Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 13
1.1 Характеристика возбудителя вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 13
1.1.1 Молекулярно-генетические и физико-химические свойства вируса 13
1.1.2 Антигенные и биологические свойства вируса 14
1.2 Особенности распространения вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек у крупного рогатого скота 15
1.3 Клинические проявления вирусной диареи-болезни слизистых оболочек у крупного рогатого скота 16
1.4 Особенности диагностики вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 18
1.5 Меры борьбы и профилактики вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 19
1.6 Контаминация биологических продуктов вирусом вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 20
1.7 Противовирусные соединения, обладающие противовирусной активностью в отношении вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 22
1.7.1 Классификация противовирусных препаратов 22
1.7.2 Ингибиторы репликации генома вируса 22
1.7.3 Препараты, оказывающее влияние на экспрессию генов вируса 24
1.7.4 Ингибиторы созревания и вирусной сборки 25
1.7.5 Препараты, нарушающие фолдинг гликопротеинов вируса 25
1.7.6 Ингибиторы проникновения вируса в клетку 25
1.7.7 Интерфероны 26
1.7.8 Индукторы интерферона и иммуномодуляторы 27
1.7.9 Изучение препаратов, обладающих противовирусной активностью в отношении вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в условиях in vivo 28
1.8 Заключение по обзору литературы 30
2. Собственные исследования 32
2.1 Материалы и методы исследований 32
2.2 Результаты исследований 40
2.2.1 Результаты изучения особенностей распространения вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота на молочных комплексах Сибири 40
2.2.2 Результаты изучения противовирусной активности различных препаратов в отношении вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота in vitro 48
2.2.2.1 Противовирусная активность химически синтезированных искусственных рибонуклеаз 49
2.2.2.2 Противовирусная активность препаратов на основе растительных экстрактов 55
2.2.2.3 Противовирусная активность препаратов на основе Bacillus subtilis 57
2.2.2.4 Противовирусная активность препарата Виталанг-2 60
2.2.3 Изучение противовирусной активности Рибавирина липинт и Реаферона-ЕС-липинт в инфицированной нецитопатогенным биотипом вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота культуре клеток 65
2.2.4 Изучение противовирусной активности препарата Виталанг-2 в отношении вируса вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота in vivo 65
3 Обсуждение полученных результатов 73
4 Заключение 80
5 Выводы 82
6 Практические предложения 84
7 Список литературных источников 85
8 Приложения 114
- Клинические проявления вирусной диареи-болезни слизистых оболочек у крупного рогатого скота
- Результаты изучения особенностей распространения вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота на молочных комплексах Сибири
- Изучение противовирусной активности Рибавирина липинт и Реаферона-ЕС-липинт в инфицированной нецитопатогенным биотипом вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота культуре клеток
- Обсуждение полученных результатов
Введение к работе
Актуальность темы. Вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) – контагиозное заболевание, вызываемое пестивирусами двух видов, BVDV-1 и BVDV-2, широко распространенное во всем мире, приносящее большие экономические убытки (A.M. King et al., 2011). Исключение составляют некоторые страны Скандинавии, в которых проводились программы по его ликвидации (V. Bitscha et al., 2000; I. Greiser-Wilke et al., 2003).
Впервые заболевание ВД-БС КРС описано в 1946 г. (T. Childs, 1946; P. Olafson et al., 1946), в России зарегистрировано в 1974 г. (Н.Н. Крюков и соавт., 1976). Большой вклад в его изучение внесли отечественные исследователи (С.А. Жидков и соавт., 1994, 1995; А.Г. Глотов и соавт., 2002-2016; К.П. Юров и соавт. 2003, 2015).
Заболевание имеет различные клинические формы проявления, которые могут неблагоприятно влиять на каждую стадию производства животноводческой продукции, но наиболее значимые его последствия – нарушения в репродуктивной сфере, сопровождающиеся абортами, бесплодием и врожденными уродствами плода (J.F. Ridpath, 2010), а также болезни респираторного тракта (С.А. Жидков и соавт., 1995). Инфицирование не имеющих иммунитет к вирусу телок и коров приводит к неудачным оплодотворениям (E.A. Gonzlez Altamiranda et al., 2013), повторным приходам в охоту (D.L. Grooms, 2004), а на ранних стадиях стельности – к бесплодию, эмбриональной смертности, абортам (M.R. McGowan et al., 1995), рождению мертвых телят, возникающим из-за дисфункций яичников, воспаления матки и прямого воздействия на эмбрион (C.A. Muoz-Zanzi et al., 2004). Вирус способен вызывать трансплацентарные инфекции, что приводит к рождению персистентно инфицированных (ПИ) телят, служащих постоянным источником и резервуаром возбудителя.
