Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 12
2.1 Характеристика возбудителя бешенства 12
2.2 Эпизоотология бешенства и ситуация по бешенству в России и в мире 19
2.3 Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения при бешенстве 27
2.4 Лабораторная диагностика 32
2.5 Профилактика и меры борьбы. 37
2.6 Заключение по обзору литературы 39
3 Собственные исследования 41
3.1 Материалы и оборудование 41
3.1.1 Пробы патологического материала. 41
3.1.2 Штаммы вируса бешенства. 41
3.1.3 Происхождение проб головного мозга. 42
3.1.4 Сывороточные стандарты. 42
3.1.5 Нуклеотидные последовательности из базы данных GenBank. 42
3.1.6 Праймеры. 42
3.1.7 Животные. 42
3.1.8 Перевиваемые культуры клеток. 43
3.1.9 Реактивы, буферные смеси и ферменты. 43
3.1.10 Приборы и оборудование. 44
3.1.11 Расходные материалы 45
3.2 Методы исследований. 45
3.2.1 Отбор проб патологического материала 45
3.2.2 Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) или метод флуоресцирующих антител (МФА). 46
3.2.3 Выделение вируса бешенства на белых мышах (биологическая проба) 47
3.2.4 Выделение вируса бешенства в культуре клеток. 47
3.2.5 Определение аналитической чувствительности метода выделения вируса бешенства в культуре клеток нейробластомы мыши и на белых мышах 47
3.2.6 Определение инфекционной активности культуральной вирусной суспензии изолятов ВБ 3.2.7 Культивирование и титрование референтного штамма CVS ВБ в культуре клеток 48
3.2.8 Определение вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в сыворотках крови животных в реакции нейтрализации в культуре клеток BHK-21 (FAVN) 48
3.2.9 Определение вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в сыворотках крови диких плотоядных животных в реакции нейтрализации в культуре клеток BHK-21 (RFFIT). 49
3.2.10 Ускоренное определение антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови диких плотоядных животных в реакции микронейтрализации 50
3.2.11 Выявление фрагментов генома вируса бешенства в обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) 50
4 Результаты собственных исследований. 53
4.1 Разработка метода выделения ВБ в культуре клеток нейробластомы мыши 53
4.1.1 Определение аналитической чувствительности метода выделения вируса бешенства в культуре клеток нейробластомы мыши и на белых мышах. 58
4.2 Создание коллекции полевых изолятов вируса бешенства путем освежения и наработки на культуре клеток. 61
4.2.1 Освежение и наработка изолятов вируса бешенства в культуре клеток.61
4.2.2 Определение инфекционной активности вируса. 62
4.3 Определение уровней вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в сыворотках крови животных в реакции нейтрализации в культуре клеток BHK-21 (FAVN) 62
4.4 Определение вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в сыворотках крови диких плотоядных животных в реакции нейтрализации в культуре клеток BHK-21 (RFFIT). 67
4.5 Ускоренное определение антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови диких плотоядных животных в реакции микронейтрализации 77
4.7 Усовершенствование и оценка аналитической чувствительности метода по выявлению фрагментов генома ВБ в ОТ-ПЦР. 82
4.7.1 Определение аналитической чувствительности по выявлению фрагментов генома вируса бешенства в ОТ-ПЦР 85
4.4 Получение и анализ полных геномов четырех изолятов вируса бешенства 99
4.4.1 Характеристика протеинов изученных изолятов 99
4.4.2 Филогенетические взаимоотношения изученных изолятов. 103
5 Обсуждение 104
6 Заключение 109
7 Практические предложения 110
8 Список сокращений 112
9 Список использованной литературы 113
10 Приложения 126
- Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения при бешенстве
- Разработка метода выделения ВБ в культуре клеток нейробластомы мыши
- Ускоренное определение антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови диких плотоядных животных в реакции микронейтрализации
- Характеристика протеинов изученных изолятов
Введение к работе
1.1 Актуальность темы. Бешенство (Rabies)– инфекционное вирусное заболевание млекопитающих, в том числе человека, которое характеризуется поражением центральной нервной системы, энцефаломиелитами, параличами и неизбежной летальностью [2,8].
Возбудитель принадлежит к порядку Mononegavirales, семейству Rhabdoviridae, включающему в себя рода Lyssavirus, Ephemerovirus, Vesiculovirus. В РФ циркулируют вирусы бешенства 5 групп: Центральной, Северо-европейской, Арктической, Евразийской и Кавказской [5].
В настоящее время заболевание регистрируют на территории более 110 стран мира, за исключением некоторых островных государств (Великобритания, Ирландия, Япония, Австралия и др.) и Антарктиды [6].
Бешенство остается одной из серьезных проблем, как в ветеринарии, так и в здравоохранении. В Российской Федерации (РФ) на протяжении последних лет эпизоотолого - эпидемиологическая обстановка по бешенству остается напряженной. В мире ежегодно от бешенства погибает до 59000 людей и более 1 млн животных. Заболеваемость сопровождается значительными экономическими потерями от гибели животных, затратами на постэкспозиционное лечение и ликвидацию последствий вспышек заболевания, осуществление профилактических и карантинных мероприятий, а также на регулирование численности диких плотоядных животных, отлов бродячих кошек и собак и проведение лабораторных диагностических исследований [2,10].
