у собак 50
2.2.1.2 Микробиоценоз урогенитального тракта собак при эндометритах 52
2.2.1.3 Микробиологическое исследование биоматериала собак на микоплазмоз 56
2.2.1.4 Индикация микоплазм из биоматериала от собак методом ПНР
2.2.2 Терапия при урогенитальном микоплазмозе собак с применением антибактериального и гомеопатического препаратов 64
2.2.2.1 Оценка влияния гомеопатических средств на опсонофагоцитарную реакцию (ОФР) нейтрофилов 64
2.2.2.2 Оценка токсических характеристик препарата Оваринин
2.2.2.2.1 Изучение острой токсичности препарата Оваринин 68
2.2.2.2.2 Изучение пирогенных свойств препарата Оваринин 69
2.2.2.2.3 Изучение раздражающего и сенсибилизирующего действия препарата Оваринин 70
2.2.2.2.4 Изучение местного действия препарата Оваринин на слизистые оболочки (конъюнктиву)
2.2.2.3 Клинико-терапевтическая эффективность различных схем лечения собак при урогенитальном микоплазмозе 72
2.2.2.4 Влияние схем лечения на гематологические показатели 75
2.2.2.5 Влияние схем лечения на биохимические показатели крови 79
2.2.2.6 Контроль эффективности различных схем лечения собак микробиологическими и молекулярно-биологическими исследованиями 81
2.2.2.7 Испытание разработанной схемы лечения при микоплазмозе собак с применением энроксила и оваринина в производственных условиях 84
2.3 Обсуждение результатов 85
Заключение 96
Список принятых сокращений 99
Список литературы
- Этиологическая роль ассоциаций микоплазм с другими микроорганизмами
- Средства и методы лечения урогенитального микоплазмоза собак
- Индикация микоплазм из биоматериала от собак методом ПНР
- Влияние схем лечения на биохимические показатели крови
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Болезни репродуктивной системы мелких домашних животных составляют около 20% от общего числа заболеваний, причем за последние годы частота встречаемости заболеваний половых органов увеличивается (Н.С. Емельянова, 2005). Одними из часто встречающихся акушерско-гинекологических заболеваний у животных являются эндометриты.
Вопросы этиопатогенеза эндометритов остаются до настоящего времени дискуссионными. Существует, в частности, мнение (В.Э. Аллен, 2006), что микрофлора в патогенезе эндометрита существенной роли не играет. Другие же авторы, напротив, решающую роль отводят интрацервикальной экзогенной микробной контаминации полости матки (Н.И. Осипова, 2006; А.В. Шафикова, 2006; Н.С. Емельянова, 2007; Н.В. Гарнцева, 2009).
На фоне выявления при бактериологическом исследовании биоматериала из урогенитального тракта собак микроорганизмов родов Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Proteus, Pseudomonas, Esherichia значительно участились случаи заболеваний микоплазменной этиологии, имеющих как клинически выраженное, так и бессимптомное течение, с нередкими рецидивами, способствующими появлению различных осложнений (А.П. Красиков, 2005; С.А. Пензурова, 2012).
Высокую распространенность микоплазм в популяции животных отмечают многие исследователи (Я.Р. Коваленко, 1980; Г.Ф. Коромыслов, 1987; Н.Н. Новикова, 2002; Е.В. Медова, 2004; А.П. Красиков, 2005; Н.И. Осипова, 2006; В.В. Сочнев, 2006; О.М. Параева, 2007; Н.В. Литвинов, 2008 и др.).
Однако, несмотря на актуальность проблемы, диагностика урогенитального микоплазмоза собак в ряде регионов, в том числе в г. Новосибирске, остается недостаточной. Практический ветеринарный опыт довольно часто показывает низкую эффективность лечения собак при урогенитальных инфекциях, что можно объяснить недостаточной изученностью микробиоценозов их урогенитального тракта.
Известно, что микоплазмозная инфекция характерна для животных с ослабленным иммунитетом и иммуносупрессией. При правильном подборе антибиотиков болезнь можно подавить, но антибиотикотерапия, приводящая к исчезновению ее клинических признаков, не всегда способствует элиминации возбудителя из организма, а лишь обеспечивает переход острой формы заболевания в латентную (Г.М. Бондаренко, 2013).
В связи с отсутствием у микоплазм клеточной стенки, ряд антибактериальных препаратов неактивен в отношении их. Микоплазмы абсолютно нечувствительны к цефалоспоринам и пенициллинам. В отношении микоплазм неактивны рифампин, полимиксин, гликопептиды и сульфаниламиды (С.Г. Брагина, 2001; Е.Н. Падейская, 2004).
