Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 13
1.1. Некробактериоз и болезни копытец (БПК) крупного рогатого скота (распространение, экономический ущерб, этиология и патогенез) .13
1.2. Fusobacterium necrophorum в патологии пальцев и копытец 2 0
1.3. Классификация и основные формы болезни пальцев и копытец 30
1.4. Диагностика болезней пальцев и некробактериоза 35
1.5. Профилактика, лечение и меры борьбы с болезнями пальцев и некро бактериозом 40
1.6. Иммунитет и специфическая профилактика некробактериоза 50
ГЛАВА 2 Материалы и методы .61
2.1. Материалы исследований 61
2.2. Методы исследований 64
ГЛАВА 3 Результаты собственных исследований
3.1. Причины и факторы распространения некробактериоза и болезней пальцев крупного рогатого скота 71
3.2. Разработка унифицированной системы оценки болезней пальцев и диагностики некробактериоза .95
3.3. Изучение биологических свойств, ультратонкого строения F.necrophorum и их молекулярно-генетический анализ 116
3.4. Разработка технологии изготовления вакцины для профилактики некробактериоза 140
3.4.1. Изучение возможности вакцинопрофилактики некробактериоза и выбор производственных штаммов 140
3.4.2. Изыскание оптимальной питательной среды для крупномасштабного культивирования F.necrophorum .143
3.4.3. Конструирование экспериментальных вариантов вакцины, определение их специфичности и антигенной активности .150
3.4.4. Разработка метода контроля иммуногенности вакцины против некробактериоза .158
3.4.5. Испытание иммуногенности вакцины при экспериментальном некробактериозе крупного рогатого скота .172
3.4.6. Разработка унифицированной формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота 176
3.5. Разработка комплексного препарата для парэнтеральной терапии некробактериоза и болезней копытец .189
3.5.1. Антимикробная активность Фузобаксана .195
3.5.2. Токсикологические параметры Фузобаксана
3.5.2.1. Острая токсичность Фузобаксана 198
3.5.2.2. Субхроническая токсичность и кумулятивные свойства ФБС 199
3.5.2.3. Хроническая токсичность Фузобаксана 203
3.5.2.4. Кожно-раздражающее действие Фузобаксана .204
3.5.2.5. Изучение возможных отдаленных последствий при применении ФБС (мутагенное, эмбриотоксическое, тератогенное и иммунотоксическое действия) 205
3.5.3. Определение массовой доли тилозина и подлинности компонентов активно действующего вещества Фузобаксана 212
3.5.4. Определение стабильности и активности действующего вещества Фузобаксана в зависимости от сроков хранения 215
3.5.5. Изучение фармакокинетики Фузобаксана 216
3.5.6. Определение оптимальной терапевтической дозы Фузобаксана при экспериментальном некробактериозе кроликов 219
3.5.7. Определение оптимальной терапевтической дозы Фузобаксана при некробактериозе и болезнях копытец крупного рогатого скота 220
3.5.8. Определение остаточного количества тилозина в органах и тканях при
однократном и курсовом введении Фузобаксана 223
3.5.9. Влияния Фузобаксана на клинический статус, гематологические, биохимические показатели крови и функционально-метаболическую активность лейкоцитов крови 226
3.5.10. Ветеринарно-санитарная экспертиза качества мяса при введении Фузобаксана 229
3.5.11. Испытание терапевтической эффективности ФБС в сравнении с зарубежными и отечественными аналогами 231
3.6. Разработка препарата наружного применения для лечения крупного рогатого скота при некробактериозе и болезнях пальцев 235
3.7. Разработка комплекса специфических и общехозяйственных мероприятий при некробактериозе и болезнях пальцев крупного рогатого скота 239
3.8. Экономическая эффективность мероприятий при некробактериозе и Болезнях пальцев крупного рогатого скота 248
Заключение 256
Предложения производству 268
Список сокращенных терминов 270
Список использованной литературы 272
Список иллюстрированного материала
- Fusobacterium necrophorum в патологии пальцев и копытец 2
- Разработка унифицированной системы оценки болезней пальцев и диагностики некробактериоза
- Разработка унифицированной формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота
- Определение оптимальной терапевтической дозы Фузобаксана при экспериментальном некробактериозе кроликов
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В промышленном скотоводстве, наряду с многочисленными положительными сторонами, имеются серьезные трудности, обусловленные концентрацией большого количества животных на ограниченных площадях. При постоянном безвыгульно-стойловом содержании, механизации основных производственных процессов, силосно-концентратном типе кормления скота значительно повышается возможность появления и быстрого распространения различных заболеваний конечностей, в том числе некробактериоза [4, 5, 9].