Для профилактики бешенства у животных разработаны и применяются инактивированные культуральные антирабические вакцины, а также живые оральные вакцины для диких животных. При этом основным показателем иммуногенности антирабических вакцин является их способность индуцировать у иммунизированных животных синтез антирабических вируснейтрализующих антител (ВНА) [4,7].
Ежегодно в нашей стране вакцинируют против бешенства более 7,0 млн. голов рогатого скота, более 5,0 млн. собак и около 2,0 млн. кошек. В связи с резким возрастанием, в последние годы, численности собак и кошек в городах, эффективность вакцинопрофилактики бешенства необходимо повышать, так как причиной более 50% случаев заболевания бешенством человека остаются не иммунизированные против бешенства собаки и кошки. Важной составляющей комплекса мероприятий по
профилактике бешенства является мониторинг эпизоотической ситуации и эффективности вакцинации домашних и диких животных в зоне вакцинации, а в отсутствии современных методов оценки невозможно сделать правильные выводы о проводимых мероприятиях по профилактике и борьбе с бешенством.
Некоторые авторы высказывают опасения, связанные с наличием остаточной патогенности аттенуированных штаммов и недостаточной иммуногенной активности вакцин [3,9]. Поэтому немаловажным является изучение молекулярно-биологических характеристик полевых изолятов ВБ, циркулирующих на территории РФ.
В РФ утвержден и введн в действие 9 января 1984 г. ГОСТ 26075-84 (СТ СЭВ 3452-81), согласно которому «золотым стандартом» в диагностике бешенства является реакция иммунофлуоресценции (РИФ) впервые предложенная Coons и Kaplan (1950) и доработанная Goldwasser и Kissling (1958). В соответствии с ГОСТ, в случае получения отрицательного результата в РИФ, проводят биологическую пробу на мышах. Данный метод имеет ряд недостатков, таких как: длительность постановки анализа (отрицательный диагноз на бешенство может быть дан только по истечении 30-суток, при отсутствии специфической гибели мышей) и его дороговизна. С 2015 г по настоящее время действует ГОСТ 26075-13, на основании которого отрицательный результат в РИФ, подтверждают путем биологической пробы на мышах или выделением вируса на культуре клеток (КК).
1.2 Степень разработанности проблемы. На момент начала наших
исследований в ГОСТ отсутствовали метод выделения ВБ в КК, методы по оценке
уровня антирабических ВНА, метод выявления фрагментов генома ВБ в ОТ-ПЦР.
Поэтому, представляется актуальным разработать и усовершенствовать существующие
методы диагностики бешенства, методы по определению ВНА к ВБ в сыворотках крови
домашних и диких животных в реакции нейтрализации (РН), с последующим
внедрением их в схему лабораторной диагностической практики.
1.3 Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка и
совершенствование методов лабораторной диагностики бешенства животных, оценка
эффективности антирабической вакцинации и изучение молекулярно-биологических
характеристик полевых изолятов вируса бешенства (ВБ).
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработать метод выделения ВБ в культуре клеток N2A для диагностики
бешенства животных, определить его аналитическую чувствительность. Изучить
возможность использования указанного выше метода выделения ВБ в культуре клеток для освежения и наработки изолятов и лабораторных штаммов ВБ, определить инфекционную активность освежнных изолятов в культуре клеток N2A.
2. Разработать методы определения вируснейтрализующих антител к ВБ в
сыворотках крови домашних и крови диких животных в реакции нейтрализации в
культуре клеток BHK-21 в соответствии с рекомендациями МЭБ.
3. Усовершенствовать метод выявления фрагментов генома вируса бешенства
в ОТ-ПЦР для применения его в диагностических целях.
4. Изучить молекулярно-биологические характеристики вновь выделенных
на территории РФ, а также в Республике Абхазия полевых изолятов вируса бешенства.
1.4 Научная новизна исследования. Разработан метод выделения ВБ в КК N2A
для диагностики бешенства животных, определена его аналитическая
чувствительность. Показана возможность использования разработанного метода для освежения полевых изолятов, референтных и вакцинных штаммов ВБ.
Разработан метод для определения в КК уровня антирабических ВНА в сыворотках крови домашних животных и крови диких животных в трех модификациях. Проведено определение уровня антирабических ВНА домашних животных, вакцинированных инактивированными антирабическими вакцинами, и диких животных в ряде регионов РФ, где проводилась оральная вакцинация против бешенства.
Усовершенствован метод одновременного выявления фрагментов генома N и G белков ВБ в ОТ-ПЦР для диагностики бешенства животных, определена его аналитическая чувствительность. Создана база нуклеотидных последовательностей фрагментов генов белков N и G изолятов ВБ, выявленных в РФ и Республики Абхазия, установлены их филогенетические связи. Определены полные геномы четырех изолятов ВБ, выделенных в Нижегородской области, Краснодарском крае и Республике Коми.
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы.
Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ», с последующим утверждением Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор):
1. «Методические указания по выделению вируса бешенства в культуре
клеток мышиной нейробластомы»;
-
«Методические указания по определению вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в сыворотках крови животных в реакции нейтрализации в культуре клеток BHK-21 (FAVN)»;
-
«Методические указания по определению вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в сыворотках крови диких плотоядных животных в реакции нейтрализации в культуре клеток BHK-21 (RFFIT)»;
-
«Методические указания по ускоренному определению антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови диких плотоядных животных в реакции микронейтрализации».
-
«Методические указания по выявлению фрагментов генома вируса бешенства в обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)»;
1.6 Методология и методы исследований. Методология проведенных
исследований включает стандартные процедуры с использованием различных
материалов и естественно–восприимчивых животных. В работе использовали: физико-
химические (составление растворов заданной молярности и оценка концентрации
водородных ионов), вирусологические (вирусовыделение, биопроба, культивирование,
титрование вируса), серологические (реакция нейтрализации) и молекулярно –
биологические (ПЦР, секвенирование, анализ нуклеотидных последовательностей)
методы.
1.7 Основные положения, выносимые на защиту.
Результаты разработки, внедрения и применения метода выделения ВБ в КК N2a на территории РФ.
Методы определения ВНА к ВБ в сыворотках крови домашних и с/х животных, диких плотоядных животных в РН в КК BHK-21 и результаты оценки антирабического статуса домашних и диких животных в ряде регионов РФ.
Метод выявления фрагментов генома ВБ в ОТ-ПЦР.
- Результаты молекулярно-генетического и филогенетического анализа изолятов ВБ
животных, выделенных в РФ и Республики Абхазия.
- Результаты определения структуры полных геномов четырех изолятов ВБ,
выделенных в Нижегородской области, Краснодарском крае и Республике Коми.
1.8 Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором
самостоятельно. Автор выражает благодарность сотрудникам референтной
лаборатории по бешенству и BSE, а также сотрудникам информационно-
аналитического центра, отдела координации НИР, отдела аспирантуры, библиотеки ФГБУ «ВНИИЗЖ» за консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы.
1.9 Степень достоверности и апробации результатов. Достоверность всех
наиболее важных экспериментальных показателей подтверждена соответствующими
статистическими критериями и комиссионными испытаниями. Результаты
диссертационной работы были представлены и обсуждены на Международной научно-
практической конференция «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (г.
Ульяновск), Международном конгрессе биологов-охотоведов (г. Москва), 2-м
конгрессе Европейской ассоциации ветеринарных лабораторных диагностов (Польша,
г. Казимер Дольны), Международных совещаниях по Российско-Финскому договору
(Финляндия, г. Хельсинки) в 2011, 2013 гг., а так же на заседаниях ученого совета
ФГБУ «ВНИИЗЖ» в период с 2007 по 2017 гг.
1.10 Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 136
страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные
исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, заключение,
практические предложения и приложения. Список литературы включает 16
отечественных и 101 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 27 таблицами и
14 рисунками.
Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения при бешенстве
Патогенез. Патогенез ВБ включает в себя несколько этапов: 1) проникновение ВБ в организм; 2) центростремительное движение ВБ к ЦНС; 3) диссемиляция (распределение) ВБ в ЦНС и ее поражение; 4) центробежный транспорт ВБ в периферические органы.
1 этап. Проникновение ВБ в организм. В организм ВБ внедряется через поврежденную кожу во время укуса или при попадании патогенного материала, инфицированной слюны от больного животного на слизистые оболочки [114]. Аэрогенное заражение бешенством возможно, но в практике ветеринарных врачей встречается крайне редко. Реализацию воздушно-капельного механизма передачи ВБ обеспечивают инфицированные летучие мыши, которые выделяют ВБ в окружающую среду со слюной, молоком, мочой, что может привести к заражению людей и животных в замкнутом пространстве (пещеры и т.д.).
2 этап. Центростремительное движение ВБ к ЦНС. ВБ во всех тканях хозяина, кроме нервной, реплицируется медленно, размножение в клетках НС происходит гораздо быстрее. Вирус взаимодействует с нервными окончаниями, адсорбируется на ацетилхолиновых рецепторах, затем благодаря эндоцитозу проникает во внутреннюю среду нейрона. После вирус покидает ворота инфекции и начинает центростремительное движение со скоростью примерно несколько мм в день. Это перемещение осуществляется с помощью ретроградного транспорта, а не с помощью перехода по миелиновой оболочке из одной Шванновской клетки в другую[17, 31, 59]. ВБ попадает в моторные волокна, поражает вентральные и краниальные ганглии, достигая ЦНС. При этом доказано, что первым местом репликации ВБ является нейрон.