Несмотря на наличие эффективных диагностических тестов, неспецифический и разнообразный характер заболевания затрудняет борьбу с ним. Известно, что на распространение инфекции оказывает влияние структура стада. Интенсивное и неконтролируемое поступление животных из многих источников с неизвестным статусом создает значительный риск заноса возбудителей различных инфек-3
ционных болезней, влияющих на экономические показатели стада. К их числу относится вирус ВД-БС КРС (А.Г. Глотов, К.Л. Келлинг, 2007). Изучение особенностей циркуляции вируса в разных производственных группах животных необходимо для разработки более эффективных противоэпизоотических мероприятий.
В настоящее время биотехнологической промышленностью выпускается большое количество вакцин против ВД-БС КРС, которые используют для защиты животных от острой и внутриутробной инфекции. Из-за высокой антигенной вариабельности вируса ВД-БС КРС, применение вакцин может быть недостаточно эффективным для защиты животного от заражения. При вспышке заболевания важно в короткие сроки обеспечить противовирусную защиту восприимчивым животным, но после вакцинации необходимо время для выработки стойкого иммунитета (J.F. Ridpath, 2010). Противовирусные соединения могут обеспечить немедленную защиту животных, подверженных риску. Однако в настоящее время для этого нет доступных и высокоэффективных препаратов.
По данным Charleston B. et al., 2001, наибольшее эпизоотологи-ческое значение имеет нецитопатогенный (НЦП) биотип вируса, поскольку он способен преодолевать трансплацентарный барьер и вызывать персистентную пожизненную инфекцию у КРС. Кроме того, он контаминирует биологические продукты (культуры клеток, вакцины, эмбриональные сыворотки крови КРС, сперму и эмбрионы). Это способствует распространению возбудителя ВД-БС КРС в стаде, а также может приводить к искажению результатов экспериментов, проводимых с использованием контаминированных биологических препаратов (J.D. Neill et al., 2008; R.A. Palomares et al., 2013). Поэтому актуальным является поиск противовирусных препаратов для борьбы с персистентной инфекцией в частности в культуре клеток и для применения в ветеринарии для борьбы с вирусными инфекциями животных.
Особенно важно проводить изучение противовирусной активности соединений не только in vitro, но и исследовать их in vivo для дальнейшей разработки коммерческих препаратов и схем их применения.
Цель и задачи исследования. Цель работы – изучить особенности распространения вирусной диареи-болезни слизистых оболо-4
чек крупного рогатого скота на молочных комплексах Сибири и противовирусную активность соединений и препаратов разных групп.
Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:
-
Определить особенности распространения вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Сибири.
-
Изучить противовирусную активность соединений и препаратов разных фармакологических групп в отношении вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в условиях in vitro.
-
Изучить противовирусную активность препаратов Рибавирин-липинт и Реаферон-ЕС-липинт в инфицированной нецитопатоген-ным биотипом вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота культуре клеток.
-
Изучить противовирусную активность препарата Виталанг-2 в отношении вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в условиях in vivo.
Научная новизна работы.
-
Определены особенности распространения вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота на молочных комплексах Сибири.
-
В условиях in vitro изучена противовирусная активность 49 соединений и препаратов разных групп, из которых выявлено семь с противовирусной активностью в отношении вируса ВД-БС КРС.
-
Получены научные данные о противовирусной активности препаратов Рибавирин-липинт и Реаферон-ЕС-липинт в инфицированной нецитопатогенным биотипом вируса ВД-БС КРС культуре клеток.
-
В условиях in vivo на телятах 4-х месячного возраста, естественно инфицированных вирусом ВД-БС КРС, изучена противовирусная активность препарата Виталанг-2.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, так как дают возможность расширения научных знаний относительно распространения ВД-БС КРС на крупных молочных комплексах Сибири и противовирусной активности соединений и
препаратов разных фармакологических групп в отношении вируса ВД-БС КРС.
Данные о распространении ВД-БС КРС на крупных молочных комплексах Сибири и особенностях проявления инфекции у животных разных половозрастных групп могут быть использованы для усовершенствования противоэпизоотических мероприятий.
Сведения о противовирусной активности в отношении вируса ВД-БС КРС семи соединений и препаратов, полученные in vitro, свидетельствуют о целесообразности их дальнейших исследований in vivo.
Полученные сведения о противовирусной активности препарата Виталанг-2 могут быть использованы для повышения эффективности лечебных мероприятий при ВД-БС КРС.
Методология и методы исследования. Методологическая основа исследований включала анализ и синтез информации по распространению, диагностике, лечению и профилактике ВД-БС КРС, представленной в зарубежных и отечественных источниках литературы, а также данные, полученные в экспериментальных и производственных условиях.