Промышленная технология создает большие трудности, связанные с поддержанием здоровья животных, так как высокопродуктивные коровы с интенсивным обменом веществ реагируют даже на незначительные стресс-факторы, которые приводят к снижению естественной иммунологической резистентности организма, а также обуславливает благоприятные условия для распространения условно патогенных и высоковирулентных микроорганизмов [1, 2, 4].
На фоне снижения общей резистентности организма животных возникают различные заболевания, среди которых ведущее место занимают некробактериоз и болезни пальцев и копытец (БПК), первичным признаком которых является хромота [13].
С учетом вышеизложенного, предупреждение возникновения и распространения некробактериоза и незаразных болезней пальцев и копытец крупного рогатого скота является актуальной задачей ветеринарной науки и практики.
Степень разработанности проблемы. Разработкой диагностических и лечебно-профилактических мероприятий при БПК незаразной этиологии и некробактериозе, занимаются во многих скотоводческих странах мира. В нашей стране БПК и некробактериоз регистрируются у разных видов животных, но чаще среди северных оленей и рогатого скота [8, 10]. В странах Европы, Северной Америки, Южной Африки, Австралии болезни пальцев и копытец обычно диагностируют, как Lamenes (англ.) или Klauenlamheit (нем.) [1, 9, 16, 18,] и подразделяют на незаразные и инфекционные. Среди инфекционных заболеваний копытец зарубежные авторы чаще отмечают межпальцевый дерматит и пальцевый дерматит (болезнь Мортелларо), возбудители которых до конца не установлены. Некробактериозу, как отдельной нозологической единице, уделяется довольно мало внимания -чаще его описывают как острый межпальцевый некробациллез (панариций) [18]. Вместе с тем, в нашей стране некробактериоз считают одним из самых распространенных социально значимых инфекционных болезней [11].
В настоящее время в ветеринарной практике Российской Федерации довольно широко используются несколько вакцин против некробактериоза рогатого скота [4, 13]. Также имеются сообщения об использовании таких вакцин за рубежом [9,17]. Однако, общепринятые методы диагностики,
профилактики и лечения крупного рогатого скота при ВПК и некробактериозе не всегда дают желаемые результаты.
Цель и задачи. Исходя из изложенного, целью исследований явилась разработка методов диагностики, профилактики и лечения некробактериоза и ВПК крупного рогатого скота.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Изучить клинические формы проявления болезней пальцев и
копытец незаразной этиологии и особенности эпизоотологии
некробактериоза крупного рогатого скота в сельхозпредприятиях различных
регионов РФ;
2. Разработать унифицированную систему оценки болезней пальцев и
копытец незаразной этиологии и методику диагностики некробактериоза;
-
Выделить и изучить биологические свойства эпизоотических изолятов F. necrophorum, циркулирующих в различных регионах РФ;
-
Отобрать штаммы F. necrophorum, обладающие стабильными антигенными и иммуногенными свойствами, и разработать технологию производства антигена для создания средства специфической профилактики и лабораторной диагностики некробактериоза;
5. Разработать дешевую питательную среду для культивирования F.
necrophorum, технологию изготовления и контроля вакцины против
некробактериоза крупного рогатого скота и эффективные лечебные
препараты для парентерального и наружного применения;
6. Изучить иммунобиологические свойства вакцины против
некробактериоза и антимикробные, токсико-фармакологические свойства
лечебных препаратов в лабораторных и производственных условиях и
разработать нормативную документацию на них;
7. Испытать эффективность опытно-промышленных серий вакцины
против некробактериоза и лечебных препаратов для внедрения в
ветеринарную практику в виде комплекса диагностических и лечебно-
профилактических мероприятий при ВПК и некробактериозе.
Научная новизна исследований. Впервые:
- выявлены клинико-эпизоотологические особенности проявления болезней пальцев и копытец крупного рогатого скота заразной (некробактериоз) и незаразной этиологии в различных регионах РФ и разработаны методы их дифференциальной диагностики. Выделено и идентифицировано 130 изолятов возбудителя некробактериоза и подтверждена ведущая роль F. necrophorum в этиологии некробактериоза крупного рогатого скота;
изучены фенотипические (культурально-морфологические, тинкториальные, гемолитические, антигенные, патогенные), генотипические (по генам: лейкоцидина, белка оболочки, ДНК-гиразы, гемагглютинина, транспазона) и биологические свойства выделенных изолятов, определен спектр патогенности и их токсигенности для лабораторных и естественно восприимчивых животных, отобрано два оригинальных штамма возбудителя
некробактериоза с взаимодополняющими антигенными свойствами для производства вакцины и диагностических препаратов.
- разработаны технологии изготовления протективного антигена, формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота и лечебных препаратов Фузобаксан и Фузосан.
Новизна прикладных разработок подтверждена 5 патентами Российской Федерации на изобретения.