3 этап. Распределение ВБ в ЦНС. Вирус реплицируется в цитоплазме высокодифференцированных клеток ЦНС. При этом гораздо большее количество вируса накапливается в дендритах и теле нейрона, что связано с наличием рибосом в дендритах и их отсутствием в аксонах. Сборка вириона также осуществляется в цитоплазме клетки [17]. После репродукции вирус отпочковывается на постсинаптической мембране и проникает в аксональные окончания соседних нейронов, иными словами, для ВБ характерен дендро аксональный механизм передачи. Затем вирус транспортируется вновь ретроградным способом. Распределение ВБ в ЦНС осуществляется благодаря внутринейронному вирусу, а не отпочковавшимся вирионам[31]. Отмечают также важную роль цереброспинальной жидкости в дессиминации ВБ в ЦНС, но при этом выделить из нее микроорганизм удается только на поздних стадиях патогенеза [80, 83]. Накопление ВБ отмечается в продолговатом мозге, мозжечке, гиппокампе, коре больших полушарий головного мозга. Вирус обнаруживается и в других отделах ГМ, а также в спинном мозге. Концентрируется он преимущественно в сером веществе. При бешенстве в цитоплазме нервных клеток обнаруживаются характерные включения, матриксы, представляющие собой избыточное количество вирусных РНП в пораженном нейроне.
4 этап. Центробежный транспорт ВБ. Центробежная дессиминация ВБ в периферические органы осуществляется за счет различных механизмов: 1) продвижение вируса по аксоплазме центробежно к различным тканям и органам; 2) антероградный механизм движения вирусных белков по аксоплазме, сборка и выход сформировавшихся вирусных частиц, поражающие различные клетки организма.
Максимальная концентрация ВБ отмечается на последней стадии бешенства в слюнных железах, преимущественно в подчелюстной. Вирус обнаруживается также в коже, эпителии ЖКТ, почках, надпочечниках, слезной и поджелудочной железах, мышечных волокнах, миокарде [34, 114]. ВБ преимущественно остается внутри клеток, поэтому практически недоступен иммунокомпетентным клеткам, что объясняет позднее формирование антирабического иммунитета [80, 83]. В последнее время акцентируют внимание на возникновении апоптических изменений в нейронах гиппокампа, внешнего зернистого слоя мозжечка. В связи с этим высказывают гипотезу о зависимости фатального энцефаломиелита от апоптоза при бешенстве [31].
Клинические признаки. Проявление различных клинических признаков при бешенстве зависит от многих факторов: вирулентности возбудителя, вида, возраста и восприимчивости животного, пораженного микроорганизмом, места локализации ворот инфекции [114]. Инкубационный период длится от нескольких дней до года. У молодых животных наблюдается короткий инкубационный период (около 10 дней).
В зависимости от преобладания признаков возбуждения или параличей различают буйную и тихую (паралитическую) формы бешенства. Иногда отмечаются случаи абортивного бешенства, при котором болезнь завершается выздоровлением животного [6]. Также известны единичные случаи возвратного бешенства, характеризующегося вторичным появлением симптомов бешенства после ремиссии, в результате чего организм хозяина погибает. При атипичной форме наблюдается атрофия мышц, параличи и геморрагический гастроэнтерит [28, 30].
При типичном проявлении бешенства у животных в буйной форме преобладает маниакальное состояние – синдром, характеризующийся упорным, безудержным болезненным стремлением совершать необычные действия: 1) буйство – крайняя степень возбуждения, которая выражается в буйном поведении, непокорности и разрушении окружающих предметов (встречается у больного КРС); 2) утрата поведенческих инстинктов – отсутствие чувства осторожности, что побуждает животных беспричинно перемещаться на большие расстояния и тем самым встречаться с людьми (характерно для больных лисиц); 3) агрессивность – беспричинное неспровоцированное стремление нападать на животных и людей (обнаруживается у больных волков и собак).
Также при бешенстве часто отмечают депрессивное настроение – синдром, который характеризуется болезненным угнетенным состоянием со следующими признаками: 1) дромомания – неспровоцированное продолжительное отсутствие животного дома, являющееся следствием депрессивности (типично для больных кошек); 2) ярость – форма спровоцированного, ответного нападения на людей и защиты от попыток брать больное животное на руки; погрызание и проглатывание несъедобных предметов (преимущественно встречается больных у кошек и лисиц); 3) фотофобия – светобоязнь, проявляющаяся в стремлении прятаться в темных местах (характерно для больных кошек); 4) гидрофобия – водобоязнь, симптом, характерен [114].
Буйная форма бешенства включает в себя 3 стадии: 1) продромальная стадия, при которой возникают беспричинное беспокойство и повышенная чувствительность к свету; 2) стадия возбуждения, характеризующаяся приступами ярости, повышением температуры тела, парезами (частичной потерей мышечной силы), обильной саливацией и оглумоподобным состоянием (ослабление рефлексов); 3) стадия параличей, при которой развиваются параличи, снижается температура тела и наступает смерть от паралича дыхательного центра.
При тихой форме бешенства отмечаются сильная саливация, затруднение дыхания, наступление параличей.
У человека при бешенстве возникают следующие симптомы: сильные головные боли, сильная тошнота, рвота, нарушение координации движения, аэрофобия, гидрофобия, галлюцинации, обильные потоотделение и саливация, лихорадка, затруднено глотание. Заболевание всегда заканчивается летальным исходом [114].
