Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 15
1.1 Общие сведения о роде Escherichia 15
1.2 Эшерихиозная диарея телят 22
1.2.1 Лечение и профилактика эшерихиоза новорожденных телят 28
1.3 Эшерихиозная диарея поросят 34
1.3.1 Профилактика и лечение эшерихиоза поросят 40
1.4 Заключение по обзору литературы 43
1.5 Обоснование и поиск направлений по созданию новых средств, обладающих иммунопротекторными свойствами при колибактериозе телят и поросят
2 Собственные исследования 56
2.1 Материалы и методы исследований 56
2.1.1 Материалы 56
2.1.2 Методы исследований 57
3 Результаты собственных исследований 62
3.1 Состояние и тенденции развития животноводства в Нижегородской области РФ 62
3.2 Эпизоото логический мониторинг болезней свиней в Нижегородской области 67
3.3 Эпизоотологический и иммунологический мониторинг крупного рогатого скота в отдельных хозяйствах Нижегородской области 73
3.4 Изготовление полиантигенного комплекаса на основе пилезных антигенов и специфических иммуноглобулинов
3.4.1 Экстренная оценка (скрининг) эффективности потенциальных лечебно-профилактических препаратов в модельной in vitro тест-системе 88
3.4.2 Первичная оценка иммунотерапевтической активности сывороточных и тканевых глобулинов 92
3.4.3 Изучение возможности повышения иммунотерапевтического потенциала глобулинов при сочетании их с веществами зоогенного, фитогенного, микробного и минерального происхождения 95
3.4.4 Конструирование экспериментальных образцов унифицированного противоэшерихиозного лечебного композиционного препарата 105
3.4.4.1 Изучение токсичности и безвредности препарата «Пабисорб» на организм F 109
3.5 Оценка терапевтической эффективности противоэшерихиозного композиционного препарата «Пабисорб» на лабораторных и сельскохозяйственных животных 114
3.5.1 Изучение лечебного действия препарата «Пабисорб» на зараженных возбудителем эшерихиоза лабораторных животных 4
3.5.2 Определение оптимальной лечебной дозы препарата «Пабисорб» на поросятах и телятах 20
3.5.2.1 Испытание лечебной эффективности препарата «Пабисорб» в условиях хозяйств, неблагополучных по колибактериозу поросят 123
3.5.2.2 Испытание лечебной эффективности препарата «Пабисорб» в условиях хозяйств, неблагополучных по колибактериозу телят 129
3.5.2.3 Изучение лечебно-профилактического действия препарата «Пабисорб» при колибактериозе и внешнем у-облучении животных 134
3.6 Изучение иммуногенной активности комплексных субъединичных 4-пили вакцин на зараженных возбудителем
эшерихиоза лабораторных и сельскохозяйственных животных...
3.6.1 Разработка метода иммуноферментного анализа для обнаружения специфических антител Е. соїі в сыворотке крови телят и поросят F 142
3.6.2 Получение антигенного варианта антиэшерихиозных эритроцитарного и бентонитового диагностикумов для оценки поствакцинального гуморального иммунитета на фоне применения вакцины СП4ПВ
3.6.3 Оценка гуморального иммунного ответа у лабораторных животных, иммунизированных экспериментальными образцами субъединичной вакцины СП4ПВ 161
3.6.3.1 Изучение иммуногенной активности противоэшерихиозной вакцины СП4ПВ 167
3.6.4 Оценка эффективности разработанной вакцины для защиты телят и поросят от колибактериоза
3.6.4.1 Изучение профилактической эффективности субъединичной вакцины СП4ПВ для защиты телят
3.6.4.2 Изучение профилактической эффективности субъединичной вакцины СП4ПВ для защиты поросят Заключение 180
Рекомендация производству 206
Список сокращенных терминов 208
Список использованной литературы
- Лечение и профилактика эшерихиоза новорожденных телят
- Эпизоотологический и иммунологический мониторинг крупного рогатого скота в отдельных хозяйствах Нижегородской области
- Испытание лечебной эффективности препарата «Пабисорб» в условиях хозяйств, неблагополучных по колибактериозу телят
- Изучение профилактической эффективности субъединичной вакцины СП4ПВ для защиты телят
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Одной из сложнейших проблем, стоящих перед ветеринарной наукой и практикой, являются желудочно-кишечные болезни новорожденных телят и поросят инфекционной природы, которые имеют широкое распространение, сопровождаются высокой смертностью и наносят значительный экономический ущерб.
Установлено, что ведущее место в этиологии инфекционной диареи телят и поросят принадлежит энтеропатогенным штаммам Escherichia coli, обладающих широким набором серовариантов, продуцирующим адгезивные антигены К99, К88, F41, 987Р, А20, которым и принадлежит ведущая роль в развитии эшерихиозов (Гаффаров Х.З. и др., 2002; Зароза В.Г., 1991; Иванов А.В. и др., 2006; Попов Е.М. и др., 1991; Светоч Е.А. и др., 1997; Тугаринов О.А. и др., 1991; Шахов А.Г., 2003; Т. Asai, 2011). Немаловажное значение в развитии эшерихиозов среди молодняка играют комплекс предрасполагающих и сопутствующих факторов которым относят: нарушения обмена веществ, низкий уровень естественной резистентности и иммунологической реактивности у коров и свиноматок вследствие дисбаланса питательных веществ в рационах, содержание животных при неудовлетворительных параметрах микроклимата, нарушение гигиены проведения отелов и опросов, послеродовая патология у маточного поголовья, несвоевременная выпойка молозива новорожденным телятам, гипогалактия у свиноматок (Джупина СИ., 2001; Мищенко В.А., 2005; Папуниди К.Х., 2000; Петрянкин Ф.П., 2008; Сисягина Е.П., 2010; Смирнов A.M., 2010).