Теоретическая и практическая значимость. В работе дано теоретическое обоснование необходимости дифференциального подхода к болезням пальцев и копытец заразной и незаразной этиологии при их диагностике, профилактике и лечении. На основании результатов проведенных исследований внедрены в ветеринарную практику: формол-эмульсионная вакцина против некробактериоза крупного рогатого скота и антибактериальные препараты Фузобаксан (ФБС) и Фузосан (ФЗС) для лечения БПК, осложненных некробактериозом и микробами ассоциантами; технология промышленного производства и методы контроля их качества, а также новые подходы при комплексной диагностике, профилактике и лечении крупного рогатого скота при этих болезнях.
По результатам проведенных исследований разработаны и утверждены в установленном порядке 7 научно-методических документов, рекомендации, руководство и учебное пособие
Методология и методы исследований. Для выполнения поставленных
задач и достижения цели диссертационной работы применяли
эпизоотологические, клинические, бактериологические, диагностические,
патоморфологические, серологические, молекулярно-генетические и
биологические методы исследований; методы экспериментального заражения восприимчивых животных, выделения и культивирования возбудителя некробактериоза и других микробов-ассоциантов, вызывающих поражения пальцев и копытец крупного рогатого скота; методы обнаружения антигена в РИФ и генома F.necrophorum в ПНР, выявления антител к возбудителю некробактериоза в РА, РНИФ, ИФА, РДП, а также принципы диспансерного обследования поголовья крупного рогатого скота до и после проведения лечебно-профилактических мероприятий. Подробное описание методологии и методов проведения исследований отражены в главе «Материалы и методы».
Положения, выносимые на защиту:
1. Обоснование необходимости дифференциальной диагностики БПК
незаразной этиологии и некробактериоза для правильной организации
лечебно-профилактических мероприятий и оценки эффективности
вакцинопрофилактики некробактериоза;
2. Выделение, идентификация и сравнительное изучение
биологических свойств музейных и свежевыделенных изолятов
F.necrophorum;
-
Технология получения питательной среды из непищевого сырья для культивирования F.necrophorum в биореакторе:
-
Способ изготовления некробактериозного антигена;
-
Разработка и экспериментальное обоснование технологии изготовления формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота;
-
Разработка и экспериментальное обоснование технологии изготовления, контроля и применения лечебных препаратов Фузобаксан и Фузосан;
7. Разработка, изучение эффективности и внедрение комплекса
лечебно-профилактических мероприятий с использованием формол-
эмульсионной вакцины и лечебных препаратов Фузобаксан и Фузосан при
БПК и некробактериозе крупного рогатого скота.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных данных подтверждена статистической обработкой результатов методом вариационной статистики с применением прикладного приложения MS Office-MS Excel.
Основные положения диссертационной работы доложены на ежегодных научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 1990-2014 гг., Международных, Всероссийских и республиканских научно-практических конференциях, съездах, симпозиумах и конгрессах (Казань, 1991-1992; 1994-1999; 2001-2014; Харьков, 1991, 2011; Киров, 1998; Владимир, 2003; Ульяновск, 2003; Щелково, 2004; Краснообск, 2010; Курск, 2010; Краснодар, 2011, Санкт-Петербург, 2013; Москва, 2013; Уфа, 2014).
Публикации. Основные результаты докторской диссертации опубликованы в 129 печатных работах и материалах конференций, в т.ч. 22 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, 2 учебных пособиях, 6 методических рекомендациях; получено 5 Патентов РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 350 страницах и включает: введение, основную часть и заключение, список литературы, состоящий из 482 источника, в том числе 182 иностранных, и приложения. Диссертация содержит 61 таблицу и 28 рисунков.
Fusobacterium necrophorum в патологии пальцев и копытец 2
Некробактериоз и болезни копытец крупного рогатого скота до настоящего времени остаются одними из самых распространенных болезней, причиняющих огромный экономический ущерб скотоводству многих стран мира [77, 240, 461].
Некробактериоз - системное заболевание, проявляющееся гнойно-некротическим воспалением преимущественно кожных покровов разных участков тела (дистальный отдел конечностей, вымя, хвост), слизистых оболочек (ротовая полость, половые органы), внутренних органов (печень, легкие, сердце почки), при септическом процессе – мышечной ткани [135, 198, 401]. Некробактериоз дистального отдела конечностей (пальцев и копытец) наиболее широко распространен, наносит наибольший ущерб скотоводству и лучше изучен. Другие клинические проявления болезни диагностируются значительно реже и поэтому менее актуальны [203].
Наряду с некробактериозом, регистрируются болезни пальцев и копытец, возникающие в связи с травматизмом [162, 167, 282], нарушениями условий содержания [119, 121, 302], кормления [22, 30, 41, 345] и хозяйственного использования [338, 354, 376, 410] животных. Многие из них имеют схожие с некробактериозом клинические признаки и проявляются хромотой [29, 140, 206, 302].
