Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1 Характеристика возбудителя хламидиоза и вызываемых им заболеваний 17
2.2 Методы лабораторной диагностики хламидийных инфекций животных 48
2.3 Меры борьбы с хламидийными инфекциями животных и их специфическая профилактика
3. Материалы и методы исследований 77
4. Собственные исследования 88
4.1 Разработка и усовершенствование средств ретроспективной диагностики хламидиоза животных 88
4.1.1 Разработка способа получения специфического хламидийного антигена для ретроспективной диагностики хламидиоза животных 89
4.1.2 Усовершенствование «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» 103
4.1.3 Разработка наборов для диагностики хламидиоза КРС и свиней в ИФА на основе нового антигена 113
4.1.4 Разработка «Набора препаратов для диагностики хламидиоза животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)» 148
4.2 Изучение биологических свойств и стандартизация производственных штаммов хламидий 179
4.3 Разработка и усовершенствование средств специфической профилактики хламидиоза животных 191
4.3.1 Разработка и испытание инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота 191
4.3.2 Усовершенствование «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной» 216
4.3.3 Разработка инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней 248
4.3.4 Разработка ассоциированной вакцины против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней 2 5.
Заключение 296
6. Список сокращений 323
7. Список использованной литературы 325
8. Список илюстрированного материала 359
9. Приложения 366
- Методы лабораторной диагностики хламидийных инфекций животных
- Меры борьбы с хламидийными инфекциями животных и их специфическая профилактика
- Разработка способа получения специфического хламидийного антигена для ретроспективной диагностики хламидиоза животных
- Разработка и усовершенствование средств специфической профилактики хламидиоза животных
Методы лабораторной диагностики хламидийных инфекций животных
Еще до нашей эры в древнеегипетских папирусах упоминается заболевание глаз, схожее с трахомой. Наиболее древняя книга медицины – папирус Эберса (XV век до н.э.) содержит описание болезни глаз, которая поражала страны Африки и Азии. Хоть мы и можем предполагать о таком далеком прошлом существования хламидий из древних источников, однако первые, научно подтвержденные сообщения, об инфекциях которые были вызваны микроорганизмами, названными впоследствии хламидиями, опубликованы в XIX веке. В 1882-1886 годах, в ряде европейских стран, при возникновении эпидемии, которая характеризовалась преимущественно атипичной пневмонией, была установлена взаимосвязь между заболеванием человека и болезнью попугаев из тропических стран [179]. Именно в это время заболевание получило название пситтакоз (psittacos - попугай). Далее было установлено, что эта инфекция может распространяться не только попугаями, но и другими видами птиц [111, 237]. В этой связи Терских И.И. [145] предложила именовать данную болезнь орнитозом (от греческого ornis – птица), считая, что пситтакоз это лишь частный случай орнитоза.
Связь между хламидиями и трахомой впервые была доказана в 1907 г. Halberstaedter и Prowazek обнаружили внутриклеточные цитоплазматические включения в эпителиальных клетках конъюнктивы больных трахомой людей. При окраске по Романовскому-Гимзе исследователи различали внутри включений мелкие фиолетово-красные тельца диаметром около 0,25 мкм и несколько более крупные образования, окрашивающиеся в синий цвет. По мнению авторов, синий цвет содержимого включений зависел от клеточных реактивных масс, плотно укутывающих элементарные тельца подобно мантии. Поэтому обнаруженные внутриклеточные образования были выделены в особую группу микроорганизмов, названных Chlamydozoon (chlamys – мантия, zoon -животное). Вскоре такие же включения были обнаружены при негонококковой бленнореи и уретрите.
В тропических странах была известна паховая лимфогранулема – болезнь, поражающая паховые лимфоузлы. В 1942 году Rake и Jones [287] показали, что формы развития возбудителя и характер окрашивания лимфогранулемы аналогичны с таковыми возбудителя пситтакоза (орнитоза). Основываясь на этом, эти возбудители были условно объединены в группу пситтакоза-лимфогранулемы-трахомы (ПЛТ).