В настоящее время главным направлением борьбы с эшерихиозами является активная иммунизация стельных коров и супоросных свиноматок, с молозивом и молоком от которых специфические антитела поступают в организм новорожденных. Для этих целей разработаны и используются противоэшерихиозные вакцины (Дворкин Г.Л. и др., 1985; Иванов А.А. и др., 2012; Лавровская В.М. и др., 1993; Малахов Ю.А. и др., 1993; Новак Д.Д. и др., 1996; Пирожков М.К. и др., 1994; Спиридонов Г.Н. и др., 2011).
Следует отметить, что иммунизация стельных коров и супоросных свиноматок существующими вакцинами в ряде случаев не обеспечивает выраженный колостральныи иммунитет у нарождающего молодняка (Сидоров М.А. и др., 2008). Это по мнению ряда авторов (Гаффаров Х.З. и др., 2002; Зароза В.Г., 1991; Шахов А.Г. и др., 1995) связано с наличием у больных телят и поросят широкого набора серовариантов возбудителя Е. coli. Например, у больных телят обнаружены более 165 вариантов О-антигена, 55 Н-антигена и 90 вариантов К-антигена (Гаффаров Х.З. и др., 2002; Зароза В.Г., 1991). При типизации возбудителя колибактериоза выделенных от больных диареей поросят чаще всего обнаруживали эшерихии следующих серовариантов: Ol, 02, 04, 08, 015, 026, 078, О103, ОП9, 0126, 0137, 0138, 0139, 0141, 0147, 0149, а также А20, К99, К88, 987Р, F41 (Шахов А.Г. и др., 1995). В связи с этим для противоинфекционной защиты новорожденных телят
и поросят проводят пассивную иммунизацию путем парентерального и орального введения им специфических гипериммунных сывороток, иммуноглобулинов (Гайзатуллин P.P., 2012; Гаффаров, Х.З. и др., 1996; Малахов, Ю.А. и др., 1993; Сисягин, П.Н. и др., 2001; Федоров Ю.Н. и др., 2009). Следует однако отметить, что в лечебных сывороток биофабричного изготовления в ряде случаев наблюдается низкий титр антител, особенно к адгезивным антигенам К88, К99, 987Р и F41, а также ТЛ- и ТС-энтеротоксинам. Поэтому имеется необходимость усовершенствования существующих и создания нового поколения вакцин против эшерихиозов, а также лечебных средств на основе современных достижений биотехнологии и иммунологии. При этом получение и очистка специфических и иммуногенных белков из Е. соН и изыскание средств и способов повышения их антигенной активности, позволяющих увеличить продолжительность и напряженность колострального иммунитета у телят и поросят, является весьма актуальной.
Степень разработанности темы. Значительным достижением в области изучения антигенной структуры Е. соН стало обнаружение у микроба образований, играющих роль органа адгезии бактерии к клеткам макроорганизма, названными адгезивными фимбриями или пили (Jann К. et al., 1987; JsaacsonR., 1986; KuzuyaM., 1988; Nataro J.P. et al, 1987).
Применение вакцины против колибактериоза из очищенных пилей типа 1, содержащей антигены К88, К99 и 987Р приводило к существенному снижению смертности от эшерихиоза поросят и телят (То S.C. е.а., 1983; 1984).
Однако опыт создания и использования субъединичных вакцин против эшерихиоза в нашей стране небольшой, что диктует необходимость разработки и всесторонней оценки эффективности таких вакцин (Светоч Е.А и др., 1997).
С целью повышения эффективности вакцинопрофилактики и лечебных средств ряд исследователей рекомендуют применять их в комбинации с продуктами пчеловодства (Андреева А.В., 2003; Исмагилов A.M. и др., 2000; Кивалкина В.П., 1948; Кивалкина В.П., 1948; Кивалкина В.П. и др., 1991; МаннаповаР.Т. и др., 2000; Панин А.Н. и др., 2000; Тетерев И.И., 1998).
Как видно проблема поиска новых, высокоэффективных средств и способов повышения антигенной активности вакцины против эшерихий, а также изучение иммуностимулирующих и иммуномодулирующих свойств апипрепаратов в сочетании с вакцинными и лечебными средствами является весьма актуальной.
Все вышеизложенное послужило основанием для проведения исследований по разработке композиционного препарата, включающего глобулины, продукты пчеловодства, продукты метаболизма пробиотических микроорганизмов и природные адсорбенты, а также полиантигенного комплекса на основе пилезных (фимбриальных) антигенов в сочетании с продуктами пчеловодства и высоко дисперсным природным адсорбентом.
Цель и задачи. Целью исследований явилось разработка технологии получения новых средств специфической профилактики и лечения телят и поросят от эшерихиоза.