Согласно литературным данным [26, 140, 204, 239] болезни дистальной части конечностей в разных странах мира получили широкое распространение начиная с 70-х годов, с введением промышленных технологий содержания и концентрацией животных. В большинстве случаев эти болезни описывали под обобщающими диагнозами, основанными на характере патологического процесс или на анатомо-топографическом строении дистальной части конечностей [275, 343, 404, 444]. В последние годы во многих регионах России болезни копытец и некробактериоз являются одной из основных проблем в патологии крупного рогатого скота [136, 240, 250, 264].
По данным исследователей заболеваемость животных колеблется от 1,3 до 80%. [75, 154, 166, 217]. По подсчетам специалистов, ежегодно в результате заболеваний копытец отечественные хозяйства теряют в среднем 20-25 тысяч рублей на корову в год.
Вследствие болезней дистальной части конечностей у животных на откорме в два раза уменьшаются привесы, быки-производители быстро выбраковываются из-за снижения спермопродукции [194], у каждой третьей новотельной высокопродуктивной коровы происходит разрушение копытец [310], приводящее к хромоте. У коров с болезнями копытец в два раза снижаются удои, выход телят ниже на 15-20%, в 2-3 раза чаще регистрируются задержания последа и эндометриты, сервис-период и кратность осеменения увеличиваются на 2-3 месяца, коровы плохо приходят в охоту и плохо оплодотворяются, выбраковка от хромоты составляет 50 -60% от общего поголовья бракуемых животных, повышается ротация стада, нарушается план селекционно-племенной работы, теряется генофонд и значительно снижается доходность отрасли [56, 115, 139, 213, 190, 194, 265, 398].
По другим данным у больных коров молочная продуктивность в разных сельхозпредприятиях снижается от 10 до 80%, выход телят - на 16-19%, а прирост живой массы у бычков, находящихся на откорме, - на 8-50%. При этом вынужденный убой больных некробактериозом животных достигал 35-40%. Для движения и комфортного состояния необходимы здоровые конечности, а чувствуя боль, животные меньше едят, в результате снижаются их вес и продуктивность [57, 372, 382]. По данным Минсельхоза России вследствие болезней копытец процент выбраковки скота вырос с 7% в 1990 году, до 15-16% в 2006 году. Болезни конечностей у крупного рогатого скота наносят большой экономический ущерб во всех странах, занимающихся скотоводством [9, 139, 211, 372, 400, 410, 444].
По данным A.M.Russell et.al [9, 444] в Великобритании болезни копытец на 150 фермах зарегистрированы у 7,3% животных. При осмотре 1821 головы скота было установлено в среднем 5,5% (8-11,8%) животных с признаками хромоты, а при обследовании 21 тыс. коров 185 стад обнаружили 25% больных животных. Ежегодный экономический ущерб от заболеваний копытец у крупного рогатого скота в Великобритании составлял, по данным D.Baggott (1982), 25 млн. фунтов стерлингов, а по сообщению S.Arkins et al (1986), - 35 млн. фунтов стерлингов [312, 313]. Около половины дойных коров в Германии страдают заболеваниями копытец, потери от каждой хромающей коровы оцениваются в 120-850 евро. Заболевания копытец обходятся немецким фермерам более чем в 100 млн. евро в год.
Большие потери в разных странах от заболеваний копытец крупного рогатого скота несут фермеры, ущерб от хромой коровы оценивается в 150 долларов и более, причем распространение хромоты достигает от 1,6 - 15% до 75,5%. Болезни конечностей с признаками хромоты наносит большие потери за счет уменьшения молочной продуктивности (удои на одну голову, в зависимости от продолжительности болезни, снижаются на 3,2 - 4,5 литра), снижения массы животного и оплаты корма, преждевременного убоя и затрат на лечение [436, 444].
Появление болезней копытец и некробактериоза многие авторы объясняли антисанитарными условиями содержания [302, 375, 469] и отсутствием минеральной подкормки [345, 376, 461], а также указывали на генетический фактор на основании изучения заболеваемости нетелей в зависимости от линий быка [139].
Среди причин гнойно-воспалительных процессов дистального отдела конечностей у коров в зимне-стойловый период отмечали воздействие грибов и бактерий, которые проявляют токсические и кератолитические свойства [83].
При поражении конечностей устанавливали самую разнообразную микрофлору. Так, у крупного рогатого скота с признаками некробактериоза только в 12 случаях из 34 выделяли бактерии рода Fusobacterium, которым постоянно сопутствовали грамотрицательные аэробы, преимущественно протеи и кишечная палочка [137, 199, 238]. Ученые пришли к заключению, что стафилококк, кишечная палочка, протеи, сенная палочка и другие осложняют течение раневого процесса и некробактериоза.
