Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 12
1.1 Общие сведения об инфекционном бронхите кур 12
1.1.1 Биология вируса ИБК 13
1.1.2 Морфология вируса ИБК 14
1.1.3 Строение вируса 15
1.1.4 Антигенная вариабельность 16
1.2 Патогенез возбудителя ИБК 18
1.2.1 Особенности репликации отдельных штаммов вируса ИБК 19
1.3 Механизм репликации вируса в организме 21
1.4 Эпизоотология ИБК 24
1.5 Клинические признаки при ИБК 26
1.5.1 Респираторный синдром 26
1.5.2 Репродуктивный синдром 27
1.5.2.1 Факторы, влияющие на патогенность вируса ИБК для репродуктивных органов
1.5.2.1.1 Возраст птицы 28
1.5.2.1.2 Вирулентность вируса 28
1.5.3 Нефрозо-нефритный синдром 29
1.5.3.1 Вирулентность вируса 31
1.6 Иммунитет при ИБК 31
1.7 Формирование иммунного ответа при ИБК 31
1.7.1 Иммуногенные белки вируса ИБК 31
1.7.2 Врожденный иммунитет 32
1.7.3 Приобретенный иммунитет 33
1.8 Патологическая анатомия и гистология в диагностике ИБК 37
1.9 Специфическая профилактика ИБК 39
1.10 Диагностика ИБК 42
1.10.1 Молекулярные методы диагностики 43
1.10.3 Вирусовыделение в КЭ, в ТОК, в КК 44
1.10.4 ТОК в диагностике ИБК 44
1.11 Заключение по обзору литературы 45
2. Собственные исследования 47
2.1 Материалы и методы 47
2.1.1 Вирус ИБК 47
2.1.2 Эмбрионы кур 47
2.1.4 Подопытная птица 47
2.1.5 Патологический материал 48
2.2 Методы исследований 48
2.2.1 Культивирование вируса 48
2.2.2 Определение инфекционной активности вируса 49
2.2.3 Вскрытие птиц и отбор проб патологического материала 49
2.2.4 Полимеразная цепная реакция 50
2.2.5 Органная культура трахеи (трахеальная органная культура -ТОК)
2.2.6 Оценка патогистологических изменений в трахее и в почках
2.2.7 Обработка результатов экспериментов 52
3 Результаты исследований 53
3.1 Применение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для опосредованной оценки инфекционного титра вируса ИБК
3.2 Изучение развития вируса ИБК в организме куриного эмбриона
3.3 Изучение инфекционных свойств различных штаммов вируса ИБК для СПФ-эмбрионов и ТОК
3.4 Патогенез вируса инфекционного бронхита кур 66
3.4.1 Диссеминация вируса в организме цыплят по результатам ПЦР
3.4.2 Патологоанатомические и гистологические изменения в почках и трахеях птиц, вызванные различными штаммами вируса ИБК
3.4.3 Патогенетическое действие и репродукция штамма QX вируса ИБК в организме цыплят при различных способах заражения
4 Обсуждение результатов исследований 83
5 Заключение 97
5.1 Выводы 97
5.2. Практические предложения 98
6 Список литературыq
- Антигенная вариабельность
- Подопытная птица
- Изучение развития вируса ИБК в организме куриного эмбриона
- Патогенетическое действие и репродукция штамма QX вируса ИБК в организме цыплят при различных способах заражения
Антигенная вариабельность
Несколько штаммов ИБК выделены из клоакальных мазков, экскрементов и миндалин слепой кишки [46, 47, 154]. Эксплантанты из некоторых кишечных тканей показаны как среда для выращивания вируса ИБК in vitro [62, 64, 100]. В нескольких работах в тканях пищевода обнаруживали максимальное количество вируса при инфицировании кишечным изолятом ECV2 вируса ИБК [154], а также вирусом, относящимся к серотипу 793/В [108]. Мазки из пищевода также использовали для индикации вируса ИБК в ПЦР. Однако осталось не выясненным, действительно ли вирус размножался в пищеводе, или он попадал туда из трахеи механическим путем.