Для выполнения вышеуказанной цели были поставлены следующие задачи:
- провести эпизоотологический мониторинг болезней свиней и крупного
рогатого скота в Нижегородской области;
- теоретически обосновать возможность и необходимость получения
лечебно-профилактических средств нового поколения;
- разработать полиантигенный комплекс на основе пилезных антигенов и
иммуномодуляторов для профилактики эшерихиоза телят и поросят;
- разработать иммунотерапевтический композиционный препарат на
основе иммуноглобулинов, апифитопродуктов и минеральных сорбентов;
- определить токсичность и безвредность полученных лечебно-
профилактических средств на лабораторных животных;
провести оценку лечебно-профилактической эффективности разработанных средств на лабораторных и сельскохозяйственных животных;
изучить формирование противоэшерихиозной защиты животных на фоне применения разработанных лечебно-профилактических средств;
разработать наборы препаратов и инструкции по их применению для выявления антител к бактериям Е. coli методом иммуноферментного анализа, реакции непрямой гемагглютинации и реакции бентонитовой флокуляции.
Научная новизна. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность получения противоэшерихиозной субъединичной вакцины на основе пилезных антигенов К88, К99, 987Р и F41, выделенных из энтеротоксигенных штаммов Е. coli методом афинной хроматографии. Однократное подкожное введение субъединичной четырехпилезной вакцины стельным коровам и супоросным свиноматкам индуцирует в их организме выработку специфических антител с последующей передачей специфических антител молозивом новорожденным телятам и поросятам. Колостральный иммунитет обеспечивает сохранность телят и поросят в 90-92,8% случаях в очаге колибактериоза. С учетом патогенеза эшерихиозной инфекции разработан лечебно-профилактический препарат «Пабисорб» на основе специфических глобулинов, бифидогенных и сорбционно-детоксикационных средств. Показано, что лечебно-профилактическое действие «Пабисорба» реализуется путем гемо- и миелопротекторного действия иммуноглобулинов, а также антиоксидантного и антибактериального действия апипродуктов, бифидогенного и детоксицирующего действия микрочастиц природного минерала-монтмориллонита.
Разработаны наборы препаратов для выявления антител в сыворотке крови к бактериям Е. coli методом иммуноферментного анализа (ИФА), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакции бентонитовой флокуляции. По результатам исследований подана заявка на изобретение №2014118171 от 5 мая 2014 года.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные указывают на фундаментальное значение антигенной структуры возбудителя эшерихиоза, в которой ключевую роль играют пилезные антигены, обеспечивающие в оптимальных количественных соотношениях в полиантигенном комплексе индуцировать выработку специфических антител в организме стельных коров и супоросных свиноматок с последующей передачей их молозивом новорожденным телятам и поросятам. Установленная возможность получения полиантигенного комплекса с иммуномодулятором нового поколения - природным биополимером - апизаном открывает перспективу использования последнего в качестве иммуностимулирующего, но и активатора иммунофармакологического действия композиционного противоэшерихиозного лечебного препарата.
На основании собственных исследований разработаны:
-
Методические указания по диагностике, профилактике и лечению колибактериоза телят и поросят с применением средств, полученных на основе бионанотехнологии (в порядке производственного испытания). Утв. академик - секретарем Отделения ветеринарной медицины Российской академии сельскохозяйственных наук, академиком РАСХН A.M. Смирновым 17.10.2013г.
-
Инструкция по применению субъединичной вакцины против колибактериоза телят и поросят (в порядке производственного опыта). Утв. директором ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», член-корр. РАН, профессором А.В. Ивановым и согласована начальником ГУВ Кабинета Министров Республики Татарстан А.Г. Хисамутдиновым.
-
Инструкция по применению «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Echerichia coli методом иммуноферментного анализа». Утв. директором ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», член-корр. РАН, профессором А.В. Ивановым и согласована начальником ГУВ Кабинета Министров Республики Татарстан А.Г. Хисамутдиновым.
-
Технические условия на набор препаратов для выявления антител к бактериям Echerichia coli методом иммуноферментного анализа (в порядке производственного испытания) Утв. директором ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», член-корр. РАН, профессором А.В. Ивановым и согласована начальником ГУБ Кабинета Министров Республики Татарстан А.Г. Хисамутдиновым.
-
Инструкция по применению «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Echerichia coli методом реакции непрямой гемагглютинации». Утв. директором ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», член-корр. РАН, профессором А.В. Ивановым.
-
Инструкция по применению «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Echerichia coli методом реакции бентонитовой
флокуляции». Утв. директором ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», член-корр. РАН, профессором А.В. Ивановым.
Методология и методы исследований. Методологической основой проведенных исследований явилось обоснование конструирования вакцинного полиантигенного комплекса на основе пилезных антигенов и иммуномодуляторов для профилактики эшерихиоза телят и поросят, иммунотерапевтического композиционного препарата на основе иммуноглобулинов, апифитопродуктов и минеральных сорбентов.
Объектом исследований являлись крупный рогатый скот и свиньи различного возраста (в том числе новорожденные телята и поросята), кровь, внутренние органы мышей, белых крыс, кроликов, а также микроорганизмы и первичные культуры лимфоцитов.
Исследования проводились с использованием следующих методических подходов:
1. Выделение и очистка пилезных антигенов из токсигенных Е. coli
методом афинной хроматографии.
-
Микроскопические - определение с использованием светового микроскопа тинкториальных и морфологических свойств бактерий в мазках отпечатках из проб органов и культур бактерий.