Некробактериоз и БПК изучены недостаточно, поэтому до настоящего времени нет единого мнения об их патогенезе [289]. Так, одни авторы источником возбудителя некробактериоза считают больных животных, причиной вспышки инфекции - завоз больных животных, представляя патогенез некробактериоза у животных в виде типичной картины раневой инфекции [251, 262], другие полагают что некробактериоз – это аутоинфекция, поскольку возбудитель болезни постоянно обитает в рубце жвачных [62, 64, 238] и относится к «факторным» болезням, при которых движущей причиной выступают факторы риска (предрасполагающие факторы).
Разработка унифицированной системы оценки болезней пальцев и диагностики некробактериоза
Патогенность и токсигенность штаммов определяли на белых мышах и кроликах. Дозу заражения титровали методом серийных разведений от 1:2 до 1:128 по разработанной нами методике.
Бактериальную ДНК выделяли фенольно-детергентным и сорбционным методами. Для отбора и генетического маркирования вакцинных штаммов, используемых в ФЭВ против некробактериоза, применяли тест-систему для ПЦР-анализа, где в качестве специфических компонентов использовали две пары олигонуклеотидных праймеров, комплементарные ДНК в области, характерной для вирулентных штаммов F.necrophorum и праймеры, полученные к микрофлоре, участвующей в патологии пальцев и копытец (стафилококки, стрептококки, микрококки, кишечная палочка). С помощью наружных праймеров №11 и №22 в ПЦР синтезировали большие фрагменты. Вторую пару праймеров №011 и №022 применяли для синтеза меньшего фрагмента, структурно входящего в большой. Анализы считали положительными, если размер первого и второго ампликонов соответствовал ожидаемым размерам, соответственно 558 и 289 н.п. Для определения подвида провели генотипирование с помощью полимеразной цепной реакции по синтезу фрагментов ДНК различных генов штамма. В качестве праймеров использовали первые и последние 18-20 нуклеотидов выше приведенных нуклеотидных последовательностей. Затем осуществили секвенирование синтезированных фрагментов ДНК соответствующих фрагментов генов: белка оболочки, гемагглютинина, ДНК-гиразы и транспозазы. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов проводили по двум цепочкам ДНК, используя общепринятую методику Максама-Гилберта.
Подбор праймеров и расчет вероятных схем их спаривания осуществляли по методу определения оптимальных вторичных структур нуклеиновых кислот с использованием соответствующих энергетических правил по программе «Oligos». Амплификацию при двупраймерной ПЦР осуществляли в следующем режиме: денатурация ДНК 5 мин при 94оС, 35- кратное повторение последовательности следующих стадий – денатурации (94оС, 0,5 мин), отжига (55оС, 0,5 мин) и элонгации (72оС, 0,5 мин) и заключительного досинтеза в течение 3 минут.
Амплификацию при постановке RAPD-fingerprinting осуществляли в следующем режиме: денатурации ДНК 5 мин при 94оС, 45-кратное повторение последовательности следующих стадий – денатурации (94оС 1,0 мин), отжига (40оС, 2,0 мин) и элонгации (72оС, 0,5 мин) и заключительного досинтеза в течение 3 минут.
Фрагменты ПЦР анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном и 6% полиакриламидном гелях в присутствии ДНК фага, расщепленной по EcoRI-HindIII сайтам рестрикции, и 100 bp ДНК маркера.
Определение размеров фрагментов ДНК проводили с использованием пакета прикладных программ «Gel-Pro 3.1», а степени филогенетического родства и построения диаграмм – «PHYLIP».
Для электронно-микроскопических исследований использовали методы негативного контрастирования, сканирования и ультратонких срезов.
Метод негативного контрастирования (НК). Каплю исследуемой баксуспензии наносили на медные сетки, покрытые формваровой пленкой, контрастировали 2% водным раствором уранилацетата 1 мин при комнатной температуре, промывали дистиллированной водой, просушивали и просматривали на электронном микроскопе JEM 100СХ-2 («Jeol» Japan).
Метод ультратонких срезов. При подготовке материала культуру инактивировали. Осадок культуры, полученный центрифугированием при 8000 об/мин в течение 15 мин трижды промывали физиологическим раствором среды и заключали в агар-агар. Кусочки заключенной в агар-агар культуры фиксировали 1% раствором глутарового альдегида (SERVA, Германия) на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 в течение 12 ч в холодильнике с последующей фиксацией в 2% растворе четырехокиси осмия (Московский химзавод) на том же буфере в течение 2 ч при комнатной температуре. После дегидратации образцы заключали в смесь эпоновых (Epon-812, MNA, DDSA) смол (SERVA, Германия). Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB–3 и изучали в электронном микроскопе JEM 100CX-2 («Jeol» Japan). Съемку проводили на фототехническую пленку AGFA ORTHOCHROMATIC. Для получения микрофотографий негативы сканировали на сканере EPSON PERFECTION 4990 PHOTO с разрешением 600 dpi.