Первое естественное заражение сельскохозяйственных животных возбудителями группы ПЛТ было отмечено Mс Nutt [270] в 1940 году. Он доказал этиологическую роль данной группы возбудителей при энцефалите крупного рогатого скота. Он же в 1945 году выделил от свиней инфекционный агент неизвестной природы, который проявлялся при экспериментальном заражении артритом, перитонитом, плевритом, перикардитом [271]. Позже при сходной патологии выделен с помощью куриных эмбрионов подобный агент, который отнесли к организмам группы ПЛТ (хламидиям) и в условиях эксперимента воспроизвели у поросят заболевание, типичными для которого были перикардит, перитонит, у отдельных животных – артрит.
Stamp в 1950 году [302] изолировал возбудитель из влагалищной слизи абортировавшей овцы; воспроизведением болезни и изучением свойств возбудителя была доказана принадлежность его к группе пситтакоза-лимфогранулемы-трахомы (ПЛТ).
В последующие годы хламидиозная инфекция была описана у крупного рогатого скота, свиней, коз, кошек, собак, пушных зверей и других видов животных [30, 78, 189, 154, 64]. При этом было установлено, что два вида хламидии Clamydia psittaci и Chl. pecorum, являются основной причиной абортов у крупного рогатого скота, коз и овец. В нашей стране эпизоотическая пневмония поросят хламидийной этиологии была описана в начале 60-годов Николаевой Л.В. с соавторами [100], а затем и рядом других исследователей [19, 50]. Об абортах хламидийной этиологии у свиней впервые сообщили Щербань Н.Ф. с сотрудниками [187]. Выделив возбудитель, авторы экспериментально воспроизвели аборты и мертворождения у свиноматок, вводя им парэнтерально хламидии.
Заболевания свиней хламидиозом регистрировалось в самых различных областях России и ближнего зарубежья [21, 27, 67, 71, 122, 131, 141, 158]. По данным Обухова И.Л. [108], хламидиозы занимают одно из ведущих мест инфекционной патологии у свиней.
Хламидии длительное время имели различные названия. На ранних этапах исследований нечеткость таксономической классификации возникла на уровне определения группы, к которой необходимо отнести данный микроорганизм. В 1966 году американский ученый Page пересмотрел все имеющиеся названия возбудителей группы ПЛТ и предложил выделить их в самостоятельный порядок и включить в единый род Chlamydia, используя за основу термин Chlamydozoon (от греческого chlamys - мантия, zoon -животное).
4 мая 1971 года таксономический комитет американского общества микробиологов закрепил за рассматриваемой группой микроорганизмов название «хламидии», а вызываемое ими заболевание стали называть «хламидиозами». Дальнейшие исследования показали, их сходство с бактериями, особенно с риккетсиями: содержание нуклеиновых кислот, способ размножения на определенном этапе развития, чувствительность к сульфаниламидам и антибиотикам, наличие клеточной стенки, окрашиваются по Грамму (граммотрицательны) и т.д.
Меры борьбы с хламидийными инфекциями животных и их специфическая профилактика
Для постановки РСК использовали «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» (РОСС RU.ФВ01.Н00022) производства ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань), по инструкции утвержденной Заместителем руководителя Россельхознадзора от 3 марта 2008 года.
Реакцию ставили в объеме 1,0 см3 в пробирках Флоринского. Антиген при постановке реакции применяли в рабочей дозе, сыворотки инактивировали 30 мин и титровали путем двукратных разведений, начиная с 1:5. Перед постановкой реакции проводили титрование комплемента в гемолитической системе, используя его удвоенную дозу, с целью контроля специфичности реакции иммунную хламидийную и заведомо отрицательную сыворотку, а также контрольный антиген. Гемолитическую систему готовили из 2,5%-ной смеси отмытых эритроцитов барана и стандартной гемолитической сыворотки в двойном титре. Реакцию проводили в водяной бане при 370С. За диагностический титр принимали разведение сыворотки 1:10, разведение 1:5 считали сомнительным результатом.
При разработке наборов для ИФА применяли непрямой иммунопероксидизный метод ELISA, являющийся одним из вариантов иммуноферментного метода.