Однако, некоторые имеющиеся в литературе данные об устойчивости микоплазм к антибиотикам носят противоречивый характер. С одной стороны, тетрациклины, фторхинолоны и макролиды в опытах in vitro оказывают выра-
женное ингибирующее действие на клетки микоплазм, с другой - применение этих же антибиотиков для лечения животных при микоплазмозах часто оказывается малоэффективным: микоплазмы по сравнению с другими микроорганизмами особенно быстро приобретают устойчивость и угнетают иммунную систему (О.Г. Карпухина, 2004).
В этой связи вызывают интерес исследования по изучению возможности излечения животных от микоплазмозов гомеопатическими препаратами. В отличие от антибиотикотерапии, при гомеотерапии исчезновение симптомов может рассматриваться как обнадеживающий признак, ибо излечение при этом способе достигается исключительно посредством настройки иммунной системы против возбудителя, то есть, предполагает эффективный иммунный ответ (В.Н. Бочкарев, 2006). Однако, следует заметить, что фиброзные новообразования в пораженных микоплазмами тканях препятствуют проникновению в них не только антибиотиков, но и всяких других достаточно массивных молекул, в том числе, и молекул специфических иммуноглобулинов, реализующих гуморальный противомикоплазменный иммунитет, который, собственно, и запускается посредством гомеотерапии (В.А. Крамарский, 2004; М.Б. Славецкая, 2006; Н.А. Кочуева, 2007; Л.А. Луткова, 2009).
Степень разработанности темы. В настоящее время проблеме урогени-тального микоплазмоза животных уделено большое внимание. Современная научная информация, представленная монографическими изданиями: «Семейство микоплазм и Л-формы бактерий» (В.Д. Тимаков, Г.Я. Каган, 1967), «Ми-коплазмозы животных» (Я.Р. Коваленко, 1976; Г.А. Грошева, 1982; С.Н. Борх-сениус, 2002) свидетельствует о широком распространении микоплазм в природе, подчеркивает их значение в патологии людей и животных. Вместе с тем обзор научной литературы показывает, что многие вопросы этиологии, патогенеза и диагностики различных патологических процессов, связанных с микоплазмами, остаются не решенными, что оставляет микоплазмозы в числе актуальных проблем современной патологии животных, требующих дальнейшего изучения.
Несмотря на большое разнообразие ветеринарных препаратов для лечения и профилактики болезней животных, не всегда удается подобрать эффективный препарат для лечения животных с заболеваниями органов мочеполовой системы. Поэтому разработка и внедрение в практику лечения животных гомеопатических препаратов, является актуальной задачей (В.А. Дроздник, 2009).
Цель и задачи исследования. Целью исследования является изучение клинико-эпизоотологических и микробиологических особенностей проявления урогенитальной инфекции с участием микоплазм у собак в условиях г. Новосибирска и разработка эффективных средств и методов лечения.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Выявить клинико-эпизоотологические особенности проявления болезней с поражением репродуктивной системы у собак в условиях г. Новосибирска.
-
Изучить микробиоценоз урогенитального тракта собак при эндометритах, определить чувствительность выявленных микроорганизмов к различным антибактериальным препаратам.
-
Определить уровень носительства у собак микоплазм, уреаплазм.
-
Оценить влияние различных гомеопатических средств на показатели опсонофагоцитарной реакции (ОФР) нейтрофилов in vitro и на основе полученных результатов обосновать состав их рациональной композиции в качестве гомеопатического препарата, обеспечивающего активизацию иммунитета.
-
Изучить эффективность схем лечения собак при урогенитальном мико-плазмозе собак с использованием гомеопатического препарата.
Научная новизна. Впервые изучено распространение хронического эндометрита среди собак, содержащихся в питомниках и принадлежащих частным владельцам г. Новосибирска, определена этиологическая роль микоплазм и уреоплазм.
Установлено in vitro влияние на показатели опсонофагоцитарной реакции нейтрофилов животных различных гомеопатических средств; на этой основе обоснована их рациональная композиция в качестве препарата Оваринин, обеспечивающего активацию иммунитета. Изучены токсикологические характеристики гомеопатического препарата Оваринин.
Доказана эффективность сочетанного применения антибактериального и гомеопатического препаратов для лечения собак при урогенитальном мико-плазмозе.
Получен патент РФ «Способ лечения урогенитального микоплазмоза собак» № 2557955 (заявка № 2014131218 от 28.07.2014 г.).
Теоретическая и практическая значимость. Выявлен высокий уровень носительства среди собак микоплазм и уреаплазм, взаимосвязанного с клиническими признаками эндометритов.
Доказаны роль гомеопатического препарата Оваринин в активации иммунитета, отсутствие его токсичности, эффективность его использования в схеме лечения собак при урогенитальном микоплазмозе.
Результаты исследований внедрены в питомнике «Зональный центр кинологической службы ГУ МВД России по Новосибирской области» и в ветеринарной клинике «Болезни мелких домашних животных» Новосибирского государственного аграрного университета.