Для получения некробактериозного антигена использовали периодический метод культивирования в 2-х и 5-ти литровых колбах, 20 литровых бутылях в условиях термостата и глубинно-суспензионным способом культивирования в 12-, 36- и 90 литровых биореакторах, оснащенных автоматизированной системой подачи питательной среды с регулятором температуры, скорости перемешивания и рН среды. Концентрацию исходной баксуспензии определяли с помощью ФЭК-56М, по оптическому стандарту мутности ГНИИСК им. Л.А.Тарасевича и путем прямого подсчета в камере Горяева.
При определении параметров роста культур учитывали удельную скорость роста, время удвоения биомассы микробных клеток и максимальное накопление бактерий в питательной среде, которые определяли по формулам: =ln(N/Nо)/t, где - удельную скорость роста; Nо -число клеток в нулевой точке отсчета времени, N - число клеток во времени t; t-время экспоненциального роста. td=0,693/ , где td- время необходимое для удвоения числа микробных клеток; 0,693-значение натурального логарифма числа 2; - удельную скорость роста микробной популяции.
Для изготовления вакцины использовали эндо- и экзотоксины, полученные из разрушенных микробных клеток и культуральной жидкости. С целью получения высокоиммуногенного препарата подбирали разные режимы культивирования, методы инактивации, разрушения, концентрирования, очистки, сбора и стандартизации антигенных фракций, полученных из биомассы бактерий F.necrophorum. Экзотоксин получали из культуральной жидкости после отделения бакмассы. Для получения эндотоксина инактивированную бакмассу суточной культуры F.necrophorum ресуспензировали в дистиллированной воде и разрушали 3-4-х кратным замораживанием (-50оС) и оттаиванием (при +50оС), или в ультразвуковой установке в течение 15 мин при 23кГц.
Стандартизацию антигена по белку осуществляли на спектрофотометре «СФ-46» при pH=7,0 и температуре 200С. Масляный адъювант готовили из синтетического масла ПЭС-3, (кремнийорганическая жидкость ГОСТ 13004-77), которую смешивали в соотношении 85:15 с подогретым в водяной бане ланолином, автоклавировали при 120оС в течение 1 ч, охлаждали и использовали для приготовления вакцины и лечебного препарата Фузобаксан. Полиштаммовую формол-эмульсионную вакцину (ПШВ) и формол-эмульсионную вакцину (ФЭВ) против некробактериоза рогатого скота изготавливали согласно инструкции, утвержденной директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», путем их эмульгирования в масляном адъюванте с помощью высокоскоростного перемешивающего устройства (25л). Контроль серий вакцины на стерильность, безвредность и иммуногенность осуществляли согласно ТУ 10-07-253-91.
Разработка унифицированной формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота
Несколько иной характер развития эпизоотического процесса отмечали в сельхозпредприятии, где некробактериоз стали регистрировать после завоза племенных телок из другого региона России. В начале заболели завезенные телки, от которых был выделен патогенный штамм возбудителя некробактериоза, а затем инфекция распространилась на благополучный ранее местный скот. Некробактериоз и БПК быстро распространялись в результате скученного содержания животных в помещениях с укороченными стойлами, пастьбы на засоренных участках (травматизм), плохих полов и неисправностей транспортеров для уборки навоза. В течение трех лет в этом хозяйстве проводили мероприятия по устранению указанных недостатков с использованием активной профилактики некробактериоза формол эмульсионной вакциной из местного штамма и лечебных препаратов Фузобаксан и Фузосан, что сократило количество животных с БПК до единичных случаев. Следует отметить, что при проведении ортопедической диспансеризации животных в обследованных сельхозпредприятиях мы диагностировали разные клинические проявления БПК - абсцессы, флегмоны, язвы, ламиниты, деформированный, гипертрофированный копытцевый рог, гнойные раны венчика, межпальцевой цели и мякишей, болезнь белой линии, пальцевый дерматит, межпальцевый дерматит, язва Рустерхольца, пододерматиты, оститы копытцевой кости, артриты копытцевого сустава, тендиниты глубокого сгибателя пальца, однако они не имели такого массового проявления как при некробактериозе.