ИФА ставили в непрямом варианте, используя полистироловые 96 луночные планшеты с плоским дном. Для выявления меченных АТ использовали раствор ОФД с 3% перекисью водорода. Для остановки реакции применяли раствор серной кислоты. Также для постановки ИФА использовали антивидовые конъюгаты производства ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
Учет результатов реакции проводили инструментально на спектрофотометре модели Bio-Rad Model 680, при длине волны 490. При этом использовали количественный метод. Для оценки активности и специфичности антигена вычисляли коэффициент специфичности (К сп.) по отношению оптической плотности положительного контроля (ОП пол.) к отрицательному контролю (ОП отр.): К сп..= ОП пол. / ОП отр. Для оценки результата вычисляли критический уровень, который определяется как значение оптической плотности отрицательного контроля (ОП отр.) умноженное на 2: ОП крит. = ОП отр. х 2 Результат считали положительным, если значение оптической плотности данного образца было выше критического уровня (ОП крит. ОП исп.). Если оптическая плотность испытуемого образца была меньше или равна оптической плотности отрицательного контроля (ОП исп. ОП отр.), то результат реакции считали отрицательным. Если оптическая плотность испытуемого образца была больше оптической плотности отрицательного контроля и меньше или равна критическому уровню (ОП отр. ОП исп. ОП крит.) результат реакции считали сомнительным. Для постановки реакции непрямой гемагглютинации микрометодом использовали стандартные плексигласовые 96-луночные планшеты с полукруглым дном. В технологии получения эритроцитарного хламидийного антигена применяли 0,15 М фосфатно-буферные растворы с рН-6,4 и рН7,2. Формализацию и танизацию эритроцитов барана проводили общепринятыми методами. Исходным материалом для приготовления субстрата для антигена служили эритроциты барана. Для получения эритроцитов использовали дефибринированную кровь барана взятую из яремной вены.
Результаты реакции оценивали визуально после осаждения эритроцитарного антигена в контрольных (последних) луночках рядов. Реакцию считали положительной, если эритроциты агглютинировались и образовывали на дне луночки перевернутый «зонтик». Реакцию считали отрицательной, если эритроциты оседали на дне лунки в виде плотной точки. Количественную оценку реакции выражали в титрах. Обратную величину разведения сыворотки, способную вызывать агглютинацию эритроцитарного хламидийного антигена, принимали за титр. Положительным результатом считали агглютинацию эритроцитов с исследуемой сывороткой в разведении 1:10 и выше.
Истощение хламидийных сывороток от неспецифических желточных антител при изготовлении наборов для РСК и РНГА осуществляли иммуносорбентом, приготовленном на основе «нормальных» желточных мешков куриных эмбрионов по общепринятому методу [199]. Для этого к сыворотке крови добавляли обезвоженный иммуносорбент в количестве 1/5 от объема, тщательно перемешивали и оставляли на 16 – 18 часов при 4-60С. Затем иммуносорбент отделяли от сыворотки путем центрифугирования при 3000 об. мин в течение 20 минут.
Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) с целью выявления антител к парвовирусному антигену ставили микрометодом на полистироловых пластинах с U-образными лунками используя эритроциты морской свинки согласно «Методическим указаниям по диагностике парвовирусной болезни свиней», утвержденным Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР 19 февраля 1986 года. За титр антител к парвовирусному антигену в РТГА принимали предельное разведение сыворотки, полностью подавляющее гемагглютинирующую активность антигена. Обнаружение антигена хламидий в патологическом материале осуществляли в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) используя «Набор флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» производства ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (№РОСС RU.ФБ01.В20238) с помощью иммунофлуоресцентной системы микроскопа Nikon Eclipse 200. РИФ ставили согласно инструкции утвержденной Заместителем руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору РФ 3 марта 2008 года. За специфическую флуоресценцию хламидийного антигена в мазках отпечатках принимали внутриклеточное ярко-зеленоватое-желтое свечение различных по величине гранул на тусклом зеленовато-сером фоне клеток. В мазках, приготовленных из жидкостей (грудной и брюшной выпот, содержимое желудка, околоплодная жидкость и т.д.), хламидийный антиген выявлялся в виде мономорфных внеклеточных коккоподобных светящихся гранул, расположенных одиночно или скоплениями. Для оценки интенсивности свечения использовали четырехкрестовую систему.