Вирус ИБК также выделяли из железистого желудка, двенадцатиперстной кишки и тонкого кишечника [49, 154]. Darbyshire et al. [100] показали, что вирус ИБК хуже размножался в тканях железистого желудка in vitro, чем в тканях респираторного тракта и в яичниках. Тем не менее тип клеток для размножения вируса в тканях железистого желудка достоверно не установлен, но, вероятно, это эпителиальные клетки.
Напротив, в тканях толстого кишечника репликация вируса ИБК происходит в клетках, подобных гистиоцитам и лимфоидным клеткам, расположенным в миндалинах слепой кишки [172]. С помощью реакции иммунофлуоресценции показано размножение вируса в ворсинках эпителиальных клеток в подвздошной и прямой кишках [49, 108]. Хотя вирус ИБК имеет обширный тропизм, для органов желудочно-кишечного тракта не описаны явные гистологические изменения.
Вариантный штамм вируса ИБК G классифицирован как энтеротропный, благодаря его более длительному присутствию в тканях кишечника, по сравнению с респираторными тканями [112]. Недавно обнаружилось, что вариантный штамм серотипа 793/В вируса ИБК был более энтеротропный, чем пневмотропный, и даже ассоциировался с диареей у бройлеров [108]. Очевидно, что работами по репликации вируса ИБК в кишечнике пренебрегают, потому что штаммы вируса ИБК не демонстрируют энтеропатогенность.
MacDonald et al. [156] сообщали, что вследствие зобной инокуляции цыплят вакцинами из штаммов Н-52 и Н-120, вирус редко выделялся из кишечника или любых других висцеральных тканей, и антительный ответ не обнаруживался. Тем не менее почки проявляли устойчивость к внутривенному контрольному заражению. Более интенсивное изучение орального инфицирования энтеротропными штаммами ИБК или двойного заражения вирусом и другими кишечными патогенами, такими, как сальмонеллы, кокцидии или ротавирус, может дать больше информации о влиянии репликации вируса ИБК на кишечник.
Способность штаммов ИБК выживать при низком рН в присутствии пищеварительных ферментов и желчных солей может быть результатом кишечной репликации. Otsuki et al. [170] показали, что некоторые штаммы несут большие потери в титрах, когда выдерживаются 3-4 часа при рН 3,0, но другие, более устойчивые, штаммы выделить из кишечника не удалось. Ambali & Jones [50] сравнили штамм М41 с энтеротропным вариантом (G). Оба вируса имели одинаковую чувствительность к трипсину, но вариант G показал в 50 раз большую устойчивость к таирогликохолату натрия, что могло бы частично объяснить его способность к репликации в кишечнике.
Вирус ИБК выделялся из гардеровой железы [108, 117, 188], и клетки, положительные к вирусу ИБК, обнаруживали в строме железы при помощи иммунофлуоресцентного окрашивания [188]. Интраокулярная вакцинация привела к развитию массовой инфильтрации лимфоцитов, к повышению количества клеток в плазме крови [101, 161, 187] и десквамации тубулярного эпителия в гардеровой железе с восстановлением через 14 дней после вакцинации [188]. Увеличение числа плазматических клеток и развитие лимфоидной ткани [162] также наблюдалось в слезной железе после вакцинации.
Вирус ИБК также выделяли из бурсы [49, 112], и, вследствие экспериментального заражения штаммами Н52 и HI20 наблюдались явные гистологические повреждения [155, 159]. Хотя вирус ИБК выделен из ряда других тканей, таких, как печень [47, 49] и селезенка [168], не подтверждена его связь с каким-либо функциональным изменением. Вирус ИБК выделяли также из спермы и яиц [168].
Репликация и транскрипция РНК коронавируса происходит в цитоплазме инфицированных клеток путем почкования (рисунок 2). Вирион коронавируса прикрепляется к рецептору клетки-хозяина с помощью шипа гликопротеина и, в зависимости от штамма вируса, протеин шипов вириона гликозилируется во время трансляции и транспортируется в аппарат Гольджи (АГ). Вирионы накапливаются в пузырьках гладкой эндоплазматической сети, прежде чем освободиться [13, 39].