Результаты исследований используются в учебном процессе на факультете ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет», на кафедре анатомии, физиологии и микробиологии ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия», на кафедре микробиологии, эпизоотологии, паразитологии и ветсанэкспертизы ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный аграрный университет», на кафедре ветеринарной микробиологии, инфекционных и инвазионных болезней ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина.
Методология и методы исследования. Проведен анализ специальной литературы по проблеме урогенитального микоплазмоза собак, представленной
в отечественных и зарубежных источниках. В работе использованы клинические, микробиологические, токсикологические, гематологические методы исследований. По результатам исследований предложена рациональная схема лечения собак при урогенитальном микоплазмозе. Материалы исследований обработаны методом вариационной статистики с определением критерия достоверности по Стьюденту (Г.Ф. Лакин, 1990). Статистическую обработку данных производили в программе Microsoft Office Excel 2010. Основные положения, выносимые на защиту
-
Результаты изучения клинико-эпизоотологических и микробиологических особенностей проявления урогенитальной инфекции с участием мико-плазм у собак.
-
Влияние различных гомеопатических средств на показатели опсонофа-гоцитарной реакции (ОФР) нейтрофилов in vitro, обоснование состава их рациональной композиции в качестве безвредного гомеопатического препарата Оваринина, обеспечивающего активацию иммунитета.
3. Терапевтическая эффективность сочетанного применения антибактери
ального и гомеопатического препаратов при урогенитальном микоплазмозе у собак.
Степень достоверности и апробация работы. Достоверность результатов подтверждается объемом микробиологических исследований, проведенных с 2011 по 2014 г., а также статистической обработкой данных. Исследования подтверждены актами о проделанных работах.
Основные материалы работы доложены и обсуждены на XII Сибирской ветеринарной конференции «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (г. Новосибирск, 2013), Всероссийской научно-практической конференции «Молодежь в Аграрной науке и образовании - инновационный потенциал будущего» (г. Новосибирск, 2013), заседаниях научно-методического совета факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет» в 2011-2014 гг.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ (Вестник НГАУ, Вестник Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина) и 1 патент РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице компьютерного текста и включает в себя введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа содержит 21 таблицу и иллюстрирована 10 рисунками. Список литературы включает 206 источников, в том числе 165 отечественных и 41 иностранных авторов.
Этиологическая роль ассоциаций микоплазм с другими микроорганизмами
Животный мир - важная составная часть природной среды. Забота о нем служит основой его разумного использования. Зная особенности отдельных видов, их роль в природе, человек может охранять полезных ему животных, способствовать увеличению их численности, ограничивать размножение вредителей сельского хозяйства, переносчиков и возбудителей болезней. В нашей стране заботе о животном мире придается важное государственное значение.
В настоящее время собаководство становится важной отраслью, позволяющей стабилизировать негативные последствия техногенного процесса на человеческое общество. Поэтому во всем мире резко увеличилось количество собак на душу населения. Одновременно возросло и число собак с различными заболеваниями. Одной из основных причин, тормозящих развитие собаководства, являются акушерско-гинекологические заболевания (Н.А. Кочуева, 2008).
Последнее время внимание ветеринарных специалистов заострилось на проблеме микоплазмоза, как основного на данный момент заболевания, вызывающего эндометриты и бесплодие у производителей.
Микоплазмы - лишенные клеточной стенки прокариоты, объединённые в класс Mollicutes (С.Н. Борхсениус и др., 2002). Первые данные о выделении микоплазм относятся к 1898 г., когда французские ученые Nocard et al. открыли возбудителя воспаления легких крупного рогатого скота - плевропневмонии и возбудителя назвали плевропневмониеподобным микроорганизмом (PPLO). Подобные микроорганизмы были изолированы позднее от овец, коз и других видов животных (Г.Ф. Коромыслов и др., 1987).
По мнению специалистов-исследователей микоплазмы являются выжившей ветвью примитивных микроорганизмов, из которых впоследствии произошли прокариоты и эукариоты. Они появились как продукт прогрессивной эволюции еще до образования присущей бактериям клеточной стенки (С.Н. Борхсениус, 2002; В. Bhugra, 1992).
В девятом издании Определителя бактерий Берджи микоплазмы отнесены к отделу Tenericutes , классу Mollicutes , порядку Mycoplasmatales (от греч. ту се -гриб; plasma - плазма), семейству Mycoplasmataceae, роду Mycoplasma, Ureaplasma.
Согласно классической микробиологической классификации, одобренной Таксономическим комитетом при Международной организации микоплазмологов, в классе Mollicutes насчитывают 8 родов: Mycoplasma, Ureaplasma, Acholeplasma, Entomoplasma, Mesoplasma, Spiroplasma, Anaeroplasma, Asteroplasma (С.Н. Борхсениус, 2002). Согласно данным источников (V.J. Chalker, 2005), от собак выделено и идентифицировано 16 видов мико плазм, а именно 14 видов рода Mycoplasma, 1 вид рода Acholeplasma и 1 вид рода Ureaplasma.