Таким образом, крупный рогатый скот постоянно находится под угрозой возникновения БПК. Возбудитель некробактериоза циркулирует среди животных, вызывая латентное носительство. Обострение течения инфекции происходит по мере снижения местной и общей резистентности организма из-за плохих условий содержания, кормления и хозяйственного использования скота. Высокая концентрация животных на ограниченных площадях, занавоженность, отсутствие сухой подстилки и моциона, содержание на бетонных полах, укороченные стойла, сырость в помещениях, недостаток грубых кормов, чрезмерная эксплуатация животных способствуют возникновению БПК незаразной этиологии и распространению некробактериоза. Весьма рискованными являются также какие-либо бесконтрольные перемещения высокопродуктивных коров, так как, даже после выздоровления у животных, переболевших некробактериозом, не наступает полное освобождение организма от возбудителя, который остается носителем инфекции и при соответствующих условиях возникает рецидив заболевания.
Возбудитель некробактериоза является нормальным обитателем желудочно-кишечного тракта, поэтому не исключена возможность спонтанного возникновения некробактериоза в ранее благополучных хозяйствах ввиду большой скученности, плохих условий содержания, постоянного травматизма и нарушения обменных процессов в пальцах и копытцах из-за неправильного кормления животных. Кроме того, установлено, что возбудитель некробактериоза может годами сохраняться в структурах пальцев и копытцевого рога, вызывая рецидивы болезни.
В обследованных нами сельхозпредприятиях БПК отмечали у всех половозрастных групп скота, но наиболее тяжело болели первотелки, высокоудойные коровы, особенно коровы после отела, быки-производители, и быки во второй половине откорма. Очевидно, что это связано с особенностями физиологии этих групп скота, способствующей возникновению структурных нарушений пальцев и копытцевого рога, что делает животных более восприимчивыми к возбудителю некробактериоза. По нашим наблюдениям, молодые животные (бычки и телочки) до 6-месячного возраста мало восприимчивы к некробактериозу, проявляющимся БПК, что во многом определяется интенсивным ростом мягких тканей пальцев и рога копытец, хорошим крово-лимфотоком и снабжением тканей кислородом.
В этой связи следует отметить выраженный тропизм возбудителя некробактериоза. Разные виды животных и породы крупного рогатого скота в разной мере восприимчивы к возбудителю некробактериоза. Так, изоляты возбудителя некробактериоза, выделенный от овцы, оказались практически не патогенным для крупного рогатого скота, а бестужевская, сементальская и швитская породы были менее восприимчивыми к некробактериозу, чем голштинский и черно-пестрый скот.
Заболеваемость крупного рогатого скота БПК и некробактериозом в обследованных нами сельхозпредприятиях колебалась в широких пределах. Наибольшей она была при безвыгульно-беспривязном круглогодичном содержании скота на крупных промышленных комплексах. БПК и некробактериоз встречались значительно реже там, где применяли летне-лагерное содержание коров, тогда заболеваемость резко снижалась.
Таким образом, клиническое проявление БПК и некробактериоза у крупного рогатого скота зависело от условий содержания, кормления, эксплуатации, факторов внешней среды и наличия патогенного штамма возбудителя некробактериоза.
Чаще всего некробактериоз имел хроническое течение с обострениями в период снижения общей резистентности организма животных. Отличительной особенностью некробактериоза от других БПК было то, что поражения локализовались, в основном, в области свода межкопытцевой щели, мякиша, рудиментальных пальцев, с покраснением и отеком кожи окружающих тканей. При этом на месте поражения отмечали наличие эрозий и язв с неровными краями в виде валика, покрытых экссудатом, а также абсцессов в области венчика, а при наличии свищей - некроз связок и сухожилий. При этом отмечали повышение местной температуры, болезненность дистальной части конечностей и сильную хромоту. Животные были угнетены, опирались на зацеп больной конечности или держали её на весу. При более глубоких поражениях мягких тканей пальцев с наличием свищей и затоков под копытным рогом у животных повышалась температура тела до 400С и выше, терялся аппетит, резко снижались удои. В запущенных случаях развивалась генерализованная форма некробактериоза с поражением связок, костей и наличием абсцессов в области суставов, а также некротических поражений и абсцессов во внутренних органах. Такие животные не подлежали лечению и выбраковывались. В частности в совхозе «Чернышевский», ООО «Дусым», колхозе «Байрак», СПК им Ленина Республики Татарстан регистрировали некротические поражения на вымени и коже нижней части тела, воспаления запястного и заплюсневого суставов, гнойный тендовагинит и бурсит. В ООО «Масловский» первичные поражения локализовались преимущественно в области копытцевой кости с последующим распространением на кожу и подкожную клетчатку межкопытцевой щели, а также в область венчика и сгибательной поверхности пута с небольшим отеком и экссудатом с неприятным запахом. В ООО «Ак БарсАгро» в начальной стадии болезни чаще наблюдали эрозии кожи с ворсистой поверхностью в области мякиша межкопытцевой щели, а также гиперплазию тканей в виде валика, копытный рог был разросшимся, изъязвленным, рыхлым. Такую клинику диагностировали как болезнь Мортелларо, при этом мы обнаруживали F.necrophorum в мазках отпечатках с пораженной конечности.