-
Бактериологические - изучение культуральных характеристик бактерий с использованием методов выделения чистых культур.
-
Биологические - иммунизация разработанными комплексными антигенами и заражение референтными штаммами Е. coli лабораторных животных и изучение иммунологических показателей у иммунизированных сельскохозяйственных животных.
-
Серологические - разработка и постановка ИФА, РИГА, реакции бентонитовой флокуляции и РА, а также выделение гисто- и сывороточных иммуноглобулинов в соответствии с общепринятыми в иммунологии методами.
-
Токсикологические - в процессе составления многокомпонентных вакцинных и лечебных препаратов определяли их совместимость, безвредность, токсичность, раздражающие свойства в соответствии с общепринятыми в токсикологии, иммунологии, вакцинно-сывороточном деле методами.
7. Статистические - обработку экспериментально полученного
цифрового материала проводили методом вариационной статистики с
применением критерия достоверности по Стьюденту на персональном
компьютере с использованием программного пакета «Microsoft Excel 2007»,
«Microsoft Word 2007».
Положения, выносимые на защиту:
- Субъединичная противоэшерихиозная вакцина разработанная на основе пилезных антигенов К88, К99, 987Р, F41, аписогенного иммуностимулятора и
минерального иммуносорбента индуцирует выработку специфических антител в организме стельных коров и супоросных свиноматок.
- Колостральный иммунитет обеспечивает сохранность телят и поросят в
90-91,8% случаях в очаге колибактериоза.
Композиционный инъекционный препарат «Пабисорб» сконструированный с использованием специфического иммуноглобулина, этанолового экстракта биологически активный кормовой добавки «Вита-Форце М», метаболизма B.bifidum и микрочастицы минерального иммуносорбента - монтмориллонита является нетоксичным и безвредным.
Однократное подкожное введение инъекционного препарата «Пабисорб» в дозах 1,0-1,5 см оказывает выраженное профилактическое действие при колибактериозе телят, предохраняя от заболевания 60-80% животных.
- Разработаны и утверждены методические указания по диагностике,
профилактике колибактериоза телят и поросят с применением средств,
полученных на основе бионанотехнологии, диагностические наборы для
выявления специфических антител к Е. coli в сыворотке крови животных
методом ИФА, РНГА и реакции бентонитовой флокуляции (РБФ).
Степень достоверности и апробация материалов диссертации. Исследования выполнены на большом поголовье лабораторных и сельскохозяйственных животных. Проведен статистический анализ полученного материала с использованием компьютерных программ. Научные выводы и практические предложения теоретически и экспериментально обоснованы, что подтверждается фактическими данными. Они логически вытекают из содержания работы, согласуются с поставленными целью и задачами.
Основные результаты исследований доложены, обсуждены и одобрены на отчетных сессиях ученого Совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по рассмотрению отчетов НИР (Казань, 2008-2014), на Международных и Всероссийских научно-практических конференциях (Казань, 2011, 2012, 2013, 2014).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 15 статей в журналах, рекомендованных ВАК России, 5 нормативных документа.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 313 страницах, состоит из введения, обзора литературы, основной части, заключения, списка сокращенных терминов, списка использованной литературы и 8 приложений.
Работа иллюстрирована 44 таблицами. Список литературы включает 392 источника, в том числе 88 на иностранных языках.
Лечение и профилактика эшерихиоза новорожденных телят
Наиболее часто заболевания, вызываемые ЭПКП, регистрируют у детей младше 6 месяцев. В экспериментах на добровольцах показано, что после нейтрализации кислого желудочного сока, инфицирующая доза ЭПКП составляет 108-1010 микробных тел [350]. Тем не менее к настоящему времени зарегистрированы эпидемические вспышки и у взрослых [321, 349, 388], а также отдельные случаи инфекции у лиц с сопутствующими заболеваниями (сахарный диабет, ахилия) [349, 380].
Пути передачи возбудителей: фекально-оральный - через инфицированные пищевые продукты и воду, контактный (реже), определенную роль могут играть членистоногие переносчики. Известны случаи госпитальных вспышек [308, 311, 392]. Резервуар возбудителей: дети как с клинически выраженными, так и с бессимптомными инфекциями (основной), взрослые носители, а также, предположительно, крупный рогатый скот [327, 351].
Патогенез поражений включает три этапа: адгезию бактерий на эпителии тонкого кишечника и «сглаживание» микроворсинок каемчатого эпителия кишечника, повреждение цитоскелета энтероцитов и развитие секреторного ответа.
Механизм и адгезии бактерий на эпителии тонкого кишечника и «сглаживание» микроворсинок каемчатого эпителия кишечника следующий: все гены, необходимые для реализации феномена «прикрепление-сглаживание», расположены в хромосомном «острове патогенности» LEE (англ. Locus of enterocyte effacement, локус «сглаживания» энтероцитов). Он включает кластеры генов: esp, esc (англ. Е. coli secretion, кластер секреции Е. coli), sep (англ. Secretionof Е. coli proteins, кластер секреции Е. coli), еае (англ. Е. coli attaching and effacing, кластер «прикрепления-сглаживания» Е. coli, кодирующий синтез интимина) и tir [361, 363, 376]. Среди факторов адгезии Е. coli выделяют: пили, инфекционные токсины, белок Tir.