В работе использованы следующие методы исследований: кли-нико-эпизоотологические, гематологические, серологические и вирусологические.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Результаты изучения особенностей распространения ВД-БС КРС на крупных животноводческих комплексах Сибири у высокопродуктивных животных. Определены половозрастные группы животных, которые могут быть использованы в качестве маркерных и отражают циркуляцию вируса ВД-БС КРС на молочных комплексах с высокопродуктивным импортным скотом.
-
Результаты изучения противовирусной активности 49 соединений и препаратов разных фармакологических групп в отношении вируса ВД-БС КРС в условиях in vitro.
-
Результаты изучения противовирусной активности комплексного применения препаратов Рибавирин-липинт и Реаферон-ЕС-липинт в инфицированной нецитопатогенным биотипом вируса ВД-БС КРС культуре клеток.
-
Результаты изучения противовирусной активности препарата
Виталанг-2 на естественно инфицированных вирусом ВД-БС КРС телятах 4-х месячного возраста.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов подтверждена большим объемом исследований, проведенных в 2013-2017 гг., анализом данных полученных в лабораторных и производственных условиях, статистической обработкой полученных результатов исследований.
Материалы исследований доложены на: Всероссийской научно-практической конференции «Молодежь в аграрной науке и образовании – инновационный потенциал будущего», Новосибирск, 2013 г.; III Международной конференции «Инновационные разработки молодых ученых – развитию агропромышленного комплекса», Ставрополь, 2014 г.; V международном съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов «Актуальные проблемы и инновации в современной ветеринарной фармакологии и токсикологии», Витебск, 2015 г.; XI Международной научно-практической конференции «Аграрная наука – сельскому хозяйству», Барнаул, 2016 г.; IV Международной конференции молодых ученых биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов «Площадка открытых коммуникаций OpenBio», Наукоград Кольцово, 2017 г.
Публикация результатов исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 - в журналах, рекомендованных ВАК («Вестник КрасГАУ», «Сельскохозяйственная биология», «Вопросы вирусологии»).
Внедрение полученных результатов. Материалы диссертации использованы при разработке методических пособий: «Применение иммуномодуляторов для повышения иммуногенности вакцин против вирусных инфекций крупного рогатого скота» и «Комплексная система диагностических мероприятий при смешанных вирусно-бактериальных инфекциях респираторного тракта крупного рогатого скота», материалы рассмотрены и утверждены Ученым советом ИЭВСиДВ СФНЦА РАН (протокол №1 от 20 октября 2016 г.).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка сокращений, списка литературы, приложений. Работа иллюстрирована 5 рисунками и 10
таблицами. Список литературы включает 220 источников, в том числе 141 зарубежный.
Личный вклад соискателя. Соискатель принимал непосредственное участие в планировании и постановке научных экспериментов, получении, обработке и интерпретации экспериментальных данных, анализе научной литературы, подготовке публикаций по выполненной работе.
Автор выражает глубокую благодарность заведующему лабораторией биотехнологии – диагностический центр ИЭВСиДВ СФНЦА РАН, доктору ветеринарных наук, профессору А.Г. Глотову, а также старшим научным сотрудникам этой лаборатории: кандидату ветеринарных наук С.В. Котеневой, кандидату биологических наук О.В. Семеновой за помощь в выполнении некоторых разделов диссертации.
Клинические проявления вирусной диареи-болезни слизистых оболочек у крупного рогатого скота
Оба вида ВД-БС КРС вызывают аналогичные симптомы у КРС. Некоторые авторы отмечают, что болезнь, вызванная BVDV-2, протекает значительно тяжелее [87, 193].
Острая форма инфекции характеризуется лихорадкой, угнетенным состоянием, снижением продуктивности животного и диареей. Иногда у животных выявляют язвы в ротовой полости. Тяжесть заболевания варьирует от легких до сверхострых форм, сопровождающихся геморрагическим синдромом. Исход заболевания зависит от иммунного статуса и возраста животного, вирулентности штамма вируса, а также внешних условий. В некоторых случаях спорадически происходят аборты. Отмечено, что во время вспышки заболевания абортирует до 25% стельных животных, а ранняя эмбриональная смертность может достигать 78,6 %. Как правило, вспышки заболевания возникают в стадах серонегативных животных при вводе новых животных, выделяющих вирус, либо при переводе не-иммунизированных животных в другие производственные группы. В период таких вспышек может заболеть более 25% всего стада. В 90% случаев инфекция протекает субклинически и остается незамеченной ветеринарными специалистами [18].