Определение оптимальной терапевтической дозы Фузобаксана при экспериментальном некробактериозе кроликов
Проведенные исследования показали, что все производственные серии вакцины в течение 12 мес сохраняются без существенного снижения стандартной активности.
Контроль формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза осуществлял государственный контролер ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», отбирая по 3 флакона вакцины из каждой серии для определения внешнего вида, стерильности, безвредности, иммуногенности и хранения в течение 1,5 срока годности в архиве.
Внешний вид, цвет, вязкость, наличие посторонних примесей, плесени, расслоение минерального масла определяли просмотром флаконов с вакциной. Для установления герметичности укупорки, флаконы взбалтывали, переворачивая вниз пробками, а также проводили контроль соответствия маркировки препарата.
При этом во флаконе содержалась масляная эмульсия светло-серого цвета. Допускалось небольшое расслоение минерального масла до 10%, которое при взбалтывании гомогенизировалось до стойкой однородной эмульсии.
Стерильность препарата контролировали по ГОСТ 28085-89, используя мясопептонный бульон, мясопептонный агар, среды Китт-Тароцци и Сабуро, приготовленные по стандартным прописям.
На стерильность из каждого флакона высевали по 0,2-0,3 см3 в пробирки с МПА, по 1-2 см3 во флаконы с МПБ, Китт-Тароцци и в чашки Петри с агаром Сабуро. Каждый образец высевали в две: пробирки, флакона, чашки с агаром Сабуро. Через трое суток культивирования в жидких питательных средах из флаконов проводили пересев на аналогичные среды. Посевы выдерживали в течение 10 дней при температуре 37оС, среду Сабуро при Т 20 –24оС.
Безвредность каждой серии вакцины против некробактериоза проверяли на 10 белых мышах массой тела 18 –20 г. Для испытания готовили общую пробу вакцины, которую тщательно встряхивали, стерильной пипеткой отбирали по 20 см3 и переносили в стерильный флакон. Общую пробу вводили подкожно в область спины белым мышам в объеме 0,5 см3. при этом гибели белых мышей в течение 10 дней (срок наблюдения) не отмечали.
Для определения иммуногенной активности использовали общую пробу, приготовленную из трех флаконов одной серии вакцины.
Перед вакцинацией из краевой вены уха кроликов брали «0-пробы» крови. Трем кроликам смесь вакцины вводили внутримышечно в области бедра по 1,0 см3.
Через 20–25 дней после прививки у кроликов брали кровь и исследовали в РА с антигеном, изготовленным из контрольного штамма – «12TSК 630501».
У вакцинированных кроликов титр антинекробактериозных антител в РА составлял 1:80 и выше. При таких результатах испытания серию вакцины считали соответствующей требованиям иммуногенности.
Полевые испытания вакцины формол-эмульсионой вакцины начали в январе 2008 года. Первые опыты вакцинации проведены в 12 стационарно неблагополучных по некробактериозу хозяйствах Самарской области и Татарстана. Испытания начали с малых групп откормочного скота, охватывая затем в последующих турах вакцинации все большее число животных. Молодняк, нетелей и коров прививали с учетом точных сроков стельности. Работу завершали поголовной вакцинацией скота с 6-ти месячного возраста и старше. Последующее клинико-эпизоотологическое наблюдение за вакцинированными животными вели в течение 6-8 месяцев. У всех видов животных через 7 суток после вакцинации выявлялся продуктивный тип морфологической и гистохимической активизации клеток РЭС во всех лимфоидных тканях и сосудах паренхиматозных органов, способствующий мобилизации защитных сил организма этих видов животных к формированию иммунитета против некробактериоза. Явлений дистрофии клеток не выявлено ни в первые, ни в последующие сроки исследований, проведенных после однократной иммунизации скота формол-эмульсионной вакциной (ФЭВ) против некробактериоза. Эти данные были подтверждены нашими совместными исследованиями с сотрудниками кафедры хирургии Казанской государственной академии ветеринарной медицины (КГАВМ) на группах клинически здоровых коров в учхозе академии. После иммунизации скота ФЭВ изучали динамику развития неспецифической защиты у животных. При этом отмечали повышение опсоно-фагоцитарного индекса и бактерицидной активности сыворотки крови, содержания Т- и В-лимфоцитов через 7 сут после вакцинации, которые к 30-м суткам снижались до фоновых показателей, обеспечив старт развитию специфического иммунитета. Все привитые животные были защищены от некробактериоза более 6 мес после однократной вакцинации (срок наблюдения). Однократная вынужденно-профилактическая вакцинация крупного рогатого скота ФЭВ в дозе 2 мл создавала напряженный иммунитет [295].