Вирионы содержат три основных структурных белка S, N, и М и минорный оболочечный белок sM или Е. Молекулы основного фосфопротеина N, взаимодействуя с геномной РНК, образуют протяженный нуклеокапсид со спиральной симметрией, диаметром 9-11 нм. Нуклеокапсид окружает липопротеиновая оболочка, которая формируется из ШЭР (шероховатый эндоплазматический ретикулум) или АГ зараженных клеток. Гликопротеин М -это трансмембранный белок, довольно глубоко погруженный в оболочку. На наружной поверхности липидного бислоя оказывается лишь небольшой, гликозилированный N-концевой участок молекулы белка [39, 88]. Предполагают, что гликопротеин М способствует включению нуклеокапсида в оболочку вириона при почковании.
Гликопротеин-предшественник S (180-200 кДа) является структурным белком пепломеров. Посттрансляционно он нарезается протеазами на 2 части гликопротеины S1 и S2. Небольшая его часть погружена в липидный бислой, а большая часть молекулы находится снаружи. Гликопротеин S1 содержит основные антигенные детерминанты, индуцирующие синтез серотипспецифических и вируснейтрализующих антител, а также играет роль антирецептора, с помощью которого вирусная частица прикрепляется к рецепторам клетки и вызывает слияние мембран [39, 72].
При трансляции гликопротеин S включается в мембрану ШЭР и гликозилируется путем переноса олигосахаридов на аспарагиновые остатки растущей полипетидной цепи [12, 39, 82]. А в аппарате Гольджи или на плазматической мембране белок S расщепляется протеазами клетки-хозяина на две большие субъединицы S1 (90 кДа) и S2 (84 кДа) [39, 72], что является необходимым условием для проявления инфекционности вируса [39, 112].
Было установлено, что гликопротеин S переносится на плазматическую мембрану и экспонируется на поверхности инфицированных клеток, что может делать клетки чувствительными к лизису под действием противовирусных антител и комплемента [39, 82].
Гликопротеин М также синтезируется на полисомах, связанных с мембранами, однако по процессингу и типу включения он отличается от большинства других вирусных гликопротеинов [39, 183].
Коронавирусы обладают некоторыми уникальными особенностями транскрипции РНК, состава белков и механизма сборки вирионов. Коронавирусы прикрепляются к рецепторам клеток-мишеней своими пепломерами [127].
Вирионы коронавирусов образуются путем почкования от мембран ШЭР и АГ. Нити нуклеокапсидов выстраиваются в месте почкования на цитоплазматической поверхности этих мембран в упорядоченный ряд на участках, содержащих вирусные гликопротеины. На мембранах ШЭР или АГ
Подопытная птица
Для специфической профилактики ИБК используют живые и инактивированные вакцинные препараты.
Живые вакцины против инфекционного бронхита применяются в США, Нидерландах, Италии, Франции, Германии, Чехии и многих других странах мира. Готовят эти вакцины из аттенуированных штаммов вируса инфекционного бронхита, относящихся к серотипам Массачусетс и Коннектикут. К серотипу Массачусетс относятся 4 вакцинных штамма: Н-120, адаптированный к куриным эмбрионам в результате 120 серийных пассажей; Н-52, пассированный на эмбрионах в течение 52 пассажей; NIAC и 82828. К серотипу Коннектикут относится слабопатогенный вакцинный штамм L-2 [6, 8, 9, 14].
Для изготовления живых вакцин используют штаммы вируса, ослабленные пассированием в эмбрионах кур. Все живые вакцины различают по степени и стабильности аттенуации. Длительное пассирование вируса в эмбрионах кур снижает его вирулентность, реактогенность и иммуногенность. Однако некоторые штаммы вируса способны восстанавливать свою вирулентность при пассировании на цыплятах, что должно приниматься во внимание при разработке живых противовирусных вакцин. Живые вакцины применяют для создания раннего и непродолжительного иммунитета, с учётом продолжительности производственного цикла, в основном на бройлерах и для первичной вакцинации молодняка яичных и родительских стад [2, 6, 14, 37]. Живые вакцины применяют интраназально, интраокулярно, с питьевой водой, методом крупнокапельного распыления, аэрозольно.
Однократная вакцинация не предохраняла цыплят от заражения вирулентным вирусом. Двукратная вакцинация обеспечивала частичную устойчивость цыплят к заражению инфекционным бронхитом [14, 156].