Персистентная инфекция у плода развивается вследствие внутриутробного заражения коров-матерей в первом триместре стельности. Иммунная система эмбриона становится толерантной к вирусным белкам и этот эффект сохраняется на всю жизнь. Клинические признаки у ПИ животных могут отсутствовать, либо проявляются множественными врожденными дефектами, включающими замедление роста, аномалии волосяного покрова, кожи, скелета и нервной системы. Предполагают, что на клиническое проявление заболевания оказывают влияние сроки развития плода во время инфицирования. ПИ животные играют важную роль в эпизоотическом процессе и являются главным источником возбудителя [188].
Вирус ВД-БС КРС играет важную роль в возникновении массовых респираторных болезней у телят. Не являясь прямым респираторным патогеном, он вызывает иммуносупрессию при острых инфекциях, повышая риск развития респираторных болезней у телят за счет усиления патогенности других вирусов и бактерий [12, 16, 19, 23, 39, 55].
В стационарно неблагополучных хозяйствах вирус ВД-БС КРС вызывает репродуктивные проблемы у животных, выражающиеся в увеличении количества абортов, эмбриональной смертности и бесплодия вследствие воспаления матки или дисфункции яичников [25]. Значение вируса в патологии воспроизводства может недооцениваться, поскольку он часто взаимодействует с другими возбудителями вирусно-бактериальной природы [27].
Результаты изучения особенностей распространения вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота на молочных комплексах Сибири
Вирусная диарея - болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота распространена по всему миру. Для оценки благополучия стада по ВД-БС КРС обычно используют серологические методы исследования. «Золотым стандартом» серологической диагностики этого заболевания является реакция нейтрализации вируса в культуре клеток. В Европейской части России количество серопозитив-ных животных в хозяйствах может достигать 40% от числа обследованных [9, 75], в Сибири – колеблется от 64,8% до 85,6% c наибольшим распространением в хозяйствах Кемеровской, Курганской, Новосибирской и Тюменской областей, Республики Бурятия и Красноярского края [30].
В настоящее время для выявления вируса в различных пробах биологического материала, отобранного от больных животных, широко применяется метод полимеразной цепной реакции [13, 65, 144]. Как отмечается исследователями, максимальная частота выявления вируса чаще всего отмечается на крупных молочных комплексах с наличием импортных животных и с интенсивным типом ведения животноводства [10, 65].
Нами было проведено изучение особенностей распространения вируса ВД-БС КРС среди животных разных возрастных групп в шести крупных молочных хозяйствах Тюменской области.
Серологические исследования проб сыворотки крови проводили в реакции нейтрализации микрометодом в перевиваемой линии культуры клеток Madin Darby Bovine Kidney (MDBK), согласно стандарту Международного эпизоотического бюро (МЭБ) (OIE, 2015) с использованием цитопатогенного штамма NADL в качестве антигена. Для скрининговых серологических исследований пробы сыворотки крови отбирали однократно, а для проведения ретроспективной диагностики ВД-БС КРС — двукратно с интервалом 4-6 нед.
В результате проведенных исследований было установлено, что вируснейт-рализующие антитела присутствовали в пробах сыворотки крови у 85-95 % нетелей, завезенных в обследованные хозяйства. Титры вируснейтрализующих антител к вирусу ВД-БС КРС у этих животных были высокими и составляли 1:64-1:128 (Таблица 1).
В течение 3-5 лет после завоза серопозитивность телок первого поколения после искусственного осеменения была высокой и составила в среднем 89,4 %, причем 71,4 % из них реагировали 64-128-кратной сероконверсией к возбудителю через 1-3 мес после осеменения, что, вероятно, было связано с первичным контактом с возбудителем. У коров первой и второй лактаций этот показатель оказался ниже и составил 36,5 %.
Серопозитивность нетелей и коров в запуске, а также после отела была приблизительно одинаковой. Количество нетелей, реагирующих сероконверсией к вирусу, составило 14,5 %, первотелок — 29,1 %, коров после отела — 12,7 %. У коров в запуске прироста титров антител к вирусу не наблюдали.
Средние титры вируснейтрализующих антител к ВД-БС КРС были выше у телок через 30-90 суток после искусственного осеменения, чем у других категорий животных, и достигали 9,6±0,1 lg2.
В 6 хозяйствах Тюменской области нами было проведено эпизоотологиче-ское обследование. В каждом хозяйстве выделяли модельные половозрастные группы по 100 животных.
Результаты представлены в таблице 2.
В результате проведенных исследований было установлено, что в течение первых 6 месяцев после завоза в среднем у 25 % нетелей от общего количества завезенных в хозяйство регистрировали аборты и рождение мертвых телят. Кроме того, у телят, рожденных ими, в возрасте до месяца регистрировали развитие различных патологий органов желудочно-кишечного тракта, а также респираторных органов. У нетелей после отела и последующего осеменения в местных условиях отмечали низкую оплодотворяемость и регистрировали раннюю эмбриональную смертность, аборты, эндометриты, снижение молочной продуктивности, рождение мертвых или ослабленных нежизнеспособных телят.