Микоплазмы широко распространены в природе, и отдельные виды могут быть патогенными как для растений, так и для человека или теплокровных животных (СВ. Прозоровский, 1995).
Большинство молликутов - симбионты и факультативные паразиты растений и животных, подобно хламидиям, риккетсиям, бартонеллам и вирусам. Но в отличие от упомянутых микроорганизмов предпочитают населять не ядро или цитоплазму, а клеточные мембраны, располагаясь на их поверхностях, углубляясь в них или даже "сливаясь" с ними.
Уникальными для прокариот особенностями микоплазм являются: отсутствие клеточной стенки и ее предшественников (что в биофизическом плане сближает их с L-формами бактерий) (В.Д. Тимаков, 1973), вместо клеточной стенки они имеют трехслойную мембрану, цитоплазму с ядерной субстанцией, гранулами и вакуолями.
Одной из особенностей микоплазм является их способность персистировать in vivo в течение длительного периода, без каких - либо клинических проявлений. Такая способность микоплазм обусловлена рядом особенностей, которые позволяют им эффективно «ускользать» от иммунной системы хозяина. Для микоплазм свойственна молекулярная мимикрия и фенотипическая пластичность, которые приводят к тому, что микоплазмы не эффективно распознаются и элиминируются иммунной системой хозяина. Это позволяет микоплазмам сохраняться в организме хозяина в течение длительного времени, что часто может являться причиной хронических заболеваний (S. Razin, 1998).
Из-за сложности идентификации вида микоплазм в большинстве публикаций просто сообщается о присутствии в исследованных образцах представителей рода Mycoplasma. На основании немногих исследований, в которых определялся вид микоплазм, принято считать, что с респираторными болезнями собак связана М. cynos, а с инфекциями урогенитального тракта — М. canis (V.J. Chalker, 2005). Mycoplasma canis была изолирована впервые в Великобритании в 1995 г. от телят, число изолятов Mycoplasma canis в 1999 г. составила 18% от всех изолированных микоплазм (R.D. Ayling, S.E. Bashiruddin, R.A. Nicholas, 2004). Другие исследователи (S. Rosendal, 1973; P.A. Doig, 1981) предполагают, что у собак из урогенитального тракта выделяют патогенные микроорганизмы М. Canis (PG 14), М. cynos (Н 754, Н 432, Н 242, Н 442, Н 713), которые являются глюкозоферментирующими. Также они предполагают, что Mycoplasma canis наиболее чаще (в 58,2% случаях) выделяется при микробиологическом исследовании урогенитальной слизи, чем М. spumans (в 26,95% случаях), М. maculosum (в 25,4% случаях), М. edwardii (в 19,4% случаях), М. cynos (14,9%). Также М. Canis изолировали от собак в Норвегии (Т.М. L Abee-Lund, 2003) с клиническими симптомами болезни урогенитального тракта, такими как хронический гнойный эпидидимит, хронический простатит, цистит. Микоплазмы выделяли как в чистой культуре, так и в ассоциациях. Основное свойство любого инфекционного агента - патогенность (потенциальная способность микроорганизма вызывать инфекционный процесс у хозяина) - обусловлена присутствием генов, определяющих образование факторов вирулентности. Эти факторы обеспечивают адгезию, адаптацию, колонизацию, подавление защитных сил хозяина и персистенцию микроорганизма в макроорганизме, образование токсинов, ферментов, метаболитов и других соединений, оказывающих неблагоприятное воздействие на клетки-мишени и нарушающих нормальные регуляторные механизмы макроорганизма и переход к новому хозяину. Материальные носители патогенности называются факторами патогенности. У бактерий к ним относят адгезины, инвазины, агрессины, экзотоксины, эндотоксины, ферменты-токсины, аллергены и др. (С.Н. Борхсениус, 2002; Ю.И. Лященко, 2003; Б.Т. Стегний, 2005).
Средства и методы лечения урогенитального микоплазмоза собак
Забор проб слизи осуществляли у 165 собак с помощью ложки Фолькмана. Материал помещали в стерильные пробирки, в 1,0 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Забор крови проводили, используя вакуумные пробирки Improvacuter для in vitro диагностики.
Для выявления микоплазм и уреаплазм в материале из урогенитального тракта использовали прямой микробиологический посев на специальные селективные жидкие питательные среды: «Среда для индикации уреаплазм»; «Среда для индикации аргининферментирующих микоплазм» и «Среда для индикации глюкозоферментирующих микоплазм» (производство НИИ природно-очаговых инфекций г. Омск). Бактериологический метод диагностики (цветная реакция) основан на расщеплении мочевины, необходимой для роста микоплазм и уреаплазм, изменении рН и, как следствие, изменении цвета среды, в которую добавлен индикатор. Пробирки с исследуемыми пробами помещали в термостат при температуре 37±1 С. Учет результатов проводили через 72 часа. Положительную реакцию наблюдали при появлении зеленой окраски среды в пробирке с исследуемой пробой на наличие уреаплазм, при появлении желтой окраски среды в пробирке с исследуемой пробой на наличие глюкозоферментирующих микоплазм, при появлении зеленой окраски среды в пробирке с исследуемой пробой на наличие аргининферментирующих микоплазм.
