Содержание к диссертации
Введение
2.Собственные исследования 39
2.1. Материалы и методы исследований 39
2.1.1. Условия и место проведения исследований 39
2.1.2. Клиническое обследование птицы 43
2.1.3. Отбор патологического материала 45
2.1.4. Мониторинг микробоносительства в хозяйствах 46
2.1.5. Определение антибиотикорезистентности 53
2.1.6. Постановка биопробы 53
2.1.7. Статистическая обработка полученных данных 56
2.1.8. ПЦР диагностика хламидиоза и микоплазмоза 57
2.1.9. ИФА на хламидиоз и микоплазмоз 58
2.1.10. Определение литической активности бактериофагов 59
2.2. Результаты исследований 61
2.2.1. Результаты клинического и патологоанатомического обследования птицы 61
2.2.2 Бактериологические исследования на наличие микробоносительства 64
2.2.3 Мониторинг микробоносительства в перепеловодстве 71
2.2.4 Характеристика изолированной микрофлоры 85
2.2.5. Вирулентность патогенных бактерий–циркулятов 94
2.2.6. Антибиотикорезистентность патогенных культур 97
2.2.7. Определение литической активности бактериофагов 101
2.2.8. Изучение возможности устранения микробоносительства применением биопрепарата на основе бактериофагов 104
3.Обсуждение полученных результатов 113
4.Заключение 122
4.1. Выводы и итоги проведенного исследования 122
4.2. Практическое использование полученных научных результатов 124
Приложение 141
- Условия и место проведения исследований
- Постановка биопробы
- Мониторинг микробоносительства в перепеловодстве
- Изучение возможности устранения микробоносительства применением биопрепарата на основе бактериофагов
Условия и место проведения исследований
Работа выполнялась на базе ФГБОУ ВО МГАВМиБ-МВА имени К.И. Скрябина в период 2015-2018 гг, отдельные микробиологические исследования проводили в ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко, в лаборатории микробиологии и типовых культур.
При эпизоотическом обследовании птицеферм изучали заболеваемость среди перепелов в хозяйствах разного направления и производственных объемов, обращали внимание на наличие у птиц клинических признаков инфекционных заболеваний. Принципы работы промышленных хозяйств, в которых был проведен мониторинг:
- комплектование залов одновозрастной птицей;
- соблюдение перерывов между сдачей партии птицы и приемом новой партии.
Основной целью перепеловодческих ферм, на которых проводили мониторинговые исследования микробоносительства и эксперимент, является разведение перепелов для получения яичной и мясной продукции. Схема технологического процесса на перепелиной ферме следующая - производство инкубационных яиц, инкубация и выращивание перепелов с суточного до 40-55 дневного возраста, убой перепелов и первичная обработка тушек.
Преимущественное содержание перепелов - клеточное. Для кормления перепелов используют полнорационный комбикорм для перепелов, в составе которого содержится 21-23 % сырого протеина. Поение, преимущественно, ниппельное или с помощью вакуумных поилок. Все выбранные нами птицефермы официально были благополучны по инфекционным болезням.
Нами был проведен мониторинг микробоносительства на следующих птицефермах (n=16): ООО «Перепелкины и Жоев», ООО «Шепиловская птицефабрика», ООО «Инкубаторий», ООО "Тульский Перепел", ОАО «Угличская птицефабрика», ООО «Леноблптицепром», ООО ФХ «Безис», ОАО Агрофирма «Птицефабрика Сеймовская», ООО «Генофонд», ЛПХ «Мир перепелов», КФХ «Борская перепелка», ЛПХ «Свои перепела», Эко-подворье «Много кур», Семейная ферма «Мои перепела», ЛПХ «Граф Орлофф», ЛПХ "Перепелка", располагающиеся в Московской, Тульской, Нижегородской, Ленинградской, Ярославской, Тверской, Саратовской областей. Так же для работы использовали материал, поступающий в районные лаборатории.
Для реализации поставленных в работе задач мы провели мониторинговые исследования в перепеловодстве с целью изучения циркуляции патогенных микроорганизмов у данного вида птицы в различных хозяйственных условиях с идентификацией выделенных микроорганизмов, изучением их биологических свойств и установлением их патогенности, антибиотикорезистентности и фагочувствительности.
В двух хозяйствах, выбранных после проведения клинических и бактериологических исследований (ООО «Перепелкины и Жоев», ООО «Шепиловская птицефабрика») провели эксперимент по борьбе с микробоносительством.