Используемые в составе инактивированных вакцин штаммы вируса должны быть менее аттенуированы и индуцировать выработку более прочного и продолжительного иммунитета, их применяют для повторных вакцинаций яичных и родительских стад. Инактивированные вакцины различаются по способу инактивации, компонентному составу и используемому адъюванту [10, 14, 20].
С целью специфической профилактики ИБК применяют комплексную систему, основанную на 2-3 - кратной иммунизации живой вакциной цыплят в возрасте 1-14 недель, срок первой иммунизации зависит от уровня материнских гуморальных антител, и однократной прививки инактивированной вакциной в возрасте 14-18 недель. Для борьбы с инфекцией в неблагополучных хозяйствах используют метод, основанный на многократном применении (1 раз в месяц) живой вакцины из штамма «Н-120» .
В связи с высоким антигенным многообразием вируса штаммы, используемые для иммунизации, должны отбираться с учётом эпизоотической обстановки в регионе. Во многих птицеводческих хозяйствах США, Франции, Голландии, Германии используют последовательную иммунизацию поголовья живыми вакцинами из разных серотипов вируса, максимально увеличивая спектр иммунной защиты у птиц, однако при этом увеличивается риск возникновения новых штаммов вируса в результате их одновременной циркуляции в хозяйстве и рекомбинации генетического материала между ними.
Вакцины против ИБК из штаммов серотипа Массачусетс используют наиболее широко. К ним относятся такие вакцинные штаммы, как «Н-120», «Н-52», «Ма5» «М-33», «82828», «NIAC» [14, 33].
В Российской Федерации наиболее часто для изготовления живых вакцин используют штамм «Н-120», а штаммы «Н-52», «М41», «Чапаевский» - для изготовления инактивированных вакцин. Из числа применяемых моновакцин вакцины на основе штаммов серотипа Массачусетс имеют наиболее широкий спектр антигенной активности и индуцируют выработку напряжённого иммунитета [1, 14, 22].
Живые вакцины, изготовленные на основе штамма «Н-120», обладают рядом преимуществ, к которым относятся: высокая иммуногенная активность, ареактогенность, авирулентность, широкий спектр антигенной активности.
Штамм «Н-52» более иммуногенен, т. к. менее аттенуирован, обладает более выраженной реактогенностью, вследствие чего его используют для повторной вакцинации в составе живой вакцины или в составе инактивированных вакцин [14, 52].
За рубежом широко используют бивалентные аттенуированные вакцины, сочетающие в себе штаммы вируса различных серотипов, которые обладают более широким спектром антигенной активности и стимулируют выработку более напряжённого и продолжительного иммунитета. Вместе с тем многие исследователи считают, что комбинирование в одном препарате нескольких живых штаммов вируса может вызывать рекомбинацию их генетического материала и приводить к возникновению новых штаммов вируса, обладающих оригинальными антигенными свойствами, не поддающимися специфической профилактике с помощью используемых вакцин [57].
В последние годы инактивированные вакцины находят всё большее применение. Применение инактивированного препарата позволяет полностью исключить возможность вспышки заболевания в результате реверсии аттенуированного вируса к исходному состоянию, избежать поствакцинальных осложнений, точно рассчитать дозу вводимого антигена, индуцировать и поддерживать определенный уровень гуморального иммунитета в течение периода роста птицы. Чаще используют эмульсионные и сорбированные инактивированные вакцины, их применяют индивидуально [14, 47].
Особенно широкое применение нашли ассоциированные инактивированные вакцины, содержащие в своём составе до 4 различных антигенов [14, 49]. Кроме вируса ИБК они могут включать в себя вирусы ньюкаслской болезни, синдрома снижения яйценоскости-76, болезни Гамборо и других возбудителей.
За рубежом проводятся работы по созданию генно-инженерной вакцины против ИБК. В течение ряда лет применение этих препаратов позволяло предотвращать вспышки заболевания. Однако в последние годы на ряде птицефабрик появились случаи заболевания ИБК вакцинированной птицы, что объясняется появлением новых, так называемых вариантных штаммов, антигенно отличающихся от используемого вакцинного штамма, а также усилением вирулентности вируса в процессе многократного одновременного пассирования на восприимчивом поголовье птиц [4, 5, 14].