Для микроскопического исследования проб готовили нативные препараты, которые в дальнейшем окрашивали по Граму. Морфологию микроорганизмов изучали с помощью светового микроскопа при 1000 кратном увеличении.
Биохимический анализ крови проводили в лаборатории ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии, используя биохимический анализатор «StatFax 1904+» ISO 9001 (Awarenes, США) с использованием биохимических наборов «Spinreact» ISO 9001 (Испания). При биохимическом исследовании крови определяли показатели белка, креатинина, ACT, АЛТ, билирубина, мочевины.
Морфологический анализ крови проводили в лаборатории ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии, используя гематологический анализатор «Mindray ВС-2800 Vet» для количественного определения 18 основных параметров: лейкоциты (WBC), лимфоциты (Lymph#), моноциты (Mon#), гранулоциты (Gran#), процент лимфоцитов (Lymph%), процент моноцитов (Моп%), процент гранулоцитов (Gran%), эритроциты (RBC), концентрация гемоглобина (HGB), средний объем эритроцита (MCV), среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН), средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС), ширина распределения эритроцитов (RDW), гематокрит (НСТ), тромбоциты (PLT), средний объем тромбоцита (MPV), ширина распределения тромбоцитов (PDW), тромбокрит (РСТ).
ПЦР-диагностику 100 проб вагинальной слизи проводили в лаборатории молекулярной диагностики. Были использованы тест-системы для выявления возбудителей микоплазмоза методом полимеразной цепной реакции ПЦР-комплект МИК-КОМ (Москва), комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала «АмплиПрайм ДНК-сорб-В». В работе применялся классический метод ПЦР с детекцией в агарозном геле.
Учет результатов проводили электрофоретическим методом по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфической полосы амплифицированной ДНК, начиная с результатов амплификации положительных и отрицательных контролей. В качестве отрицательного контроля (К-) вместо ДНК-пробы вносили в пробирку 10 мкл ДНК-буфера, в качестве положительного контроля (К+) вносили в пробирку 10 мкл ДНК микоплазмы.
Исследование чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам проводили методом диффузии в агар с использованием стандартных дисков в соответствии с методическими указаниями «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (2004). Для определения чувствительности микроорганизмов использовались диски с 15 антибиотиками: оксациллином, цефуроксимом, цефазолином, эритромицином, линкомицином, ципрофлоксацином, энрофлоксацином, гентамицином, неомицином, ванкомицином, тетрациклином, доксициклином, рифампицином, меропенемом, амикацином. Оценку влияния гомеопатических средств на опсонофагоцитарную реакцию (ОФР) нейтрофилов in vitro проводили согласно методике «Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных» (2003), включающей изучение фагоцитирущей активности нейтрофилов (ФА), фагоцитарного числа (ФЧ), фагоцитарного индекса (ФИ). Для исследований были использованы готовые формы лекарственных веществ (ГОСТ 7060-79) производство ООО «ГМСЦ» г. Новосибирск.
В экспериментах использовали фармокопейные разведения веществ, применяемых в сверхнизких концентрациях: D3 - 10" г/мл; С6 - 10" г/мл; С12 -10" г/мл.
Для изучения влияния гомеопатических лекарственных средств на показатели ОФР нейтрофилов in vitro использовали лейкоцитарную взвесь в объеме 1мл, к которой добавляли 0,25 мл препаратов Sepia С6, Thuja D3, Thuja С12, Secale cornutum C6, Platina C6, Lilium tigrinum C12, Creosotum C30, а также композицию из различных гомеопатических средств (Оваринин). Разработанный в ГНУ ИЭВСиДВ образец гомеопатического препарата Оваринин для лечения акушерско-гинекологических заболеваний животных содержит стерильные водные растворы Apis mellifelica С12, Pulsatilla pratensis C30, Sulfur C200, Sepia C6, Creazotum C30, Lachesis C12, взятые в равных соотношениях.
Пробирки помещали в термостат на 3 часа при Т = 37 С. Затем вносили взвесь микробных тел референтного штамма Staphylococcus albus № 182 по 0,25 мл, содержащую 1 млрд. КОЕ/ 1 мл. Пробирки помещали в термостат на 1 час при Т = 37 С. После инкубации мазки крови фиксировали в течение 3 мин и окрашивали в течение 10 мин фиксатором-красителем эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду. В контрольных группах были использованы индифферентные вещества - лактоза и 0,85%-ный водный раствор NaCl. Первая контрольная группа включала в себя 1 крупинку, вторая контрольная группа -0,85%-ный водный раствор NaCl, третья контрольная группа - плацебо-контроль.