Исследование проб биоматериала осуществляли методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с использованием тест-системы, разработанной в ИЭВСиДВ СФНЦА РАН.
Результаты исследования на ВД-БС КРС методом ОТ-ПЦР проб спермы от быков-производителей, использованной для осеменения маточного поголовья в обследованных нами хозяйствах, были отрицательными, что предполагало эндогенный источник возбудителя в обследованных стадах, т.е. наличие в них ПИ животных, а также животных с острой формой инфекции.
Результаты изучения частоты выявления генома вируса ВД-БС КРС методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в пробах биоматериала представлены в таблице 3.
Геном вируса выявили в среднем у 40,0 % 4-6-месячных абортплодов; 24,0 % 6-9-месячных абортплодов и 29,2 % мертворожденных телят с локализацией в лимфоидной ткани, паренхиматозных органах и мозге. У абортплодов 4-6-месячного возраста чаще наблюдали гидроцефалию, а у рожденных живыми — наличие вьющегося шерстного покрова или его отсутствие, врожденную катаракту и поражение суставов. В большинстве случаев у матерей выявляли сероконвер-сию к вирусу через 6-8 недель после аборта. Вирус присутствовал в 29,0 % вагинальных и маточных выделений первотелок.
Средний показатель частоты выявления вируса от коров первой и второй лактаций составил 3,7 %, что на 12,9 % ниже, чем у первотелок. Количество ПИ животных среди коров — 1,6 %, телят до выпойки молозива — 3,7 %, что также было ниже, чем у нетелей и рожденных от них телят соответственно на 9,0 и 5,1 %.
Геном возбудителя выявили во внутренних органах у 17,5 % абортплодов 46-месячного возраста, 10,3 % — 6-9-месячного возраста и у 20,5 % мертворожденных телят. Вирус присутствовал в 13,5 % проб вагинальных и маточных выделениях коров с признаками острого эндометрита, в том числе абортировавших.
Массовые репродуктивные проблемы у завезенных животных возникали в течение относительно короткого периода времени (в пределах 6 мес) при формировании молочных комплексов. Кроме транспортного стресса, они были обусловлены наличием ПИ нетелей, инфицирующих других животных в группе во время транспортировки и по прибытию в страну-импортер. Такие нетели подвержены риску рождения ПИ потомства, служащего в дальнейшем в качестве постоянного эндогенного источника вируса в стаде для телят и маточного поголовья. Этот период может затягиваться до 2-3 лет в зависимости от условий содержания животных, их размещения, длительности комплектования помещений, количества поступающих животных и источников, откуда их завезли, частоты ввода новых животных, совместного содержания стельных животных с молодняком, отсутствия специфической профилактики болезни.
По мере увеличения доли животных с иммунитетом к вирусу, снижалось количество восприимчивых к заражению особей и инцидентность болезни. В связи с этим со временем менялось и ее проявление: от репродуктивных проблем к болезням телят. Однако наличие постоянного эндогенного источника возбудителя обеспечивало непрерывность эпизоотического процесса, при котором происходило формирование стационарно неблагополучных очагов по ВД-БС КРС с низкой инцидентностью репродуктивной патологии.
Большое значение при формировании стационарного неблагополучия по ВД-БС КРС и непрерывности эпизоотического процесса имеет замкнутый цикл «мать—теленок», приводящий к рождению персистентно инфицированного потомства. Определение маркеров активной циркуляции возбудителя в стаде играет большую роль при планировании и реализации программ контроля болезни.
Таким образом, мы определили основные половозрастные группы крупного рогатого скота, которые могут использоваться в качестве «индикаторных», или «маркерных», отражающих циркуляцию вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек на молочных комплексах с наличием высокопродуктивного импортного скота. При завозе животных на партию нетелей в 100 голов может приходиться в среднем 8,8 % ПИ вирусоносителей, а рожденных от них телят - 5.5%. В течение последующих лет наиболее восприимчивы к инфицированию телки первого поколении, реагирующие в 71,4 % случаев сероконверсией к вирусу через 1-3 месяцев после искусственного осеменения, а также нетели. Этот показатель может быть индикатором циркуляции вируса в молочном стаде и риска рождения персистентно инфицированных телят, служащих постоянным источником возбудителя инфекции в стаде. Количество ПИ животных среди коров второго-третьего отелов и рожденных от них телят значительно снижается по мере повышения иммунного статуса стада.