В связи с большим антигенным разнообразием вируса ИБК применяемые на данный момент вакцины не могут обеспечить полной защиты восприимчивого поголовья от заражения вариантными штаммами вируса. Поэтому проводятся работы по выделению циркулирующих на территории России антигенно отличных от вакцинных штаммов вируса и созданию на их основе инактивированных полиштаммных вакцин. Использование инактивированных вакцинных препаратов, имеющих в своём составе несколько антигенно различных штаммов вируса, позволит существенно расширить спектр иммунной активности препарата. Использование в составе вакцины инактивированных вирусов позволит избежать рекомбинации генетического материала между ними и возникновения новых штаммов вируса.
Изучение развития вируса ИБК в организме куриного эмбриона
Изучение патогенеза заразных болезней практически невозможно без выявления путей проникновения микроорганизма и его распространения в организме хозяина.
Классическое представление о патогенезе ИБК [88] предполагает, что репликация вируса, попавшего в организм респираторным путем, осуществляется в эпителиальных клетках трахеи. Далее происходит генерализация инфекционного процесса, и вирус по лимфатической и кровеносной системам распространяется (диссеминирует) по организму птицы, поражая различные органы.
Однако очевидно, что на характер патогенеза заболевания существенное влияние может оказывать тропизм, присущий данному варианту возбудителя. В отношении вируса ИБК различия тропности штаммов [81, 88], вероятно, могут определять особенности патогенетической картины болезни.
Задачей настоящего этапа работы было сравнительное исследование хронологической диссеминации различных штаммов вируса ИБК (Н-120, QX и 4/91) в организме цыплят. Оценочным показателем тропности возбудителя считали его накопление в тканях определенных органов. Величину накопления вируса определяли опосредовано по уравнению {2} на основании оценки концентрации вирусного генома (Ct}, установленной в ОТ-ПЦР-РВ
В качестве подопытной птицы использовали выведенных из СПФ-эмбрионов кур клинически здоровых цыплят в возрасте 15 сут. Птиц содержали в клетках, оборудованных кормушками и поилками. Рацион кормления, температурный режим и освещенность помещений соответствовали зоогигиеническим нормам содержания птиц данной возрастной категории.
Соответственно исследуемым штаммам вируса были сформированы 3 опытные группы цыплят (Н-120; 4/91 и QX) по 50 голов и одна контрольная группа (30 голов). В опытных группах провели окуляро-назальное заражение. Для всех штаммов была принята одинаковая заражающая доза: 10 ЭИД50 в объеме 1 см3. В контрольной группе заражение не проводили. Во всех группах проводили ежедневны клинической осмотр птицы.
Через заданные интервалы времени из опытных групп отбирали по 3 цыпленка, а также по одному цыпленку из контрольной группы. Цыплят после эвтаназии подвергали патологоанатомическому исследованию.
При вскрытии у каждого цыпленка асептически отбирали образцы тканей дыхательной системы (трахеи и легкие), почки, миндалины слепой кишки и репродуктивных органов. Пробы заморажавали при -35С и использовали для детекции вирусного генома в ПЦР.
Клинические наблюдения. На 5-7 сут. после заражения во всех опытных группах наблюдали признаки респираторной патологии (кашель, трахеальные хрипы и носовые выделения). В группе QX у цыплят присутствовала слабость, заметное снижение аппетита и гибель 2 птиц на 5 сут после заражения.
Исследование диссеминации вируса в организме. На основании данных ПЦР исследовали распространение вируса в организме подопытных цыплят. В полученных образцах тканей различных органов, соответственно испытанным штаммам, в динамике определяли показатели Ct и проводили расчет прогнозируемых величин Т в размерности ЭИД50. Полученные результаты в виде диаграмм приведены на рисунке 6.
Представленные диаграммы иллюстрируют, что инфекционный процесс у всех исследуемых штаммов в большинстве случаев имел схожие черты. Прослеживалась начальная фаза (рост инфекционного титра), фаза максимального накопления и фаза снижения концентрации возбудителя (регрессия титра).
Однако, при сохранении общей картины, по количественным показателям штаммы имели различия. Вирус штамма Н-120 наиболее эффективно репродуцировался в респираторной системе. В других органах его воспроизводство было менее интенсивно. Особенно указанное отставание было заметно в тканях миндалин слепой кишки.
В почках после 7 сут постоянным превосходством обладал штамм QX. В миндалинах слепой кишки и репродуктивных органах интенсивность развития штаммов QX и 4/91 была приближенно одинаковой.