Патологоанатомические изменения. Патологоанатомические изменения при бешенстве выражены неявно или вообще не характерны, поэтому большого значения в диагностике бешенства не имеют [114]. Животные, погибшие от бешенства, имеют истощенный вид, их шерсть часто пропитана слюной, отмечаются следы укусов и расчесов. При осмотре наблюдают цианоз слизистых оболочек, сгустки крови в брюшной полости, истощение организма. В желудке больных бешенством животных часто обнаруживают различные несъедобные предметы. Слизистая всего желудочно-кишечного тракта гиперемирована, в ней нередко отмечаются кровоизлияния. Головной и спинной мозг отечны и также гиперемированы. Имеют место воспалительные морфологические изменения в органах иммунной системы.
Разработка метода выделения ВБ в культуре клеток нейробластомы мыши
Основная схема лабораторной диагностики бешенства животных, в соответствие с ГОСТ 26075-13 (вступил в действие с 1 января 2015 г.), заключается в исследовании головного мозга в реакции иммунофлуоресценции (РИФ). В случае получения отрицательного результата в РИФ проводят биологическую пробу на белых лабораторных мышах или реакцию выделения вируса в культуре клеток. Полученный результат считают окончательным.
В тех лабораториях, где позволяют условия и квалификация персонала, МЭБ рекомендует вместо биологической пробы на мышах использовать вирусовыделение в культуре клеток. Причины такой рекомендации заключаются в следующем:
оба метода обладают высокой диагностической чувствительностью и специфичностью;
минимальное и максимальное время постановки диагноза является критичным показателем когда случай связан с покусами людей: при использовании метода вирусовыделения в культуре клеток срок постановки диагноза составляет от 4 до 12 суток,, а при постановке биологической пробы на мышах в среднем от 12 до 30 суток;.
специфичность гибели лабораторных мышей в ходе постановки биологической пробы необходимо дополнительно подтверждать в реакции иммунофлуоресценции;
метод вирусовыделения в культуре клеток более гуманный и менее экономически затратный.
В странах Евросоюза при получении отрицательного результата в РИФ вирусовыделение в культуре клеток проводят, только если имел место контакт животного с человеком (Франция, Германия). Некоторые страны (Литва) при отсутствии такого контакта ограничиваются проведением однократного пассажа в культуре клеток.
В настоящее время многие региональные ветеринарные лаборатории РФ имеют техническую возможность внедрить лабораторную практику диагностику бешенства с использованием культуральных методов.
Исходя из вышеизложенного, перед нами стояла задача адаптировать и внедрить в ветеринарную лабораторную практику метод по выделению вируса бешенства в культуре клеток нейробластомы мыши в Российской Федерации.
Сущность метода заключается в индикации репликации вируса бешенства после заражения культурально-клеточного монослоя путем инкубации осветленной суспензии головного мозга животных, подозреваемых в заболевании бешенством с культурой клеток нейробластомы мыши.
Определение концентрации культуры клеток нейробластомы мыши для постановки реакции по выделению ВБ.
Наличие полного монослоя в культуральных флаконах и планшетах является обязательным для постановки диагноза на бешенство, поэтому необходимо было определить концентрацию культуры клеток на пробу. Для этого проводили выделение вируса бешенства штамма CVS с концентрацией 0,5106; 1,0106; 1,5106; 2,0106; 2,5106; 3,0106; 3,5106 клеток на пробу.
Опыт повторили 3 раза. В результате опыта определили, что при использовании культуры клеток в концентрации 0,5106; 1,0106; 1,5106 на пробу полный монослой (90-100%) не получали. Концентрации 2,5106; 3,0106; 3,5106 клеток на пробу, наоборот, давали избыток клеточного монослоя. При концентрации 2,0106 клеток на пробу не было недостаточного и избыточного роста клеточного монослоя, поэтому такую концентрация мы определили как оптимальную для постановки реакции выделения вируса бешенства в культуре клеток. Выделение ВБ из проб патологического материала от животных, подозреваемых в заболевании бешенством. Для выделения ВБ использовали культуру клеток нейробластомы мыши N2a. Наработку культуры клеток для последующего хранения в жидком азоте и постановки реакций проводили с использованием пластиковых культуральных флаконов площадью 75см2. Для этого замороженную в жидком азоте аликвоту культуры клеток в криопробирках подвергали быстрому оттаиванию, переносили весь объем из криопробирки в центрифужную пробирку объемом 10 мл, добавляли среду RPMI 5 мл для отмывания от DMSO. Перемешивали пипетированием, центрифугировали при 84 g 15 минут. Сливали надосадок, осадок ресуспендировали в ростовой среде, весь объем делили на флаконы площадью 25см2, из расчета 1,5-2106 клеток на флакон. Через 48 часов снимали монослой при помощи трипсин-версена и переносили содержимое всего флакона во флакон площадью 75см2. Через 48 часов снимали монослой и переносили содержимое флакона в новый флакон площадью 75см2 из расчета 3-4106 клеток на флакон. Клеточный монослой данного пассажа, находящийся в фазе логарифмического роста (80-90% монослой), использовали в постановке реакции выделения вируса бешенства из расчета 2106 клеток на одну пробу.
В реакции использовали 10% суспензию ткани головного мозга.
В качестве положительного контроля использовали ткань головного мозга мыши, инфицированной вирусом бешенства штамма CVS в результате проведения биопробы, с интенсивностью специфичного свечения в РИФ не менее 3 крестов.