Разработка способа получения специфического хламидийного антигена для ретроспективной диагностики хламидиоза животных
Для проверки качества изготовленных производственных серий вакцины необходимо проводить контроль каждой серии биопрепарата на иммуногенность с целью определения предполагаемой эффективности вакцинации против хламидиоза крупного рогатого скота в условиях животноводческих предприятий.
Так как качество каждой изготовляемой коммерческой серии вакцин невозможно проверить на соответствующем виде животных – крупном рогатом скоте и установить её иммуногенность, необходимо было выбрать соответствующую биологическую модель для проверки качества. Изучить антигенную активность и иммуногенность препарата при различных способах введения лабораторным животным. Провести анализ, сопоставив эффективность лабораторных экспериментов с аналогичными производственными показателями биопрепарата и на основе этих данных разработать методы лабораторного контроля вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота на иммуногенность.
В качестве биологической модели для изучения антигенной активности вакцин были использованы морские свинки.
Первоначально необходимо было изучить антигенную активность инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота на морских свинках при различных способах введения. Для этого три группы морских свинок серонегативных к хламидийному антигену, созданных по принципу аналогов, по 18 голов в каждой, вакцинировали внутримышечно, подкожно и внутрибрюшинно в дозе 0,5 см3 3-мя разными сериями вакцины – по 6 голов из каждой группы в асептических условиях.
Одновременно, аналогичных двух морских свинок (контрольных) тотально обескровливали, отделяли сыворотку крови и хранили ее до исследования в замороженном состоянии при минус 18-200С.
Взятие крови у вакцинированных морских свинок осуществляли на 21, 30 и 45 сутки после иммунизации. Полученные от вакцинированных и не вакцинированных (контрольных) морских свинок сыворотки исследуют в РСК в разведениях от 1:5 до 1:160 со специфическим хламидийным и контрольным антигенами. РСК проводят согласно инструкции по применению «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» утверждённой Заместителем Руководителя Россельхознадзора 03.03.2008 г.
Результаты изучения антигенной активности 3 экспериментальных серий инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота при различных методах введения морским свинкам приведены в таблице №42.
Приведенные в таблице №42 данные свидетельствуют, что максимальный уровень комплементсвязывающих противохламидийных антител (4,8±0,25 Лог2) формируется у морских свинок на 30-й день после однократной подкожной вакцинации. При внутримышечной и внутрибрюшинной вакцинации, накопление специфических комплементсвязывающих антител у морских свинок было заметно ниже, соответственно на 1,6 и 2,5 Лог2. Однако при внутрибрюшинном введении вакцины максимальное количество специфических антител (3,3±0,35 Лог2) выявлялось на 45-й день после вакцинации, но их уровень был несколько ниже, чем при подкожной вакцинации в этот же срок (4,2±0,62 Лог2). Следовательно, подкожное введение эмульсионной вакцины является наиболее эффективным методом иммунизации.
В дальнейшем нами были проведены опыты по изучению влияния кратности иммунизации на антигенную активность вакцин. При этом морских свинок вакцинировали одно- и двукратно экспериментальными эмульсионными вакцинами подкожно в дозе 0,5 мл. При двукратной иммунизации препараты вводили в дозе по 0,25 мл с интервалом 7 дней. Исследование сывороток проводили на 30 день. Результаты четырех серий опытов обобщены в таблице №43.
Уровень хламидийных антител в сыворотке крови морских свинок на 30 день после одно- и двукратной иммунизации (n=4, P0,05)
Приведенные в таблице №43 данные показывают, что при однократной иммунизации эмульсионной вакциной содержание специфических комплементсвязывающих антител в крови вакцинированных морских свинок на 30-й день колебалась в пределах 4,6-4,9 Лог2 ( в среднем 4,7±0,07 Лог2). Исследованием в РСК сывороток крови морских свинок при двукратной подкожной иммунизации с интервалом 7 дней при той же дозе вакцины, установлено увеличение содержания специфических антител до 5,3-5,6 Лог2 (в среднем 5,4+0,09 Лог2).