Индикация микоплазм из биоматериала от собак методом ПНР
Анализируя результаты воспроизводства собак, можно отметить, что в контрольной группе из 4 собак (44,4 %), пришедших в половую охоту, у 2 собак выявлялись микоплазмы после лечения, оплодотворение у данных собак не происходило. У 2 собак щенных отмечалась полная элиминация микоплазм.
В 1-ой опытной группе все собаки, ранее бесплодные, пришли в половую охоту. Микоплазмы были выявлены у 1 собаки (14,3%). Из них 5 собак (71,4%) стали щенными, у которых отмечалась полная элиминация микоплазм.
Во 2-ой опытной группе 7 собак, ранее бесплодных, пришли в половую охоту, при этом у всех отмечалась элиминация микоплазм. Из них 6 собак (85,7%) стали щенными.
Таким образом, анализируя результаты микробиологического исследования урогенитальной слизи собак после применения различных схем лечения, отмечено, что самой эффективной оказалась схема с применением антибактериального препарата фторхинолонового ряда Энроксил в сочетании с гомеопатическим препаратом Оваринин в дозе 0,1 мл/кг.
Испытание разработанной схемы лечения при микоплазмозе собак с применением энроксила и оваринина в производственных условиях
Терапевтическую эффективность разработанной схемы лечения с применением препаратов Энроксил и Оваринин при эндометритах изучали в 2013-2014 гг. в клинике «Болезни мелких домашних животных» НГАУ на 70 собаках.
Собакам опытной группы для лечения применяли Энроксил подкожно в дозе 0,1 мл/кг 1 раз в сутки ежедневно, 7 дней и Оваринин внутримышечно в дозе 0,1 мл/кг 1 раз в 4 дня.
Собак контрольной группы лечили традиционными средствами. Традиционная схема включала препараты Кобактан, Оксилат, Гамавит.
Результаты исследований представлены в таблице 21. Таблица 21 - Терапевтическая эффективность сочетанного применения препаратов Энроксил и Оваринин при лечении эндометритов у собак в ветеринарной клинике
Проведенные исследования показали, что препараты Энроксил и Оваринин обладают высокой терапевтической эффективностью при лечении собак, больных эндометритом, вызванным микоплазмами.
В контрольной группе выздоровление наступило у 88,6% собак за 8,8±0,2 суток. В опытной группе выздоровление наступило у 97,1% собак за 6,3±0,2 суток.
Таким образом, терапевтическая эффективность испытуемых препаратов в клинике выше средств традиционной терапии на 8,5%. При этом сроки выздоровления сокращаются на 2,5 суток (28,4%).
Племенное разведение собак весьма актуально в настоящее время. Внимание ветврачей и заводчиков обращено к проблеме микоплазмоза, как основного на данный момент заболевания, вызывающего эндометриты и бесплодие у собак - производителей.
По мнению многих авторов (А.П. Красиков, 2008; А.В. Спрыгин, 2010) эффективность мероприятий по борьбе с инфекционными заболеваниями во многом зависит от своевременного выявления возбудителя. Диагноз основывается на данных клинического наблюдения и на результатах лабораторных исследований. Этиологическую роль микоплазм в возникновении воспалительных заболеваний урогенитального тракта доказывают многие ученые (В.Н. Прилепская, 1998; М.А. Гомберг, 2009; Н.И. Потатуркина-Нестерова, 2012; И.В. Раковская, 2013; D. Taylor-Robinson, 1983; S.S. Jang, 1984).
Так как мелкие домашние животные находятся в наиболее тесном контакте с человеком, существует реальная угроза передачи возбудителя от животного человеку. Аналогичные поражения мочеполового тракта отмечаются и у человека, при этом специфическим возбудителем является микоплазмы и уреаплазмы (Н.Н. Новикова, 2002).
Ряд исследователей (B.C. Слугин,1984; В.Н. Сюрин, 1998; В.В. Сочнев, 1998) рассматривают диагностику как основу организации противоэпизоотических мероприятий, позволяющих проводить рациональную и эффективную терапию и прогнозировать дальнейшее течение и исход болезней.
Большинство исследователей считают, что профилактику и борьбу с такими инфекциями собак, как микоплазмоз и уреаплазмоз следует проводить комплексно, на основе изучения их эпизоотического процесса, на основе безошибочной диагностики с использованием как традиционных, классических методов, так и новых, более совершенных (Г.В. Зоткин, 2002; Е.В. Медова, 2004; А.А. Алиев, 2005; Е.А. Грачева, 2006 и др.).
В результате проведенных нами исследований было изучено распространение урогенитального микоплазмоза среди собак в условиях города Новосибирска.