В качестве бактериофагового средства для борьбы с микробоносительством использовали средство на основе коктейля бактериофагов «Фаговет Ави». Данное средство разработано ООО НПЦ «Микромир», находится на стадии клинических испытаний, экспериментальные серии выпущены в жидкой форме – стерильный концентрат фаголизата, расфасованный в стеклянные флаконы по 2, 5, 10, 50 или 100 мл.
Концентрат фаголизата по внешнему виду представляет собой светло жёлтую прозрачную жидкость. Средство имеет в своем составе следующие фаги: Ph.Streptococcus gallinarumS/11, vB-SaM-9/1, vB-KpnM-20, Ph. Klebsiella oxytoca 137, vB-PmS-22, Ph. Clostridium perfringens 11.1, vB-EcM-04, с концентрацией каждого из бактериофагов 1,0 х 109 – 9,9 х 1010 БОЕ /см3 и pH – 7,2-7,4.
Мониторинг проводили путем клинического обследования птицы в количестве 1500 голов на промышленных фермах и 500 в частных подвориях, с последующим бактериологическим и патологоанатомическим исследованием птицы в количестве 150 голов с каждой промышленной фермы и 50 голов с каждой частной фермы, где предварительно были проведены клинические исследования.
Для контроля эффективности проведенных метоприятий с использованием бактериофагового средства проводили повторные клинические, патологоанатомические и бактериологические исследования тушек птиц по истечении 14 дней наблюдения.
Для индикации и идентификации бактериальных культур мы использовали следующие питательные среды: простые среды – МПА, МПБ; дифференциальные питательные среды, такие как XLD-агар (для дифференциации патогенных энтеробактерий), MRS–агар (для определения лактобактерий и дифференцировки по их ферментации), Колумбия агар – основа для кровяного агара (для дифференцировки стафилококков и стрептококков), среда Китта–Тароцци (для дифференциации анаэробных бактерий), SS–агар (для выделения и дифференцировки сальмонелл и шигелл), основа бульона с бромкрезоловым пурпурным M284 himedia (для дифференциации чистых культур энтеробактерий), среда Кларка, среда Клиглера, среда Эндо, среда Плоскирева, среда Левина, Среда Хью-Лейфсона (для ОФ теста, с целью дифференциации грамотрицательных микроорганизмов по наличию у них ферментативного или окислительного метаболизма углеводов); селективные питательные среды: агар МакКонки (для роста колиформных бактерий), агар Шедлера (для роста анаэробных бактерий), цитратный агар (для подтверждения утилизации цитрата энтеробактериями), висмут-сульфитный агар (для роста сальмонелл), хромогенный агар cm 1007 (для роста энтерококков), среда элективная солевая–бульон (для выделения стафилококков); диагностические питательные среды: полужидкий питательный агар (для установления подвижности бактерий), Oxford агара (селективно-диагностическа среда для выявления листерий) .
Использованные в ходе исследований питательные среды являлись коммерческими. Приготовление этих сред производили в соответствии с инструкцией производителя («Oxoid» и «Himedia», представленные на рисунке 1, Великобритания), за исключением бульона Китта–Тароцци, который был производства ФКП «Щелковский биокомбинат».
«Himedia» Для идентификации выделенных культур использовали наборы: Microbact 12e, Api 20e, Enterotest 24N, Remel Rap IDone, основанные на тестировании биохимических свойств бактерий (рисунки 2,3,4,5).
Микроорганизмы, способные к ферментации того или иного углевода, культивировали в питательной среде с соответствующим диском и индикатором Андреде, который под действием кислых продуктов расщепления углевода изменяет первоначальный соломенно–желтый цвет на красный. Оценку результатов определнеия сахаролитических свойств, выделенных изолятов проводили по следующему алгоритму: добавляли диск впоследствие чего пропитанный им углевод диффундировал в питательную среду. В ходе ферментации образовывалась кислота, иногда кислота и газ, что способствовало изменению цвета индикатора в питательной среде.
Для определения каталазы на предметное стекло в каплю 3 %–ного раствора перекиси водорода вносили чистую культуру микроорганизмов. Активное выделение пузырьков газа свидетельствовало о положительной каталазой активности изолята. Для определения оксидазной активности нами были использованы тесты на оксидазу фирмы «Himedia», для чего на бумажный диск вносили чистую колонию микроорганизмов. Появление сине-фиолетового цвета говорило о положительной реакции на оксидазу.
Постановка биопробы
Для определения патогенности выделенных микроорганизмов была поставлена биопроба на белых мышах массой 16–20 г одинаковых по массе и возрасту, морских свинках массой 300-350 г, 2 - суточных цыплятах. Все животные были получены в линии specific pathogen free (SPF). Всего для постановки биологической пробы было использовано 612 белых мышей, 66 морских свинок и 116 цыплят.