Первичное взаимодействие ЭПКП с энтероцитами включает образование первичной, достаточно дистанцированной связи, обусловленной активностью BFP (англ. Bundle-forming pilus, пиля, образующая пучки) IV типа. Свое название BFP получили из-за способности образовывать агрегаты, напоминающие «пучки веревок». Образование BFP кодируют гены плазмиды EAF (англ. Enteropathogenic adherence factor, энтеропатогенный фактор адгезии) [318, 352, 353, 360, 364]. Пили представляют собой филаменты диаметром 7 нм. Терминальные N-последовательности BFP аналогичны таковым у TCP Vibrio cholera и прочим пилям IV типа. При адгезии на энтероците эти агрегированные пили бактерий устанавливают достаточно прочную «кабельную связь» с рецепторами клетки, после чего кишечные палочки формируют микроколонии на поверхности эпителия, прочно соединенные между собой. Прикрепление бактерий на энтероциты индуцирует образование секреторного комплекса III EspA, EspB и EspD, в энтероцит. При этом EspA образует дополнительный филамент, связывающий бактерию и энтероцит [345]; EspF способствует созданию еще более тесной связи между бактерией и клеткой-мишенью [362, 389]; EspB и EspD нарушают функционирование мембранных сигнальных систем и формируют «поры» в клеточной мембране, через которые инъецируется молекула белка Tir, где она фосфорилируется, образуя рецептор для интимина. Однако ранее считалось, что адгезия ЭПКП индуцирует фосфорилирование тирозин-содержащих белков, главный из которых -тирозин-фосфорилированный белок Нр 90 (90 кДа), встроенный в клеточную мембрану, представляет собой рецептор, с которым взаимодействует мембранный адгезии ЭПКП - интимин (94 кДа), кодируемый еае геном [328, 343, 344, 371, 372, 373]. Tir после фосфорилирования представляет собой димер, мономеры которого имеют вид спирали и формируют замкнутую петлю, располагающуюся между бактерией и клеточной мембраной. К ее проксимальным участкам прикрепляются молекулы поверхностного адгезина ЭПКП - интимина [329, 356]. В последующем происходит повреждение цитоскелета энтероцитов следующим образом: адгезия ЭПКП на эпителиальных клетках in vitro увеличивает в них внутриклеточное содержание Са2+, что существенно уменьшает полимеризацию актина и обуславливает специфические повреждения, вызываемые ЭГЖП [310, 322, 369]; фосфорилирование Tir приводит к образованию двух сериновых [390] и одного тирозинового (Y474) производных. Фланкирующие остатки Tir и Y474 взаимодействуют с адаптерным белком Nek [325, 330], который активирует нейронные белки. Первоначально они имеют форму «чаш», но, постепенно удлиняясь, образуют «пьедесталы», на которых располагаются ЭГЖП. Пьедесталы состоят из плотно упакованных цитоскелетных белков: а-актинина, легких цепей немышечного миозина, прикрепленных к клеточной мембране молекулами талина и эзрина [239, 342, 355].
Таким образом, в отличие от многих возбудителей кишечных инфекций, ЭГЖП не распознают какие-либо рецепторы для специфической адгезии на энтероцитах, а сами синтезируют его предшественников и «имплантируют» их в клеточную мембрану.
Поражения, вызываемые ЭГЖП, причисляют к диареям, а по мнению O.K. Поздеева, Р.В. Федорова [193], это не совсем верно, так как при вызываемых ими поражениях ведущее место принадлежит функциональным нарушениям в энтероцитах, а не развитию воспалительного ответа. Характерные клинические проявления диареи, вызванной ЭГЖП: выраженная абдоминальная боль, рвота и водянистый стул без примеси крови. Среди прочих форм коли-инфекции заболевания, вызванные ЭГЖП, протекают наиболее длительно и могут продолжаться две недели и более.
Большинство эпидемических вспышек вызывают штаммы-продуценты ST [307, 319, 320, 353, 358, 370, 375, 377]. Патогенез поражений включает: адгезию бактерий на эпителии тонкого кишечника, выделение токсинов и развитие секреторного ответа.
Эпизоотологический и иммунологический мониторинг крупного рогатого скота в отдельных хозяйствах Нижегородской области
Исходными материалами служили результаты собственных исследований и данные ветеринарной отчетности. При этом учитывали распространение болезни, заболеваемость, смертность, летальность, возрастные особенности и сезонную динамику, бактерионосительство и экономический ущерб, наносимый колибактериозом. Основные эпизоотологические показатели определяли по методике И.А. Бакулова с соавт. [21]. Распространение болезни, сроки заболевания, сезонную динамику регистрировали в каждом хозяйстве с учетом условий содержания и выращивания поросят и телят.
Характер проявления и клиническое течение колибактериоза поросят и телят наблюдали у 233 больных животных различных возрастов.
Патологоанатомические изменения изучали при вскрытии 153 трупов поросят и телят, в условиях санитарной бойни хозяйства по общепринятой методике. Диагноз на колибактериоз устанавливали на основании данных эпизоотологического обследования, клинических признаков, патологоанатомических изменений с проведением бактериологического исследования, материалом для которого служили трупы павших и вынужденно убитых поросят и телят. Бактериологические исследования патологического материала проводили согласно «Методическим указаниям по бактериологической диагностике кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» [160]. Видовую принадлежность микроорганизмов определяли в соответствии с рекомендациями, изложенными в определителе зоопатогенных микроорганизмов.