Следовательно, двукратное введение эмульсионной вакцины обуславливает у животных более интенсивное формирование иммунитета. Таким образом, в опытах на морских свинках было установлено, что максимальный уровень специфических комплементсвязывающих антител к хламидиозному антигену формируется у животных к 30 дню после двукратной с интервалом 7 дней подкожной иммунизации их инактивированной эмульсионной вакциной против хламидиозного аборта крупного рогатого скота.
Определение иммуногенности вакцины в лабораторных условиях. Учитывая, что штамм хламидии «250», использующийся для получения инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота, патогенен для белых мышей, нами были проведены опыты с целью разработки методов контроля вакцины на иммуногенность с использованием этих животных. Для этого предварительно установили патогенность производственного штамма хламидий «250» для белых мышей.
Заражение мышей проводили свежеполученной суспензией хламидий штамма «250», выращенных в желточном мешке РКЭ, в дозе 0,5 см3 внутрибрюшинно в разных разведениях: 10-1; 10-2; 10-3. Было проведено 3 серии опытов, в каждой из которых было заражено по 10 мышей каждым разведением инфекционного материала. 10 мышей служили в качестве контрольной группы. За мышами было установлено круглосуточное наблюдение в течение 14 дней с момента заражения. Результаты этих опытов обобщены в таблице №44.
Разработка и усовершенствование средств специфической профилактики хламидиоза животных
Как видно из таблицы, до начала опыта все 6 подсвинок были серонегативными в отношениях парвовируса и хламидиоза свиней. На 14-й день после вакцинации в сыворотке крови опытной группы животных в РТГА были обнаружены антигемагглютинины к парвовирусу свиней в титрах 1:256 (8,0 lg), на 56-й день - 1:512 (9,0 lg). В РСК с хламидийным антигеном комплементсвязывающие антитела обнаруживались на 56 после вакцинации в титрах 1:5-1:10 (3,2 lg).
Следовательно, испытуемая вакцина обладает антигенной активностью и обуславливает формирование специфических антител у свиней опытных групп, как и парвовирусному, так и хламидийному антигенам.
Контрольное заражение парвовирусом и хламидиями вакцинированных (опытных) и интактных (контрольных) подсвинок осуществлялось через 8 недель после вакцинации, т.е. на 30-43-й дни супоросности. Штамм «У-97» парвовируса свиней с титром 107,0–107,6 ТЦД50/мл был введен внутримышечно в дозе 2,0 см3 и перорально – 5,0 см3. Возбудитель хламидийного аборта свиней – штамм «РС-86» с титром 106,5 ЭЛД50 /0,3 мл инокулировали внутримышечно в дозе 2,0 см3 и перорально – 10,0 см3. После заражения за свиноматками в течение 3-х месяцев велось ежедневное клиническое наблюдение, а так же изучали динамику уровня специфических антител на 21 и 28 дни после контрольного заражения. Данные серологических исследований приведены в таблице №78.
Из таблицы следует, что на 21-й день после контрольного заражения титры антител к парвовирусному антигену контрольной и опытной групп свиней были одинаковыми и составляли в среднем 1:512 (9,0 lg). К 28 дню после заражения у контрольной группы животных титры антител к парвовирусу остались на прежнем уровне, а в группе вакцинированных свиней произошло снижение тиров антител до 1:256 (8,0 lg).
Несколько иная картина наблюдалась при исследовании в РСК с хламидийным антигеном: на 21-й день после заражения у невакцинированных животных отмечалось резкое повышение уровня специфических антител до 5,0±1,5 (M±m lg) и постепенное его понижение к 28 дню до 35±0,5 (M±m lg). У вакцинированных свиней уровень КС-антител на 21-й день после заражения повысился незначительно до 1:20 (4,0±0,lM±m lg), а на 28-й день ЭТОТ показатель снизился до 1:10 (3,3±0,5 M±m lg).