Биопробу проводили при изолировании культур в стандартных дозах инфицирования целевых лабораторных моделей (см. таблицу 1). При воспроизведении инфекционной болезни и гибели минимум 2 из 4 лабораторных животных – культуру считали патогенной.
Для постановки пробы мы получали суспензии из суточных культур выделенных микроорганизмов. Ввиду того, что от одной птицы индикация возбудителей проводилась из разных проб материала, то выделенный изолят одного вида бактерий, полученный из одного цеха, признавали единым.
Для постановки биопробы отбирали изоляты зоопатогенных видов микроорганизмов и условно-патогенных бактерий.
Белых мышей заражали по 0,5 см3 суспензиями следующих микроорганизмов: Streptococcus gallinarum, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Esсherichia coli по 4 мыши каждым разведением исследуемого микроорганизма. Наблюдение вели в течение 10 суток с момента инфицирования, диагноз в случае гибели подтверждали бактериологическими исследованиями.
Для определения автогенности выделенных изолятов клостридий проводили зараженние суспензией возбудителя внутрибрюшинно в дозе 0,5см3 морских свинок по 2 на изолят. Как результат учитывали характер патологоанатомических изменений и гибель лабораторных моделей.
Также патогенность стафилококковых культур оценивали по коагулазной активности, а стрептококковых культур по стрептокиназной активности.
Тест на плазмокоагулазу стафилококков проводили с целью определения фермента – коагулазы, который в сочетании с компонентами сыворотки коагулирует плазму. Этот фермент облегчает персистенцию бактерий в тканях. Бактериальную массу исследуемой культуры (с поверхности агара) смешивали с 0,5 мл. плазмы крови кролика, разведенной стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:4 с последующей инкубацией при температуре 37 C. Результат учитывали по истечении 24 часов.
Тест на стрептокиназу проводили путем засеивания исследуемой культуры микроорганизмов в виде бляшки на агар с 12 % цитрированной плазмы и инкубировали в течение 24 часов при температурет 37 C.
Определение патогенности сальмонелл не проводили, т.к. патогенность определяют в необходимых случаях, например, при выделении нетипируемых серологически сальмонелл.
Определение вирулентности проводили для «избранных» культур с типичными свойствами для вида (серогруппы, сероварианта) и обладавшими максимальной патогенностью при постановке биопробы, с целью отбора музейных штаммов патогенных культур от перепелов.
Вирулентность выделенных микроорганизмов определяли путем установления LD50 исследуемых изолятов микроорганизмов для белых мышей и цыплят. Для исследования получали чистые культуры микроорганизмов путем многократного пассирования на питательных средах. Для этого культуру разводили дистиллированной водой, капали на питательную среду, растирали шпателем и инкубировали при 37 0С 24 часа – Staphyloccus aureus, Proteus mirabilis, 20 часов Streptococcus gallinarum, 18 – часов для E. coli и клебсиелл. Далее брали изолированную колонию бактериальной петлей, снимали ее, разбавляли физиологическим раствором и повторяли описанные ранее действия. Делали смыв со всей поверхности питательной среды и десятикратные разведения. Для уточнения исходной концентрации из последних трех разведений делали высев 0,1 см3 взвеси культуры, равномерно распределяя, на чашки Петри с МПА (по две на каждое разведение), которые затем инкубировали при 37 С 18-20 часов и подсчитывали число колоний. Выводили среднее число микробных клеток в указанном объеме в каждом разведении, после чего пересчитывали среднее число микробных клеток в 1 см3 исходной взвеси.
Далее взвесью микроорганизмов с установленной концентрацией заражали подопытных животных по 4 лабораторные модели на одну дозу (разведение). В ходе исследований учитывали следующие данные:
- количество микробных клеток, введенных в организм лабораторного животного;
- способ их введения;
- сроки гибели лабораторных животных после заражения.
Вычисление LDso проводили по формуле Кербера в модификации Ашмарина-Воробьева (П.И. Ашмарина и А.А. Воробьева): lg LDso = lg DN (Li - 0,5), где DN - максимальная доза заражения, S - логарифм отношений каждой последующей дозы к предыдущей, Li - отношение числа погибших животных к их общему числу в группе, Li - сумма значений Li, найденная для всех доз.
Мониторинг микробоносительства в перепеловодстве
Основным нормирующим документом, который был нами использован в ходе данных исследований, являлся ГОСТ 10444.15–94. «Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов» [25].