Изучение противовирусной активности Рибавирина липинт и Реаферона-ЕС-липинт в инфицированной нецитопатогенным биотипом вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота культуре клеток
Нецитопатогенный биотип вируса ВД-БС КРС часто является контаминан-том биологических продуктов. Использование в работе инфицированных этим биотипом вируса культур клеток может послужить причиной ложных результатов диагностических исследований, а живые противовирусные вакцины, изготовленные при использовании таких культур клеток, могут быть потенциальным источником вируса ВД-БС КРС для восприимчивых животных [2, 177].
Не смотря на то, что в литературе описано много соединений с противовирусной активностью в отношении вируса ВД-БС КРС in vitro, исследования по их использованию для устранения контаминации культур клеток носят ограниченный характер. Так, сообщалось об успешном применении для этой цели ароматических катионных молекул, в том числе соединения DB772 [120-121]. Кроме того, для этого было проведено изучение комплексного использования одновременно двух препаратов: Рибавирин и ИНФ-, а также производных иминосахаров. Результаты исследований показали снижение вирусной нагрузки после обработки препаратами. Сообщалось, что при одновременном применении препаратов Ри-бавирин и ИНФ- в дозах 0,02 мг/мл и 100 МЕ/мл достигается выраженный противовирусный эффект, количество вирусной РНК в образцах супернатанта обработанной культуры снижалось до уровней, не выявляемых методом ОТ-ПЦР уже после второго пассажа [107].
Перед проведением опыта культуру клеток КСТ и используемые в работе биологические препараты (химопсин, фетальная сыворотка крови) тестировали методом ОТ-ПЦР для исключения контаминации вирусом ВД-БС КРС. Все пробы показали отрицательный результат. Из флакона с хорошо сформированным 48-часовым монослоем культуры клеток удаляли ростовую среду, добавляли питательную среду и 0,5 мл суспензии, содержащей штамм Бор вируса ВД-БС КРС. Инфицированную культуру клеток содержали в обычных условиях в течение 3 пассажей, и вновь тестировали методом ОТ-ПЦР. Результаты реакции показали присутствие вируса ВД-БС КРС в культуре клеток.
Для разработки способа освобождения культуры клеток КСТ, инфицированной нецитопатогенным биотипом вируса ВД-БС КРС (штамм Бор), использовали комплексное применение двух препаратов: Рибавирин-липинт и Реаферон-ЕС-липинт. Как известно инфицирование перевиваемой культуры клеток нецито-патогенным биотипом вируса ВД-БС КРС не вызывает видимых изменений в ней (рисунок 1).
Перевиваемая линия культуры клеток коронарных сосудов теленка (КСТ). Увеличение 1000х, А – неинфицированная, В – инфицированная нецитопатогенным штаммом Бор вируса ВД-БС КРС.
Максимально переносимые концентрации препаратов Реаферон-ЕС-липинт и Рибавирин-липинт для культур клеток MDBK и КСТ были определены ранее. Они составили 0,05 мг/мл для Рибавирина-липинт и 30000 МЕ/ мл для Реаферо-на-ЕС-липинт [30].
Оба препарата разводили физиологическим раствором непосредственно перед использованием и добавляли к ростовой питательной среде, которую использовали вместо обычной ростовой среды при пересеве инфицированной вирусом ВД-БС КРС культуры клеток КСТ. Культуру клеток пересевали через каждые 48 часов. При каждом пассаже отбирали образцы культуры клеток и хранили их при минус 20оС до исследования посредством ОТ-ПЦР. Препараты добавляли к ростовой питательной среде на протяжении 12 последовательных пассажей. Затем культуру клеток продолжали культивировать в обычных условиях, используя ростовую питательную среду без тестируемых препаратов в течение еще 18 последовательных пассажей. Контроль эффективности обработки инфицированной культуры клеток препаратами осуществляли методом полимеразной цепной реакции в двух вариантах: электрофорезном и в режиме реального времени. Результаты ОТ-ПЦР с проведением электрофореза показали, что все отобранные в ходе опыта пробы содержали РНК вируса ВД-БС КРС. Затем было выбрано 6 образцов обработанной препаратами культуры клеток, которые исследовали методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
Результаты исследования представлены на рисунке 2.
Как видно из данных, представленных на рисунке 2, в течение периода обработки культуры клеток, инфицированной НЦП биотипом вируса ВД-БС КРС одновременно препаратами Рибавирин-липинт и Реаферон-ЕС-липинт в концентрациях 0,05 мг/мл и 30000 МЕ/мл, соответственно, титр вируса ВД-БС КРС постепенно снижался. Однако после прекращения добавления препаратов к ростовой среде, титр вируса вернулся к перваначальному уровню.