Возможно допустить, что у всех штаммов прогрессивные фазы инфекционного процесса в большей степени были зависимы от адаптированности вируса к данному типу ткани. Например, Н-120 явно доминировал в респираторных органах. При этом для QX более благоприятной зоной развития была ткань почек. Очевидно, что вариант QX, как и другие штаммы, начинал развитие в трахее, далее, достигнув тканей почек, там продемонстрировал наибольший пик накопления.
Регрессия прогнозируемых титров вируса, наблюдаемая для всех штаммов в основном через 7 сут после инфицирования, вероятно, являлась результатом развития иммунной реакции со стороны организма.
Исключение составляют процессы, зарегистрированные в миндалинах слепой кишки. В указанных органах количество генетического материала штаммов QX и 4/91 на протяжении всего эксперимента превосходило концентрацию продуктов репродукции штамма Н-120. При этом ожидаемые различия инфекционных титров относительно отмеченного штамма в среднем должны составлять более 2 порядков.
Анализ приведенных результатов показал, что для всех исследуемых штаммов вируса ИБК ткани респираторной системы птиц в начальной фазе развития инфекционного процесса являются наиболее благоприятной (элективной) зоной. В данной области организма на 5 сут после инфицирования ожидаемые по накоплению генетического материала прогнозируемые величины "lgT составили от 3,95 у штамма QX, до 5,00 у штамма Н-120. Последующий процесс вирусной диссеминации, очевидно, происходил как вторичное явление. Во всех остальных тканях максимальные оценки титров приходились на 7-е или 10-е сут.
По эффективности развития вне респираторной системы очевидным лидером следует считать штамм QX, который через 7-9 сут имел показатель "lgT до 4,33, 4,15 и 3,85 в почках, в миндалинах слепой кишки и в тканях репродуктивных органов, соответственно. При этом распространение в организме птицы штамма Н-120 было значительно менее выражено. В отмеченном временном интервале аналогичные оценки составили 3,29, 2,52 и 2,08. Промежуточное положение занял штамм 4/91.
Провели сравнительный анализ тропности исследуемых штаммов по отношению к изученным видам тканей. В качестве условного показателя, характеризующего относительную адаптированность штамма к определенному виду ткани, приняли величину логарифмической разности между ожидаемыми титрами вируса штамма Н-120 (референтный штамм) и хронологически соответствующим аналогом другого штамма. Соответствующий расчет проводили по формуле {4}:
Патогенетическое действие и репродукция штамма QX вируса ИБК в организме цыплят при различных способах заражения
На данном этапе исследований эмбрионы кур использовали в качестве модели, на которой был отработан и обоснован способ опосредованного определения накопления вируса ИБК. При этом была изучена и диссеминация возбудителя в различных частях эмбриона.
Установили, что инфекционная активность всех биоматериалов имела в той или иной мере выраженные три фазы. Фазу роста, которая для образцов ХАО и ЭЭЖ заканчивалась к 20 часам, а для образцов ТЭ и АЖ - к 50 часам культивирования вируса, фазу стабилизации, продолжавшуюся для большинства образцов до 70 -80 часов, и далее фазу угасания, где, за исключением образца ТЭ, происходило видимое снижение значений инфекционности.
Наибольшее накопление вируса было показано в образцах ХАО и ЭЭЖ, по абсолютным значениям титров (6,3 -6,5 lgIHI,5o/0,lcM3) после 20 часов культивирования. В образцах АЖ максимум накопления (6,48 " ЦД5о/0,1мл) наблюдали только после 60 часов. В образцах ТЭ накопление не превышало 5,5 ВДД50/0,1мл.
Однако после 35 часов в ткани ХАО концентрации вируса снижалась, а в ЭЭЖ концентрации вируса увеличивалась. Отсюда было сделано заключение, что вирус начал покидать клетки ХАО и накапливаться в ЭЭЖ.
Таким образом, было установлено, что вероятной элективной зоной развития вируса ИБК в эмбрионе является ткань хориоаллантоисной оболочки. В этом случае «резервуаром» накопления вируса является экстраэмбриональная жидкость. Ткани тела эмбриона, очевидно, не являются элективной зоной развития данного типа вируса.