Вся убитая с диагностической целью птица исследовалась патологоанатомически, бактериологически. Отбор проб для микробиологических исследований проводили с соблюдением асептических условий, использовали стерильную посуду, оборудование, материалы, реактивы, средства для предотвращения микробной контаминации проб с объектов внешней среды. Всего нами было проведено бактериологическое исследование 1700 голов перепелов, из них 350 голов перепелов из частных хозяйств и 1350 – из промышленных ферм с поголовьем 2000 и более. Трупы птиц перевозили в лабораторию целыми в непроницаемой таре. Пробы отбирали из мяса грудных мышц, сердца, легких, печени, мышечного желудка и кишечника. Также отбирали кусочки органов и кровь в качестве материала для проведения ПЦР и ИФА.
Анализируя полученные результаты, можно отметить, что из органов перепелов были выделены токсинообразующие, потенциально вирулентные культуры микроорганизмов. В таблице 4 представлены данные о результатах выделения потенциально патогенных микроорганизмов, а также, после таблицы, приведены результаты скрининговых исследований в полимеразной цепной реакции и иммуноферментном анализе с целью определения вероятного инфекционного фона микоплазменных и хламидийных инфекций.
Обнаруженные микроорганизмы находились как в субпродуктах, так и в мясе птицы, а также во внутренних органах (кишечник, легкие). Исходя из этих данных, мы можем говорить о микробоносительстве, которое нами было выявлено у птиц в исследуемых группах (таблица 4).
После проведения ПЦР–диагностики были получены положительные результаты на Mуcoplasma gallisepticum в 3 хозяяйствах и Chlamydophila psittaci, проявившая себя в 2 случаях.
Для подтверждения наличия данных возбудителей у исследуемой птицы нами был проведен иммуноферментный анализ. Необходимость в постановке ИФА была обоснована тем, что при диагностике хламидиоза и микоплазмоза результаты анализов могут давать вариабельные данные в ПЦР по следующим причинам: после выздоровления в сыворотке крови длительное время могут сохраняться антитела, обнаружение которых может ошибочно трактоваться как наличие инфекции в организме.
Кроме того, при хронической инфекции организм может снизить выработку антител к возбудителям, и диагностическая эффективность иммуноферментного анализа будет снижена, в то время как ПЦР выявит наличие ДНК внутриклеточных паразитов. Полученные результаты в ИФА и ПЦР являлись взаимодополняющими и взаимоуточняющими в примененных методах при проведенных исследованиях. При исследовании проб в ИФА были получены следующие результаты для Mуcoplasma gallisepticum – 1/10 –1/20, для Chlamydophila psittaci – 1/10 –1/20.
Как видно из данных, представленных в таблице 4, от перепелов, в т.ч. клинически здоровых, изолируется широкий круг бактерий, имеющих патогенный потенциал.
Наиболее распространенные ассоциации бактерий, установленные нами в ходе мониторинга: Klebsiella pneumonia + Staphylococcus aureus+Proteus mirabilis – 13,2 %, Streptococcus gallinarum+ Escherichia coli+ Proteus mirabilis – 10,7%, Streptococcus gallinarum+ Escherichia coli+ Proteus mirabilis – 10,7 % (рисунок 14).
В 1,6 % случаев была выделена Salmonella enterica. Данный возбудитель был выявлен на 2-х частных фермах с поголовьем менее 2000. Выделение данного вида возбудителей в условиях промышленного или частного птицеводства является одной из главных проблем ветеринарии, так как сальмонеллезная инфекция социально опасна и причиняет большой экономический ущерб в связи с высокой летальностью молодняка, снижением яйценоскости перепелок, повышениеи выбраковки и значительнымы затратами на лечение и профилактику. Индикация сальмонелл отражает санитарное неблагополучие ферм и требует особого изучения.
Перспективным является поиск решения проблем распространения сальмонеллёза, контаминации сальмонеллами продукции животного происхождения, в т.ч. яиц и мяса птицы.
Изучение возможности устранения микробоносительства применением биопрепарата на основе бактериофагов
Бактериофаговый метод терапии был выбран в связи с тем, что данный метод является хорошей альтернативой антибактериальным обработкам птицы и наличию остаточных количеств антибиотиков в пищевой продукции. Это реализует концепцию безопасности боенских продуктов при условии антибактериальной эффективности фаговых средств. Выбранный нами препарат в своем составе имел гомологичные фаги к большинству выделенных в ходе исследований бактерий, и лабораторно была подтверждена чувствительсть компонентов данного препарата бактериофагов к выделенным гомологичным микроорганизмам.