Клинико-эпизоотологическое исследование показало, что у 59,9% исследуемых собак наблюдаются признаки урогенитальной инфекции, осложненной синдромами эндометритов и бесплодия.
Наибольший процент встречаемости заболевания наблюдался у спаниелей (14,6%), немецких овчарок (8,1%), лаек (3,9%). Наибольший процент (69,2%) составили собаки с признаками эндометритов возрастом от 2 до 6 лет, что свидетельствуют о более частой встречаемости болезни в репродуктивном возрасте. Эпизоотическое проявление заболеваний урогенитальной микоплазменной инфекцией отмечалось круглогодично с пиками в марте и сентябре. В марте -155,8% и в сентябре - 116,9% к среднемесячному уровню проявления болезни. Наши результаты согласуются с результатами исследований (А.П. Красиков, Н.Н. Новикова, В.Н. Варбанский, О.А. Приступа, 2005; Н.В. Литвинов, 2008), которые считают причиной длительное носительство микоплазм и проявление болезни в результате воздействия неблагоприятных факторов, таких как погодные условия, стрессы, иммунодефициты.
При бактериологическом исследовании, по мнению многих авторов (О.В. Вологодская, 2006; А.Н. Свиридова, 2007), жидкие селективные среды чуствительны к микоплазмам урогенитального тракта и позволяют не только выделять их, но и дифференцировать по основным биохимическим показателям (аргинин, глюкоза, мочевина). Бактериологическое исследование биоматериала собак показало высокий уровень (55,9%) распространенности носительства микоплазм и уреаплазм. Микроскопия мазков семисуточных культур подтвердила наличие микоплазм в данных пробах в 90,1%. Среди исследуемых собак присутствовали собаки, содержащиеся в питомниках и собаки, принадлежащие частным владельцам. Процент обнаружения микоплазм у тех и у других отличался незначительно: 56,3% и 55,4% соответственно.
По данным многих авторов у собак микрофлора урогенитального тракта помимо микоплазм и уреаплазм представлена микроорганизмами родов: Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Proteus, Pseudomonas, Esherichia (А.П. Красиков, 2005; H.A. Кочуева, 2008; C.A. Пензурова, 2012). При изучении нами микробиоценоза урогенитального тракта собак при эндометритах наиболее часто обнаруживали представителей рода Staphylococcus spp. (59,22%). Также были выявлены микроорганизмы рода Proteus spp. (12,9%), Enterococcus spp. (9,5%). Среди ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов наибольшее распространение имеют стафилококки с энтеробактериями (36,8% случаев), стафилококки с энтерококками (33,3% случаев) и энтеробактерии с энтерококками (19,4% случаев). Анализируя чувствительность условно патогенной микрофлоры урогенитального тракта собак, определили, что микроорганизмы рода Staphylococcus spp. проявили чувствительность по отношению к фторхинолонам и аминогликозидам. Промежуточная чувствительность Staphylococcus spp. проявлена к Р-лактамным антибиотикам, тетрациклинам, макролидам. В отношении энтеробактерий, энтерококков и псевдомонад наиболее активными были ципрофлоксацин, энрофлоксацин, гентамицин. Наши результаты согласуются с результатами исследователей (С.Г. Брагина, 2001; Н.И. Васина, 2010), которые считают, что наиболее эффективными антибиотиками для всех возбудителей являются препараты фторхинолонового ряда. В связи с данными показателями при разработке оптимальных схем лечения предпочтение отдавалось фторхинолонам.
Влияние схем лечения на биохимические показатели крови
В контрольной группе после проведенного лечения энроксилом отмечали положительный клинический эффект, который выражался снижением ректальной температуры, появлением аппетита, исчезновением серозно-гнойных истечений из влагалищ. Терапевтическая эффективность составила 90%. Наступление половой охоты наблюдалось в 44,4% случаях. Число щенных сук составило 22,2%, при этом число щенков в помете 5,5±0,3 голов. При гематологическом исследовании показатели не имели достоверных различий, но наблюдалось повышение эритроцитов на 0,69 х 10 7л, уровень гемоглобина повысился на 15,5 г/л (10,3%). Число лейкоцитов снизилось на 20,7%, анализ лейкоцитарной формулы показал уменьшение гранулоцитов на 25,9%. При изучении биохимических показателей крови отмечали понижение содержания белка на 17,8%, креатинина на 39,1%, мочевины на 40,7%. Концентрация билирубина снизилась на 38,9%.