Не смотря на постепенное снижение титра вируса, его концентрация в пробах культуры клеток оставалась высокой даже после 12 пассажей с препаратами (3,75 log10 ТЦД50/мл), что не соответствует данным других авторов, которые отмечали снижение титра вируса ниже значений, выявляемых в ОТ-ПЦР после 2 пассажей с препаратами Рибавирин и ИНФ- [107]. Разница в полученных результатах исследований может быть связана с использованием препаратов разных производителей, а также с различиями тестируемых штаммов вируса ВД-БС КРС. Кроме того, авторы статьи в работе исследовали только супернатант культуры клеток, что позволило им оценить снижение только внеклеточной формы вируса. Для контроля над внеклеточной и внутреклеточной формами вируса мы определяли относительную вирусную нагрузку одновременно в супернатанте и в самой культуре клеток.
Таким образом, полученные результаты проведенного опыта свидетельствуют о том, что применение препаратов Рибавирин-липинт и Реаферон-ЕС-липинт позволяет лишь снизить вирусную нагрузку на культуру клеток, но не приводит к ее освобождению от персистентной инфекции нецитопатогенным биотипом вируса ВД-БС КРС.
Последовательная обработка культуры клеток препаратами Рибавирин-липинт и Реаферон-ЕС-липинт на протяжении 12 пассажей привела к значительному снижению титра вируса ВД-БС КРС, однако этот эффект оказался кратковременным и через 18 последовательных пассажей после отмены препаратов титр вируса достиг первоначального значения.
Обсуждение полученных результатов
В последние годы в России возросло количество молочных хозяйств с большим поголовьем (более 1500 дойных коров) высокопродуктивного племенного скота. Часто животных завозят из-за рубежа. Введение новых животных с неизвестным иммунным статусом в стадо создает риск распространения инфекционных возбудителей в группах животных, не имеющих иммунитета к новому патогену, что приводит к вспышкам заболеваний и снижению экономических показателей хозяйства. Часто таким возбудителем является вирус ВД-БС КРС. Наибольший урон приносят репродуктивные расстройства, вызванные вирусом ВД-БС КРС: бесплодие, многократные осеменения, воспаление матки, эмбриональная смертность, аномалии развития плода, аборты, рождение мертвых телят [25, 27]. Возбудитель также способен вызывать внутриутробные инфекции, приводя к рождению ПИ телят, которые являются главным источником возбудителя и поддерживают циркуляцию вируса в стаде.
Вирус ВД-БС КРС широко распространен в животноводческих хозяйствах Российской Федерации [14, 20, 29, 76]. Мы изучили распространение вируса ВД-БС КРС на крупных молочных комплексах Тюменской области и определили основные половозрастные группы животных, подверженных риску инфицирования вирусом. Установлено, что при завозе животных из разных источников на партию нетелей в 100 голов приходится в среднем 8,8 % ПИ животных и 5,5 % рожденных от них ПИ телят. Наиболее восприимчивы к вирусу телки первого поколения, которые в нашем исследовании реагировали сероконверсией к вирусу в 71,4 % случаев. Массовые репродуктивные проблемы, связанные с вирусом возникали в первые 6 месяцев после формирования молочных комплексов. Этот период мог увеличиваться в зависимости от сроков комплектования ферм, условий содержания, числа поступающих животных, источника их поступления, совместного содержания разных групп животных, отсутствия вакцинации и т.д. По мере увеличения числа животных с иммунитетом к вирусу снижалась доля восприимчивых к заражению и инцидентность болезни, частота репродуктивных патологий, заболевание телят. Наличие постоянного эндогенного источника возбудителя обеспечивало непрерывность эпизоотического процесса, при котором создавались стационарно неблагополучные очаги по ВД-БС КРС с низкой инцидентностью репродуктивной патологии. При исследовании биологического материала геном вируса обнаруживали в среднем в 15,6 % проб. Наиболее часто геном вируса выявляли в абортированных плодах (в 29-40% от числа исследованных проб). У абортировавших животных в большинстве случаев выявляли сероконверсию к вирусу через 6-8 недель после аборта.