Учет проводили через 72 часа с момента постановки реакции. Реакцию учитывали в мини – чашках Петри диаметром 3 см или 6-луночных культуральных планшетах. Одновременно культуральные флаконы с каждой пробой извлекали из СО2 инкубатора и замораживали при минус 20оС для проведения последующего пассажа. Для окраски готовили рабочее разведение антирабического флуоресцирующего иммуноглобулина в объеме из расчета 0,5 мл на чашку Петри или лунку культурального планшета. Рабочее разведение антирабического флуоресцирующего иммуноглобулина определяли заранее методом титрования препарата в лунках 6-ти луночного культурального планшета с монослоем клеток нейробластомы мыши линии N2а, зараженной культуральным вирусом бешенства штамма CVS.
Реакцию учитывали в полях зрения флуоресцентного микроскопа. При использовании прямого флуоресцентного микроскопа внутреннюю поверхность лунок планшета и чашек Петри осушали перед просмотром.
Сначала просматривали всю поверхность лунки при увеличении 100. При обнаружении характерно светящихся клеток или фокусов, или иных объектов с нехарактерным свечением их просматривали при большем увеличении (200) для уточнения характера свечения.
В случае получения отрицательного результата в первом пассаже, проводили второй, а при необходимости, и третий пассаж. Для проведения второго и третьего пассажей в качестве вируссодержащего материала использовали культуральную суспензию из предыдущего пассажа. Для этого размораживали матрасы с пробами, в которых не был выделен вирус бешенства в первом или втором пассаже. Содержимое матрасов переносили в центрифужные пробирки на 10-15 мл. Центрифугировали в течение 15 минут при 755 g. Далее проводили реакцию, описанную выше.
Положительной считается проба при обнаружении единичных клеток или групп клеток (фокусов) с характерными округло-овальными внутриклеточными включениями разной величины, имеющих чёткие края, светящихся ярким зеленым или желтовато-зеленым светом на темном или светлом серо-зеленом фоне неинфицированных клеток. Отрицательной считается проба при отсутствии специфичного свечения.
В положительном контроле обнаруживаются фокусы или отдельные клетки со специфичными внутриклеточными включениями, флуоресцирующими ярким зеленым или желтовато-зеленым светом (рис. 4А).
В отрицательном контроле специфичное свечение должно отсутствовать, клетки должны светиться равномерным серо-зеленым цветом. (рис. 4Б)
Диагноз бешенство ставится, если вирус бешенства будет выявлен в любом из трёх пассаже.
Отрицательный диагноз на бешенство ставится, если в первом, втором и третьем пассажах получены отрицательные результаты.
Было проведено исследование 71 пробы патологического материала от различных видов животных, поступивших из 13 регионов РФ и Республики Абхазия, подозреваемых в заболевании бешенством, с помощью разработанного метода выделения вируса бешенства в культуре клеток нейробластомы мыши, а также методами РИФ и биологической пробы на белых лабораторных мышах.
Методами выделения ВБ в культуре клеток и на мышах было определено одинаковое количество отрицательных и положительных проб (28 и 43 пробы соответственно). Вирус бешенства во всех 43 пробах был выделен уже при проведении первых пассажей в культуре клеток, однако, при проведении биологической пробы на мышах пробы 158/09 вируса бешенства был выделен только на 20-й день.
На основании полученных результатов были разработаны и утверждены Россельхознадзором «Методические указания по выделению вируса бешенства в культуре клеток нейробластомы мыши».
После постановки в РИФ (МФА) отрицательного результата на бешенство было исследовано 1686 пробы в реакции выделения вируса бешенства в культуре клеток, 3 пробы оказались положительными. В пробе головного мозга собаки (экс. 158/09) из г. Дзержинска Нижегородской области в 1 пассаже был выделен вирус бешенства. Проба головного мозга собаки из Тверской области (эксп. 490/13) показала положительный результат в 3 пассаже. Проба головного мозга кошки из г. Иваново показала в реакции выделения вируса в культуре клеток положительный результат во 2 пассаже. Во всех этих пробах был поставлен диагноз бешенство.
Ускоренное определение антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови диких плотоядных животных в реакции микронейтрализации
Пробоподготовку, постановку реакции до внесения культуры клеток проводили также, как при определении вируснейтрализующих антител к вирусу бешенства в RFFIT. Доза вируса, концентрация культуры клеток подобраны таким образом, чтобы проводить учет результатов реакции через 24 часа.
По окончании инкубации с постоянной дозой вируса, доставали планшеты из СО2 инкубатора и вносили, приготовленную клеточную суспензию, в лунки планшетов.
После внесения клеточной суспензии, 96-луночный контрольный планшет ставили на шейкер, включали его на 2-3 секунды и переносили по 10 мкл содержимого ряда С1-Н1 в ряд F1-А1 72-луночного планшета. Переносили прикрывая крышкой остальные ряды. Далее переносили содержимое рядов С2-Н2 в F2-А2; С3-Н3 в F3-А3; С4-Н4 в F4-А4; С5-Н5 в F5-А5; С6-Н6 в F6-А6 и т.д. Перед переносом каждого ряда включали шейкер и меняли наконечники. Использовали многоканальный дозатор с переменным расстоянием между наконечниками.