Для исследования эффективности комплексного препарата было определено бактериофаговое средство «Фаговет Ави»– экспериментальный препарат ветеринарного назначения в жидкой форме – стерильный концентрат фаголизата, расфасованный в стеклянные флаконы по 2, 5, 10, 50 или 100 мл. Концентрат фаголизата по внешнему виду представляет собой светло-жёлтую прозрачную жидкость. Эффективен в отношении: Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Clostridium spp., Klebsiella oxytoca. Представленное средство не 105 имеет активных бактериофагов против Salmonella infantis и typhimurium, борьба с этими инфектами потребует поиска, селекции фагов и разработки новых средств. Поэтому осуществление исследований объективно было проводить в хозяйствах, благополучных по сальмонеллезу.
Для проведения эксперимента отбирали здоровую птицу пород фараон и японская в двух разных хозяйствах промышленного типа. Группы подбирали по принципу аналогов: по возрасту, живой массе, продуктивности. Различия по живой массе и продуктивности у отобранной птицы между группами не превышало 3 %.
Птиц содержали в клетках, с соблюдением всех правил и норм плотности посадки, фронта кормления и поения, температурного режима и влажности воздуха, режимов освещенности и продолжительности светового дня.
Сохранность птицы учитывали на протяжении всего периода эксперимента. В случае падежа устанавливали его причину.
Весь период проведения и окончание опыта оформляли соответствующим актом.
В каждом хозяйтве выбранную для эксперимента птицу делили на три группы: в каждой группе по 100 голов перепелов 45-дневного возраста. Птица содержалась клеточно в одном помещении. Первая группа птиц получала средство «Фаговет Ави» однократно с водой из расчета 3 мл на 7,4 литра воды, вторая группа получала то же средство в той же дозе, но трехкратно с интервалом 48 часов, третья группа являлась контрольной и выпойку бактериофагового средства с водой перепелам этой группы не производили, давали только воду. Бактериофаговое средство первой и второй групп выпаивали групповым методом из вакуумных поилок, которые ставились на группу, и подачей препарата в системы ниппельного поения.
Для разведения препарата брали среднее количество воды, которое выпивают 100 голов перепелов в день. Предварительно, перед дачей препарата производили убой птицы с диагностической целью (10 % от количества голов в группе), проводили бактериологические исследования на наличие микробоносительства и подтверждения патогенности выделенных микроорганизмов. После дачи препарата за птицей вели наблюдение в течение 14 дней. Проводили клинический осмотр птицы, учет заболеваемости и падежа с установлением причины, по истечении данного срока производили убой птицы с диагностической целью (в 62–64 сут.) для проведения бактериологических исследований с целью оценки эффективности средства на основе бактериофагов.
Осмотр птицы производили для исключения клинических признаков болезни и неблагоприятного влияния препарата на организм перепелов, а также вели наблюдение за питьевым режимом и режимом кормления птицы. Результаты эксперимента представлены в таблицах 11–12, отображающих эффективность использования комплексного препарата бактериофагов для борьбы с бактериальными инфекциями в условиях перепеловодческих хозяйств индустриального типа разного направления (яичного и яично-мясного) и разного инфекционного фона, с отличающимися режимами поения и кормления при клеточном содержании.
Таким образом, представленные в таблицах 10, 11 данные, потенциально отображают возможность использования фаговых средств для улучшения циркулирующего бактериального фона в перепеловодстве и санитарных показателей убойных тушек.
По результатам исследований до и после обработки препаратом можно судить о взаимосвязи санитарных показателей тушек и микробоносительства.
При проведении исследований у птицы – носителя патогенных бактерий: Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia и oxytoca, Staphylococcus aureus санитарные показатели тушек были завышены. После обработки бактериофаговым средством птицепоголовья в ООО «Перепелкины и Жоев» получены положительные результаты в виде улучшения санитарных показателей мяса перепелов, а также снижения количества птиц-носителей бактериальных патогенов, что установлено бактериологическими исследованиями. В сравнении с контрольной группой тушки от птиц, обработанных препаратом комплексных бактериофагов отличались по санитарным показателям соответствием требованиям ГОСТ и бактериологической безопасности.
Интересные получились результаты в ООО «Шепиловская птицефабрика», где на фоне эшерихиозной заболеваемости в связи с отсутствием в бактериофаговом средстве активных фагов к Escherichia coli О 78 произошло развитие эпизоотического процесса, тем не менее в сопоставимо меньших проявлениях, чем в контрольной группе без обработки фагами.
Для борьбы с возбудителем эшерихиоза (колисептицемии) данного серотипа проведенные исследования показали перспективы поиска и разработки фаговых коктейлей, включая активные эквиваленты циркулирующим патогенам.