В борьбе с ВД-БС КРС основное внимание уделяется обнаружению и выбраковке ПИ животных, а также профилактической вакцинации. Однако эти меры не гарантируют полной защиты стада от заражения вирусом ВД-БС КРС. На эффективность вакцинации оказывают влияние условия содержания животных, сопутствующие заболевания и индивидуальные особенности животного. Кроме того, животное может быть инфицировано вирусом сразу после вакцинации, до выработки активного иммунитета, особенно, если это время сопровождается стрессами, такими как перегруппировка стада, транспортировка и т.д. Иммунитет к вирусу ВД-БС КРС не является пожизненным и длительность его после вакцинации ограничена, этим обусловлена необходимость ежегодных ревакцинаций. Имму-нодефицитные состояния различного происхождения снижают эффективность вакцинации и способствуют распространению возбудителя в стаде. Иммунизация персистентно инфицированных животных не предотвращает их вирусносительст-во, они остаются источником возбудителя инфекции в стаде [10]. Для усиления противовирусной защиты можно применять препараты различных классов, обладающие этиотропным противовирусным действием и корректирующие иммунный ответ у животных. Обнаружены соединения разных фармакологических групп, эффективные в отношении ВД-БС КРС in vitro. Помимо хорошо известных противовирусных мишеней (RdRp, IMPDH, NS3), были открыты новые мишени, механизм действия на которые еще недостаточно изучен, такие как протеин p7. Однако в животноводстве до сих пор нет доступных для применения при ВД-БС КРС эффективных противовирусных препаратов [166]. Высокая стоимость противовирусных соединений и вызываемые ими побочные эффекты являются основными причинами, по которым они не используются в лечении сельскохозяйственных животных. Необходим поиск новых малотоксичных соединений с невысокой себестоимостью, эффективных в отношении вируса ВД-БС КРС.
Нами была исследована противовирусная активность препаратов разных фармакологических групп в условиях in vitro: 42 соединений искусственно синтезированных рибонуклеаз (иРНКаз), трех препаратов на основе бактерии Bacillus subtilis, трех растительных экстрактов и одного препарата, полученного на основе пекарских дрожжей.
Известно, что РНКазы обладают противовирусными свойствами. Считается, что эти соединения, на ряду с антисмысловыми олигонуклеотидами и рибозима-ми, действуют целенаправленно на геном вируса [46]. На сегодняшний день больше всего сведений накоплено об РНКазе А, которая нашла клиническое применение в качестве противовирусного препарата на ранних стадиях лечения клещевого энцефалита человека. Отсутствие препаратов на основе РНКаз объясняется рядом недостатков, присущих природным ферментам – большой молекулярный вес и, как следствие, высокая аллергенность, низкая стабильность, узкий интервал условий, в которых фермент функционирует, сложность в получении гомогенных препаратов из природных источников. Кроме того, РНКаза А не способна проникать внутрь инфицированной вирусом клетки из-за своей большой молекулярной массы, поэтому она нейтрализует только внеклеточные вирионы. Искусственно синтезированные РНКазы лишены этих недостатков. Из исследованных нами иРНКаз, противовирусный эффект был установлен у 4 соединений (B-3, B-5, A-367, BEA-171), они подавляли активность вируса на 1,91-3,08 log10 ТЦД50/мл. Токсичность этих соединений для используемых в работе культур клеток была ниже, чем у других исследованных иРНКаз. Таким образом, в дальнейших исследованиях по поиску и разработке противовирусных иРНКаз следует также стремиться снизить их токсичность для живых клеток.
Терапия лекарственными растениями широко применяется в ветеринарной практике [4, 7, 66-68]. Она характеризуется доступностью, дешевизной, безвредностью, физиологичностью и лечебно профилактической эффективностью [3]. Противовирусная активность обнаружена у многих активных веществ, выделенных из хвойных пород деревьев. Результаты наших исследований установили ви-русингибирующую и профилактическую противовирусную активности у препарата на основе углекислотного экстракта пихты сибирской, который подавлял репродукцию вируса на 2,00 и 2,75 log10 ТЦД50/мл, соответственно. Препарат № 1 подавлял репродукцию вируса лишь на 0,75 log10 ТЦД50/мл. Разная противовирусная активность препаратов может быть связана с особенностями производства, а также различным содержанием активных веществ в используемом для производства препаратов сырье.
Растение Boerhavia diffusa широко используется в фитотерапии в качестве диуретического, отхаркивающего, усиливающего моторику желудка средства [88]. Активное вещество dehydrorotenoid boeravinone H, выделенное из этого растения проявило ингибирующую активность в отношении вируса гепатита С человека [91]. Установлено, что в ряде случаев терапевтический эффект растительных препаратов обусловлен не только основным действующим веществом, а совокупностью содержащихся в растении веществ [8]. У гликопротеина BDP-30, выделенного из экстракта Boerhavia diffusa, выявлена противовирусная активность в отношении вируса табачной мозаики [196]. Мы исследовали общую противовирусную активность экстракта Boerhavia diffusa и определили, что он обладает ви-русингибирующей активностью в отношении вируса ВД-БС КРС и подавляет репродукцию вируса на 2,25 log10 ТЦД50/мл. Данный экстракт оказывал токсическое влияние на культуру клеток КСТ, его максимально переносимая концентрация составила 125 мкг/ мл. Снижение токсичности и определение активных противовирусных веществ растения Boerhavia diffusa могли бы улучшить эффективность данного препарата, на что должны быть нацелены будущие исследования.