Выделение культур кишечной палочки из патологического материала от поросят и телят, павших от колибактериоза проводили по методике М.Н. Еремеева [82]. При этом содержимое кишечника, мезентериальных лимфатических узлов (посмертно), фекалии (прижизненно) суспендировали в физиологическом растворе и засевали на среду Эндо, а затем выросшие колонии Е.соН - в кровяной агар и бульон. По окраске (кровяно-лаковый цвет) бульонной культуры определяли гемолитические свойства изучаемого штамма. Посевы кишечного содержимого первоначально засевали на среду Эндо с последующим пересевом изолированных колоний в бульон с кровью. У выделенных штаммов кишечной палочки определяли морфологические, культуральные, биохимические, гемолитические, серологические и патогенные свойства. Культуральные свойства гемолитических штаммов кишечной палочки изучали по результатам роста на МПБ, МПА, ГТЖА (рН=7,2-7,4) и агаре Эндо после инкубирования посевов в термостате в течение 18-24 ч при температуре 37С. Тинкториальные и морфологические свойства выделенных культур устанавливали путем микроскопирования мазков из агаровых и бульонных культур, окрашенных по Граму. Морфологию полученных колоний изучали микроскопией в косопадающем свете. Для этого исследуемые культуры засевали по методу Дрегальского на поверхность 1,5%-ного просветленного МПА.
Для изучения серологических свойств кишечной палочки использовали стандартные наборы агглютинирующих О-коли сывороток, выпускаемых Армавирской биофабрикой, состоящих из 4 поливалентных и 30 моновалентных сывороток к серовариантам 01, 02, 04, 08, 09, 015, 018, 020, 026, 033, 035, 041, 055, 078, 086, 0101, 0103, 0111, 0115, 0117, 0119, 0126, 0127, 0137, 0138, 0139, 0141, 0142, 0147, 0149. Реакцию агглютинации ставили согласно наставлению по их применению.
Патогенность культур кишечной палочки с определением LD5o устанавливали на белых мышах живой массой 14-16 г путем внутрибрюшинного введения смыва суточной агаровой культуры. Культуры считались патогенными в случае гибели одной или более мышей в первые 4 суток после заражения.
Для определения LD5o готовили последовательные десятикратные разведения из 500 млн микробной взвеси, из каждого разведения по 0,5 мл взвеси вводили внутрибрюшинно 6 мышам. Результаты учитывали в течение 7 дней. Для расчета LD5o использовали метод Рида-Менча. Изолирование и очистку адгезивных антигенов осуществляли согласно методике, разработанной KuzuyaM. et al. [348].
В состав вакцины кроме адгезивных антигенов (пили) вводили иммуномодуляторы (Т-активин, а также апизан, полученный из подмора пчел). Методы и способы получения вакцины и специфических иммуноглобулинов, схемы их применения изложены в разделе «Результаты исследований».
При изучении возможности усиления терапевтической эффективности испытуемых средств, с целью составления многокомпонентных смесей и композиций на основе веществ фито-зоо-микробного и минерального происхождения, определяли их совместимость, безвредность, токсичность, раздражающие свойства, эмбриотоксичность и тератогенность в соответствии с общепринятыми в токсикологии, иммунологии, вакцинно-сывороточном деле сертифицированными методиками.
Гематологические и биохимические исследования крови проводили на анализаторе «Express Plus».
Содержание иммуноглобулинов А, М и G в крови животных и их концентрацию в молозиве коров и свиноматок определяли с помощью иммуноферментного анализатора «Униплан».
Количество Т-лимфацитов в крови определяли методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, В-лимфоцитов - методом комплементарного розеткообразования с использованием стандартного кроличьего гемолизина в качестве комплемента - свежей сыворотки коров.
Бактерицидную активность сыворотки крови определяли по О.В. Смирновой и Т.А. Кузминой [220], лизоцимную - по методу В.Г. Дорофейчук [74], фагоцитарный индекс и число - по И.П. Кондрахину [125]. Полученный в ходе экспериментов цифровой материал подвергали статистической обработке с использованием общепринятых параметрических методов, степень достоверности различий между сравнительными показателями определяли по критерию Стъюдента с применениями программ Microsoft Excel, Word 2007.
Испытание лечебной эффективности препарата «Пабисорб» в условиях хозяйств, неблагополучных по колибактериозу телят
Животных контрольных и опытных (зараженных и леченных) групп содержали в идентичных условиях. За животными вели клиническое наблюдение, регистрируя число павших и выживших в соответствующих группах.
Результаты наблюдения за животными показали, что уже через 3-4 ч после заражения у животных появились клинические признаки заболевания: животные забивались в угол, скучивались, отказывались от корма и воды, не реагировали на внешние раздражители, развивалась адинамия. Первый случай падежа был зарегистрирован через 16 ч, второй - через 19 ч и третий - через 26 ч после заражения. В течение первых суток после заражения пали 2 белые мыши, на 2-е сут - 6, на 3-е сут - 4 и на 4-е сут - 3 животных. Часть животных была убита и у них тотально брали пробы крови и получали сыворотку для проведения иммуногематологических исследований с определением содержания лейкоцитов, моноцитов, лимфоцитов (общего количества, Т- и В-клеток, а также их субпопуляций Т-хелперов, Т-супрессоров), иммуноглобулинов класса G, фагоцитарной активности нейтрофилов, лизоцимной и бактерицидной активности сыворотки крови.