72-луночные и 96-луночные планшеты инкубировали 24 часа в СО2 инкубаторе (37С, 5% СО2).
Учет реакции проводили через 24 часа с момента окончания ее постановки.
96-луночные планшеты служат для контроля за состоянием монослоя. Если монослой сформирован, то начинают проявлять реакцию в 72-луночных планшетах, а 96-луночные планшеты утилизируют. Если нет, то реакцию переделывают.
В качестве фиксирующего монослой раствора использовали 80% водного раствора ацетона, охлажденного при температуре (6±2оС).
Рабочий титр антирабического флуоресцирующего иммуноглобулина определяли заранее методом титрования препарата в лунках 72-ти луночного культурального планшета с монослоем клеток ВНК-21, зараженных культуральным вирусом бешенства штамма CVS. В каждую лунку вносили по 10 мкл антирабического флуоресцирующего глобулина в рабочем разведении. Планшеты помещали во влажную камеру и выдерживали в термостате при 37оС в течение 30 минут. После этого удаляли конъюгат и лунки промывали двукратно фосфатно-солевым буферным раствором по 10 минут и однократно дистиллированной водой 10 минут, внося каждого раствора в объеме по 9 мл на планшет.
Перед просмотром в полях зрения флуоресцентного микроскопа, внутреннюю поверхность лунок планшета осушали.
Планшеты просматривали при увеличении 200. Подсчитывали и записывали в заранее заготовленной таблице количество инфицированных клеток с характерными для бешенства округло-овальными внутриклеточными включениями разной величины и с четкими краями, светящихся ярким зеленым или желтовато-зеленым светом на темном или светлом серо-зеленом фоне неинфицированных клеток в каждой лунке.
В контроле вируса должно быть в среднем 20-50 инфицированных клеток на лунку, если их количество больше или меньше, то реакцию необходимо переделать.
В отрицательном сывороточном контроле OIE количество инфицированных клеток должно быть примерно таким же, как и в контроле вируса.
В положительном сывороточном контроле OIE, ряд с наибольшим разведением сывороточного контроля, в котором нет специфического свечения клеточного монослоя, принимали за 0,5 МЕ/мл.
Титры исследуемых сывороток определяли по сравнению с результатами титрования положительного сывороточного контроля OIE и рассчитываются в геометрической прогрессии. Примеры расчета титров вируснейтрализующих антител:
Пример 1. Если ряд, за которым следует ряд со специфическим свечением клеточного монослоя исследуемой сыворотки совпадает с рядом, за которым следует ряд со специфическим свечением клеточного монослоя положительного сывороточного контроля OIE, то титр исследуемой сыворотки равен 0,5 МЕ/мл. Если ряд, с наибольшим разведением исследуемой сыворотки, в котором нет специфического свечения клеточного монослоя совпадает с рядом, с наибольшим разведением положительного сывороточного контроля OIE, в котором нет специфического свечения клеточного монослоя то титр исследуемой сыворотки равен 0,5 МЕ/мл.
Если ряд, с наибольшим разведением исследуемой сыворотки, в котором нет специфического свечения клеточного монослоя выше на 1 ряд, чем ряд, с наибольшим разведением положительного сывороточного контроля OIE, в котором нет специфического свечения клеточного монослоя, то титр исследуемой сыворотки равен 1,0 МЕ/мл; если на 2 ряда выше, то 2,0 МЕ/мл; на 3 – 4,0 МЕ/мл, на 4 – 8,0 МЕ/мл и т.д.
Если ряд, с наибольшим разведением исследуемой сыворотки, в котором нет специфического свечения клеточного монослоя ниже на 1 ряд, чем ряд с наибольшим разведением положительного сывороточного контроля OIE, в котором нет специфического свечения клеточного монослоя, то титр исследуемой сыворотки равен 0,25 МЕ/мл; если на 2 ряда ниже, то 0,125 МЕ/мл; на 3 – 0,0625 МЕ/мл, на 4 – 0,03125 МЕ/мл и т.д.
Задача по разработке и внедрению «Методических указаний по ускоренному определению антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови диких плотоядных животных в реакции микронейтрализации» в практику ветеринарных лабораторий и научных учреждений ветеринарного профиля, осуществляющих мониторинг эффективности антирабической вакцинации, является актуальной.
Для сравнения двух модификаций реакции нейтрализации было проверено 44 пробы крови, диагностическая чувствительность и специфичность разработанной ускоренной модификации составили 100%, результаты представлены в таблице 18.
Таким образом, метод по ускоренному определению антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови диких плотоядных животных в реакции микронейтрализации, несмотря на больший расход планшетов, наконечников, культуры клеток, культурального вируса и больших трудозатрат, обладает рядом серьезных преимуществ перед методом RFFIT:
1. Быстрый (экспресс) метод (инкубация 24 часа вместо 48 часов).
2. Экономия конъюгата в 5 раз за счет уменьшения площади дна лунки.