Спустя 6 недель после заражения был произведен контрольный убой по одной свиноматке из каждой группы и проведены вирусологические и бактриологические исследования плодов на предмет обнаружения парвовирусного и хламидийного антигенов. В результате проведенных опытов в суспензиях внутренних органов мумифицированных и мертвых плодов свиноматки контрольной группы в РГА был выявлен парвовирус и в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) – хламидийный антиген. В то же время в живых плодах свиноматки опытной группы антигены парвовируса и хламидий не были обнаружены. Результаты исхода супоросности подопытных животных отражены в таблице №79.
Из данных таблицы следует, что у двух вакцинированных и зараженных свиноматок родились нормально развитые жизнеспособные поросята по 9 и 12 голов соответственно. Эти поросята имели массу тела 1200-1300 грамм. При микроскопическом исследовании мазков-отпечатков из котиледонов плаценты этих свиноматок хламидии не обнаружены.
В контрольной группе у свиноматки, зараженной в период 40-дневной супоросности, родились 7 мертвых плодов и 4 нежизнеспособных поросенка, которые пали в течение 5-6 часов после опороса. У другой свиноматки, зараженной в 56-й день супоросности, исход беременности завершился рождением 5 мертвых и 4 нежизнеспособных поросят.
В сыворотке крови всех живых поросят, взятой до приема молозива, в РТГА с парвовирусным антигеном и в РСК с хламидийным антигеном антитела не выявлялись.
Следовательно, от оставшихся двух вакцинированных супоросных свиноматок получен 21 жизнеспособный, нормально развитый поросенок, а от двух не вакцинированных свиноматок – 12 мертворожденных и 8 нежизненоспособных поросят. Последние погибли в течение 5-6 часов после опроса.
Так же, из результатов проведенных исследований, можно было заключить, что использованные для разработки ассоциированной вакцины штаммы «РС-86» и «ЛС-89» - возбудители хламидийного аборта и пневмонии, а также штамм «У-97» - возбудитель парвовирусной болезни свиней при экспериментальном заражении вызывают нарушения органов воспроизводства у свиноматок и обладают достаточно высокой антигенной активностью. Это значит, что они могут быть использованы в качестве производственных штаммов для приготовления и контроля ассоциированной вакцины против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней.
На основании этого было разработано «Временное наставление по применению ассоциированной вакцины против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней, инактивированной и эмульгированной (в порядке производственного опыта) утвержденное Начальником ГУВ КМ РТ от 12 мая 1998 года [Приложение П].
Изучение эффективности применения вакцины против парвовирусной и хламидиозной инфекций свиней в производственных условиях.
Эффективность применения вакцины против парвовирусной и хламидиозной инфекции свиней в производственных условиях была испытана на базе свинокомплекса «Рощинский» Республики Башкортостан и в КП «Искра» Пестречинского Района Республики Татарстан.
В этих свиноводческих хозяйствах регистрировали высокий процент абортов у основных и ремонтных свиноматок, рождение мертвых и нежизнеспособных поросят. В результате проведенных серологических и вирусологических исследований была диагностирована парвовирусно-хламидийная смешанная инфекция, которая и послужила основным этиологическим фактором патологии воспроизводства у свиней в неблагополучных хозяйствах.
С целью оздоровления хозяйств, в схему лечебно-профилактических мероприятий, была включена активная иммунизация всего поголовья свиней против парвовирусной и хламидиозной инфекций разработанной нами в соавторстве с Х.З. Гаффаровым и М.З. Абдеевой ассоциированной вакциной.
Вакцинировали только клинически здоровых свиноматок, ремонтных свинок и хряков-производителей. Больных животных перед вакцинацией подвергали лечению антибиотиками тетрациклинового ряда и через 10-12 дней прививали.
Основных свиноматок первый раз вакцинировали за 2 недели до отъема поросят, ремонтных свинок – за 3-4 недели до осеменения. Затем свиноматок вакцинировали после каждого отъема поросят.