На вскрытии павших и убитых животных установлено, что патологоанатомические изменения локализовались преимущественно в тонком отделе кишечника и характеризовались анемичностью слизистой оболочки, гиперемией слизистой желудка со студенистым инфильтратом; катарально-геморрагическим воспалением слизистой тонкого кишечника. Регионарные лимфатические узлы увеличены, гиперемированы. Лимфатический аппарат прямой кишки (пейеровы бляшки, солитарные фолликулы) гиперплазирован и гиперемирован. Селезенка имеет темно-серую окраску, слегка увеличена в объеме, бугристая, плотная. Печень и почки анемичны, сосуды головного мозга инъецированы кровью, ткань отечна.
Для подтверждения диагноза на эшерихиоз проведены бактериологические исследования материала (фекалий, пробы из органов и тканей) от больных, павших и убитых с диагностической целью животных.
Культуры, полученные из органов зараженных возбудителем эшерихиоза белых мышей, подвергали дальнейшему исследованию с целью определения патогенности выделенных изолятов. Для определения патогенности, белых мышей (по 3 животные) живой массой 16-18 г заражали внутрибрюшинно смесью суспензий агаровых культур, выделенных из 2-х внутренних органов, в дозе 500 млн. микробных клеток. Культуру считали «патогенной» в случае гибели одной или более мышей в течение 2-х сут после заражения.
Результаты динамического наблюдения за контрольными, зараженными и леченными изучаемыми препаратами животными, а также результаты гематологических, иммунологических показателей и микробиологических исследований показали, что при однократном подкожном введении инъекционной формы препаратов «Пабисорб» и «Пабисорб 1» проявлялось их модифицирующее действие, как на течение эшерихиозной инфекции, так и на указанные показатели инфекционного процесса (табл. 16).
Из данных таблицы видно, что поражение организма белых мышей возбудителем эшерихиоза сопровождалось развитием лейкопении (уменьшение содержания лейкоцитов в 2,81 раза Р 0,01), нейтропении (снижение количества нейтрофилов в 4,5 раза, Р 0,001), лимфопении (снижение количества лимфоцитов в 2,57 раза, Р 0,01) и моноцитопении (снижение количества моноцитов в 1,83 раза, Р 0,01).
Кроме того, результаты проведенных работ показали, что течение эшерихиозной инфекции в зараженном вирулентным штаммом Е. coli «КВ-1» организме сопровождалось существенными отклонениями в системе клеточного и гуморального иммунитета. При этом на момент опытных животных от эшерихиозной интоксикации наступило почти двукратное (в 1,96 раза, Р 0,05) снижение содержания В-лимфоцитов при одновременном увеличении (в 1,16 раза, Р 0,05) численности Т-лимфоцитов. Повышение содержания Т-лимфоцитов происходило за счет уменьшения Т-хелперов при одновременном увеличении содержания Т-супрессоров.
Снижение количества Т-хелперов при одновременном увеличении количества Т-супрессоров сопровождалось ингибированием синтеза иммуноглобулинов - у пораженных эшерихиозом животных последовало резкое (в 1,86 раза, Р 0,01) снижение содержания иммуноглобулинов класса G (IgG) по сравнению с контрольным уровнем, а также снижение бласттрансформирующей активности лимфоцитов (в 1,99 раза, Р 0,01).
Принимая во внимание то, что состояние аутомикрофлоры является одним из наиболее свойственных показателей изменения иммунобиологической реактивности организма под действием разнообразных стрессогенов, и для выявления лечебного действия испытуемого препарата представлялось необходимым изучить особенности развития аутоинфекции у животных после заражения возбудителем эшерихиоза и лечения препаратами «Пабисорб» и «Пабисорб 1».
Для отслеживания наиболее характерных изменений аутомикрофлоры при заражении и применении испытуемых лечебных средств, мы ограничились определением частоты высевов и содержания Е. coli и Enterobacter на 1 грамм ткани, выросших на среде Эндо. Для этого у павших и убитых в агональной стадии эшерихиозного поражения животных, отбирали пробы материала из тонкого (тощая и подвздошная) отдела кишечника, готовили навески органов по 1 г, гомогенизировали, готовили различные разведения (1:100-1:1000) гомогенатов и по 0,1 мл засевали на дифференциальную среду Эндо. Жидкость вносили на поверхность среды пастеровской петлей и тем же инструментом проводили посев на вторую чашку Петри. Через 1, 2, 3 сут после заражения и лечения животных испытуемыми препаратами, определяли частоту положительных высевов Е. coli и Enterobacter - один из наиболее частых причинных факторов летальных инфекционных осложнений; определяли также количество микроорганизмов на 1 г ткани.
Было установлено, что однократная подкожная инъекция испытуемых средств уже на 3-й сут вызывала значительное снижение частоты высевов E.coli и Enterobacter из проб тощей и подвздошной кишок, а также достоверное снижение численности микробов на 1 грамм ткани, предотвращая заселение тонкого кишечника условно патогенными грамотрицательными микробами. Таким образом, изучение влияния препаратов на течение и исход экспериментального эшерихиоза показало, что последующее за заражением введение композиционных препаратов «Пабисорб» и «Пабисорб 1» оказывало модифицирующее действие на инфекционный процесс, увеличивая выживаемость зараженных вирулентным штаммом возбудителя эшерихиоза животных.