Степень элиминации микоплазм и уреаплазм определяли бактериологическим методом и методом ПЦР. По литературным данным предложенная к использованию на практике генодиагностика микоплазмоза с использованием амплификационных технологий (ПЦР) имеет преимущество перед традиционными методами, благодаря высокой чувствительности, специфичности, возможности прямого определения фрагмента генома возбудителя (СВ. Скворцов, 1995; И.Л. Обухов, 2005; Е.С. Красникова, 2010; Г.П. Погосян, А.А. Коновалова, 2012; Д.Ф. Хворик, 2011; J.M. Pruckler, 1995). Исследование урогенитальной слизи от собак контрольной группы методом прямого микробиологического посева на специальные селективные питательные среды показало снижение случаев обнаружения микоплазм на 50,0%, уреаплазм на 62,5%. Основываясь на результатах ПЦР-диагностики, снижение случаев обнаружения микоплазм произошло на 30%. Ассоциации микоплазма + уреаплазма сохранились в 3 случаях (37,5%). Таким образом, наши исследования согласуются с мнением ряда авторов (В.Н. Прилепская, 2004; Г.И. Мавров, 2005; A.M. Савичева, 2008) в том, что фторхинолоны обладают активностью в отношении микоплазм. В 1-ой опытной группе после проведенного лечения энроксилом и оваринином в дозе 0,01 мл/кг отмечали также положительный клинический эффект с исчезновением признаков урогенитальной инфекции. Терапевтическая эффективность составила 90%. Наступление половой охоты наблюдалось в 100% случаях. Число щенных сук составило 71,4%, при этом число щенков в помете 5,8±0,8 голов. При гематологическом исследовании наблюдалось повышение эритроцитов на 0,72 х КГ/л, увеличение уровня гемоглобина произошло на 17,7 г/л (11,7%). Число лейкоцитов снизилось на 24,8%. Анализ лейкоцитарной формулы показал снижение гранулоцитов на 25,3%. При изучении биохимических показателей крови отмечали понижение содержания белка на 20,3%, креатинина на 48,2%, мочевины на 50,8%. Концентрация билирубина снизилась на 41,7%.
В результате бактериологического исследования после проведенного лечения было обнаружено снижение частоты выявления микоплазм на 80,0%, снижение частоты выявления уреаплазм на 85,7%. ПЦР-диагностика показала снижение выявления микоплазм на 70,0%.
Во 2-й опытной группе после сочетанного применения энроксила + оваринин в дозе 0,1 мл/кг наблюдался положительный терапевтический эффект в 100% с наступлением своевременной стадии охоты у ранее бесплодных собак 100%. Число щенных сук составило 85,7%, при этом число щенков в помете 7,3±0,2 голов. Гематологические исследования показали увеличение эритроцитов на 0,91 х 10 /л. Уровень гемоглобина увеличился на на 24,7 г/л (16,8%). Число лейкоцитов снизилось на 44,2% за счет снижения количества гранулоцитов на 47,3%. Биохимическое исследование крови показало понижение содержания белка на 26,7%, креатинина - на 53,4%, мочевины - на 58,7%, билирубина - на 46,7%. Значения ACT и АЛТ имеют тенденцию к снижению у собак во всех подопытных групп, что подтверждает противоспалительное и гепатопротективное действие препаратов.
При микробиологическом исследовании во 2-ой опытной группе после проведенного лечения полная элиминация микроорганизмов наблюдалась в 90,0% случаев. При этом частота выявления микоплазм снизилась на 90,0%, частота выявления уреаплазм снизилась на 100%. Ассоциации микроорганизмов не были выявлены.
Таким образом, наиболее эффективной оказалась схема лечения сочетанного применения энроксила 5% + оваринин в дозе 0,1 мл/кг.
Ассоциации микроорганизмов проявили большую устойчивость к проведенному лечению. По мнению исследователей (Д.Ф. Хворик, 2011) микробные ассоциации способствуют адаптации возбудителя к внутриклеточному паразитированию и усиливают патогенность каждого возбудителя и его устойчивость к действию антибиотиков. При наличии смешанной инфекции микроорганизмы труднее поддаются элиминации.
Исследование терапевтической эффективности сочетанного применения препаратов энроксил и оваринин для лечения собак, больных эндометритами, вызванными микоплазмами, в производственных условиях показало повышение эффективности на 8,5% по сравнению со средствами традиционной терапии. Сроки выздоровления сократились на 2,5 (28,4%) суток.
Степень эффективности антибактериального препарата энроксил по данным ряда авторов (В.Н. Прилепская, 2004; Г.И. Мавров, 2005; Е.Н. Падейская, 2004; Н.И. Васина, 2010) колеблется в значительных пределах (10-100%), зависит от курса лечения, но его применение лимитировано побочными эффектами, такими как гепатотоксичность, дисбактериозы кишечника и др.
Таким образом, сравнительный анализ применения различных схем лечения подтвердил, что сочетанное применение антибактериального препарата энроксил + оваринин в дозе 0,1 мл/кг имеет большую эффективность. Мы считаем, что лечение урогенитального микоплазмоза должно быть комплексным и включать как средства, воздействующие на возбудитель, так и средства, стимулирующие неспецифическую сопротивляемость организма.