Важно отметить, что развитие вируса в ткани ХАО эмбриона (в том числе на пике накопления) не сопровождается видимыми макроскопическими изменениями структуры самой ткани. При этом вирус заметно воздействует на морфологию тела эмбриона ( рисунок 1). В биологическом смысле это означало, что, по крайней мере, начальные процессы репродукции вируса в эмбрионе не связаны с цитопатическими процессами в ткани ХАО. Поскольку для культивирования вируса ИБК чаще всего используют развивающиеся эмбрионы кур, вопрос о месте развития вируса ИБК в эмбрионе является важным как в научном плане для понимания тропизма вируса ИБК, а также и в технологическом - для понимания того, какой вируссодержащий материал лучше использовать для изготовления биопрепаратов (вакцин или диагностикумов).
В практическом аспекте полученные в ходе проведенных исследований результаты позволили обоснованно судить об оптимизации процедуры культивирования вируса ИБК на СПФ-эмбрионах кур. А именно было доказано, что наибольшее количество вирусного материала будет находиться в составе экстраэмбриональной жидкости через 40 часов культивирования.
Изучение инфекционных свойств различных штаммов вируса ИБК для СПФ-эмбрионов и тест-системы ТОК. В задачу данного этапа работы входило исследование инфекционных свойств нескольких штаммов вируса ИБК по отношению к различным чувствительным тест-ситемам. С этой целью определяли инфекционную активность вируса ИБК штаммов Н-120, М-41 и D-274 в тест-системах СПФ-эмбрионов кур и переживающих эксплантантов ТОК.
Установили, что все изученные штаммы, не зависимо от абсолютных средних значений титра (Т), имели относительно большую инфекционную активность в отношении СПФ-эмбрионов (lgTi), чем в отношении ТОК (lgT2).
Различия в инфекционной активности штаммов по отношению к исследуемым тест-системам оценивали показателем d=lgTi - lgT2. Данная величина рассматривалась как показатель относительной инфекционности вируса. Для штаммов Н-120, М-41 и D-274 оценки d составили статистически достоверные значения 0,52±0,16 (р 0,02), 0,50±0,18 (р 0,05) и 0,85±0,17 (р 0,002), соответственно. Однако между собой приведенные величины достоверно не различались. На этом основании был сделан вывод, что относительная инфекционность вирусных штаммов была приблизительно одинаковой.
Средняя величина логарифмической разницы инфекционных титров вируса для СПФ-эмбрионов и тест-системы ТОК составила значение d±m=0,62±0,10. Указанная оценка была принята в качестве корректирующего коэффициента.
Отсутствие статистической разницы в оценках относительной инфекционности штаммов и установленный средний корректирующий коэффициент d позволяли считать, что как СПФ-эмбрионы кур, так и эксплантанты ТОК могут быть использованы в качестве чувствительных тест-систем при работе со всеми изучаемыми штаммами вируса ИБК.
Диссеминация вируса в организме цыплят по результатам ОТ-ПЦР-РВ. Стандартная схема патогенеза заразных болезней описывает следующие этапы: путь проникновения возбудителя в организм хозяина ("ворота инфекции"), распространение (диссеминации) инфекта в организме и патологии в поражаемых органах (органах-мишенях).
Патогенетическая картина при ИБК [88] предполагает, что проникновение вируса в организм птицы преимущественно происходит аэрогенно и первичная атака возбудителя направлена на эпителиальные клетках трахеи. Далее происходит генерализация инфекционного процесса и вирус по лимфатической и кровеносной системам распространяется (диссеминирует) по организму птицы, поражая различные органы.
При этом на характер патогенеза заболевания существенное влияние может оказывать тропизм, присущий данному варианту возбудителя. В отношении вируса ИБК различия тропности штаммов [81, 88], вероятно, могут определять особенности патогенетической картины болезни.
На данном этапе работы было проведено сравнительное исследование хронологической диссеминации различных штаммов вируса ИБК (Н-120, QX и 4/91) в организме цыплят. Оценочным показателем тропности возбудителя считали его накопление в тканях определенных органов. Величину накопления вируса определяли опосредовано по уравнению {2} на основании оценки концентрации вирусного генома (Ct}, установленной в ОТ-ПЦР-РВ.