Изучение профилактической эффективности субъединичной вакцины СП4ПВ для защиты телят
Для проверки специфичности и активности проводили постановку реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) с положительной (поливалентной колибактериозной) и отрицательной (нормальной) сыворотками, определяя при этом максимальные титры антител с положительной и отрицательной сыворотками, и полученный препарат использовали в дальнейшем для определения поствакцинальных антител в исследуемых пробах (сыворотках).
Активность, полученных на первом этапе работ иммунохимических компонентов (антигенный эритроцитарный диагностикум, стандартная анти К99-сыворотка) испытали в РНГА-тест-системе. Для этого сперва определяли титр анти К88, К99, 987Р и F41 - сывороток, полученных от иммунизированных 4-пили комплексным антигеном кроликов, взятых на 30-й день после иммунизации. Исходный раствор антител в объеме 100 мкл вносили в первую лунку иммунологического планшета и делали двукратные разведения до конечного титра (1:4096). Затем в каждую лунку раскапывали по одной капле (30 мкл) АГЭД (сенсибилизированные 4-пили антигенами формалинизированные и танизированные эритроциты барана), содержимое перемешивали и ставили в термостат на 2 часа. По истечении указанной экспозиции проводили визуальную читку реакции и по степени гемагглютинации эритроцитов определяли титр антител испытуемой сыворотки.
Результаты иммунохимического анализа активности контрольной анти-4-пили - сыворотки показали, что она вступала в реакцию с гомологичным 4-пили антигеном в разведении 1:256 (8 log2).
Полученный антигенный эритроцитарный диагностикум (АГЭД) в дальнейшем использовали в РИГА тест-системе для изучения агглютиногенных свойств 4-пили вакцины, т.е. для регистрации поствакцинальных антител в организме привитых испытуемыми вариантами вакцин животных.
Одновременно проводили исследования по получению антигенного варианта бентонитового диагностикума (АГБД) по методике, описанной Гайзатуллиным P.P. [45]. Опыты проводились совместно с профессором Низамовым Р.Н.
При проведении настоящих исследований мы исходили из того, что в производственных условиях РИГА тест-система с использованием эритроцитарного диагностикума является более приемлемой и удобной. Однако воспроизводимость данной реакции зависит от высокой чувствительности эритроцитов к колебаниям факторов внешней среды (температура, рН, присутствие химикатов и др.), приводящих к снижению автивности эритроцитарного препарата. Для устранения указанных технологических проблем, рядом ученых были испытаны различные химические сорбенты, в частности, бентониты, которые в реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) значительно превосходят по активности свой известный аналог - РИГА с использованием сенсибилизированных эритроцитов по наиболее важным характеристикам, таким как чувствительность, стабильность и время исследования.
С учетом того, что поиск средств и методов повышения эффективности иммунологических тест-систем для индикации антигенов и регистрации поствакцинальных и постинфекционных антител в организме животных является одной из важнейших задач иммунохимии, нами были проведены настоящие работы.
Целью настоящих исследований явилась разработка технологии приготовления антигенного бентонитового диагностикума (АГБД), с использованием полученных образцов бентонитов, подвергнутых фракционированию и технологической активации для проведения реакции агглютинации на бентоните (реакция бентонитовой флокуляции - РБФ). Для чего отобрали 3 образца бентонитов Тарн-Варского, Биклянского и Березовского месторождений, подвергнутых термохимической активации.
Процесс изготовления АГБД происходила в два последовательных этапа. На первом этапе проводили сенсибилизацию (нагрузку) микрочастиц бентонита серологически активным веществом (сенситином), на втором -агглютинацию предварительно сенсибилизированных частиц бентонита. При этом чувствительность РБФ, а следовательно, и сопоставимость полученных результатов, в большей степени зависела от условий сесибилизации микрочастиц бентонитового сырья. Стандартизация реакции бентонитовой флокуляции а также достижение наивысшей чувствительности реакции предусматривало как выяснение способов достижения наибольшей эффективности активации сырья, так и наиболее оптимальных условий для взаимодействия с сенситином. Для достижения этой цели требовалось решение следующих задач - подбор оптимальных параметров соотношения сенситина и бентонита, экспозиция и режим температуры в процессе сенсибилизации, совместное действие которых обеспечивало бы наивысшее иммунохимическое взаимодействие бентонита и антигена. Исходя из этого, перед проведением сенсибилизации бентонита готовили из него водную суспензию с разными концентрациями (0,14; 0,16; 0,18; 0,20; 0,22; 0,24; 0,26%). Выяснили, что при 0,2%-ной концентрации бентонита оседание частиц сорбента наблюдалось в виде плотных точек, удовлетворительно обнаруживаемых при глазомерной оценке характера оседания адсорбента. Следовательно, для сенсибилизации мы применяли бентонитовую суспензию, приготовленную путем суспендирования 200 мг бентонита в 100 мл дистиллированной воды, в следствие чего получали наиболее эффективную суспензию иммуносорбента. В качестве сенситина использовали субъединичный 4-пили полиантиген, полученный согласно схеме, изложенной нами в разделе 3.4 диссертации. С целью определения оптимального соотношения бентонитовой суспензии и сенситинанами было составлено и испытано 9 различных соотношений бентонитовой суспензии и полиантигенного компонента.