3. Вследствие того, что на 72-луночных планшетах Терасаки сыворотки оказывают меньшее токсичное действие на состояние монослоя, не нужно проводить дополнительные манипуляции с сыворотками.
4. Учет реакции проводится путем подсчета каждой зараженной клетки, вследствие чего полученные результаты являются более точными и объективными.
С использованием данной методики было исследовано 44 пробы крови от животных разных видов. Пробы крови животных были получены из 7 регионов Российской Федерации: Нижегородской, Владимирской, Новосибирской, Рязанской, Хабаровской, Тверской, Белгородской областей и Республики Беларусь.
Характеристика протеинов изученных изолятов
Ген N всех изученных изолятов кодирует протеин длиной 450 аминокислотных остатков.
У всех изолятов сохраняется серин в позиции 389, который охарактеризован как предположительный сайт фосфорилирования казеинового типа и ассоциирован с регуляцией транскрипции и репликации вирусной РНК (Dietzschold, 1987; Yang, 1999).
Домен связывания РНК в позиции 298-352 (Kouznetzoff, 1998) является высококонсервативным у всех изученных изолятов.
В протеине N были идентифицированы и локализованы антигенные сайты (Goto, 2000). Антигенный сайт I расположен в позиции 358-367, а антигенный сайт IV занимает два участка, один из которых расположен внутри антигенного сайта I (359-366), а другой – в позиции 375-383. Сравнение антигенных сайтов белка N изучаемых полевых изолятов и вакцинного штамма РВ-97 показало, что все изоляты в позиции 364 имеют замену аргинина на лизин. Данные аминокислоты являются полярными положительно заряженными, поэтому, предположительно, эта замена не влияет на антигенные свойства изолятов по сравнению с вакцинным штаммом РВ-97. Изолят №1564 в позиции 379 имеет замену валина на аланин, что также, по-видимому, не влияет на антигенные свойства вируса, поскольку обе эти аминокислоты являются неполярными. Изолят 1410 в позиции 379 имеет замену валина на треонин. Поскольку валин является неполярной аминокислотой, а треонин – полярной незаряженной, возможно, что данная замена повлияла на антигенные свойства протеина N изолята 1564 по сравнению с вакцинным штаммом РВ-97.
Протеин Р
Ген Р всех изученных изолятов кодирует протеин длиной 297 аминокислотных остатков.
В протеине Р выделяют два консервативных домена в позициях 1-50 (CD1) и 201-245 (CD2) и два вариабельных домена в позициях 61-80 (VD1) и 134-180 (VD2) (Nadin-Davis, 1997, 2002). Характерные свойства этих доменов сохраняются в протеине Р изученных изолятов.
Пять остатков серина в позициях 63, 64, 162, 210 и 271 ассоциированы с фосфорилированием протеина Р вируса бешенства (Gupta, 2000). Однако всего 4 изолята лишены отдельных остатков серина в указанных позициях. Так, изоляты №1352, №1410 и №1564 имеют в позициях 64, 63 и 162 замену серина на пролин, соответственно.
Для протеина Р вируса бешенства было показано, что четыре остатка метионина в позициях 20, 53, 69 и 83 используются для начала трансляции (Chenik, 1995). Все указанные остатки метионина сохраняются в изученных изолятах за исключением изолята №1352, у которого в позиции 69 метионин заменен на изолейцин.
Протеин М
Ген М всех изученных изолятов кодирует протеин длиной 202 аминокислотных остатка. В протеине М вируса бешенства различают пролиновый мотив (PPxY), который участвует в почковании вируса и взаимодействует с доменами клеточных компонентов WW (Harty, 1999; Harty, 2001; Kobayashi, 2007). У всех изученных изолятов данный мотив представлен в виде последовательности аминокислот PPEY в позиции 35-38.
Протеин G
Ген G всех изученных изолятов кодирует протеин длиной 524 аминокислотных остатка.
Сайты, связанные с патогенностью вируса бешенства в мышах - Ala-242, Asp-255, Ile-268 и Arg-333 (Takayama-Ito, 2006; Tuffereau, 1989) – сохраняются всех изученных изолятов. Также сохраняется и Lys-330, который участвует в связывании вириона с нейронами (Coulon, 1998).
Для протеина G вируса бешенства охарактеризованы антигенные сайты II (позиции 34-42 и 198-200) и III (позиция 330-338) (Prehaud, 1988). При сравнении полевых изолятов вируса бешенства с вакцинным штаммом RB-97 было установлено, что они идентичны по как по антигенному сайту II, так и по антигенному сайту III.
Протеин L
Ген L всех изученных изолятов кодирует протеин длиной 2127 аминокислотных остатков.
У членов порядка Mononegavirales идентифицировано шесть консервативных доменов (домены I-VI) в протеине L (Poch, 1990), некоторые из которых охарактеризованы как функциональные мотивы. Домен II в позиции 543-563 функционирует как РНК-связывающая область, а домен III в позиции 726-731 охарактеризован как активный сайт полимеразы (Schnell, 1995). Домен VI в позиции 1704-1708, который содержит глициновый мотив (GXGXG), ассоциирован с полиаденилированием или протеин-киназной активностью (Poch, 19990). Все эти функциональные мотивы консервативны в изученных изолятах.