Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Систематическое положение, культурально-морфологические, биохимические и патогенные свойства возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза
1.2. Антигенные ствойства возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза
1.3. Циркуляция возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза у животных и клиническое проявление вызываемых ими инфекций
1.4. Заболеваемость людей кишечным иерсиниозом и псевдотуберкулёзом, а также роль животных и продуктов питания как источников заражения людей данными инфекциями
1.5. Лабораторная диагностика кишечного псевдотуберкулёза
2. Собственные исследования
2.1. Материалы
2.2. Методы исследований
2.3. Результаты исследований и их обсуждение патогенных
2.3.1. Бактериологическое исследование поросят
2.3.2. Исследования биохимических, антигенных и свойств штаммов иерсиний, использумых в работе
2.3.3. Получение диметилсульфоксид-антигена Y. enterocolitica и изучение его химической и антигенной природы
2.3.4. Получение гипериммунной сыворотки к диметилсульфоксид антигену Y. enterocolitica 65
2.3.5. Оценка специфичности гипериммунной сыворотки крови кроликов, полученной к диметилсульфоксид-антигену Y. enterocolitica 67
Сравнительный анализ антительной активности экспериментальной и коммерческих адсорбированных диагностических кишечноиерсиниозных сывороток в непрямом
твердофазном иммуноферментном анализе на планшетах
2.3.7. Использование экспериментальной адсорбированной
диагностической кишечноиерсиниозной сыворотки в непрямом дот-иммуноанализе с конъюгатом золотых наночастиц
2.3.8. Выявление возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза в искусственно контаминированных иерсиниями фекалиях свиней при помощи созданных тест-систем
3. Заключение
Практические предложения
Список сокращений и условных обозначений
Список литературы
- Циркуляция возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза у животных и клиническое проявление вызываемых ими инфекций
- Заболеваемость людей кишечным иерсиниозом и псевдотуберкулёзом, а также роль животных и продуктов питания как источников заражения людей данными инфекциями
- Результаты исследований и их обсуждение патогенных
- Сравнительный анализ антительной активности экспериментальной и коммерческих адсорбированных диагностических кишечноиерсиниозных сывороток в непрямом
Введение к работе
Актуальность темы. Возбудители кишечного иерсиниоза и
псевдотуберкулёза поражают людей и животных. За рубежом кишечный иерсиниоз по заболеваемости людей занимает третье место после сальмонеллёза и кампилобактериоза. Псевдотуберкулёз имеет большое значение в патологии человека в связи с крупными вспышками в Сибирском регионе, Дальнем Востоке и Северо-Западе России [3,6,9,10, 12]. При кишечном иерсиниозе особую опасность представляют заражённые микробом продукты питания животного происхождения - мясо и молоко, а при псевдотуберкулёзе -овощи, обсеменению которых на полях могут способствовать животные [3, 4, 6]. Серопозитивными по кишечному иерсиниозу являются до 66,8% молочных коров, 49% свиней, 31,8% овец [3]. В Российской Федерации кишечный иерсиниоз и псевдотуберкулёз с 1996 года включены в перечень официально регистрируемых у животных инфекций [11].
Для бактериологического метода, используемого при диагностике
кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза, характерны трудоёмкость,
длительные сроки выделения возбудителей, низкая эффективность,
составляющая до 70%, большое количество ложных выделений иерсиниозных культур, что связано со значительной обсеменённостью патологического материала кишечной микрофлорой и несовершенством методов выделения [10, 14]. Экспрессные методы диагностики в сочетании с бактериологическим методом позволяют значительно повысить выявляемость иерсиний в инфицированном материале. В настоящее время для обнаружения возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза используются такие экспрессные методы диагностики, как твёрдофазный иммуноферментный анализ (ТИФА), полимеразная цепная реакция (ПЦР), реакция коагглютинации (РКА), реакция латексной агглютинации (РЛА), метод флуоресцирующих антител (МФА) [7,8, 9]. Однако существующие диагностические препараты позволяют обнаруживать только отдельные сероварианты или виды Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, а генетические методы требуют использования дорогостоящего оборудования. Поэтому разработка экспрессных методов для одновременного выявления возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза является актуальной задачей. Наиболее перспективными в этом плане являются ТИФА на планшетах и дот-иммуноанализ (ДИА) с конъюгатом золотых наночастиц (ЗНЧ) [2].
Высокая антигенная активность мембранных структур грамотри-цательных бактерий определяет перспективы их использования в производстве диагностических препаратов [5].
Наиболее востребованными являются низко затратные способы выделения и очистки антигенов при создании диагностических препаратов. Одним из широко используемых в медицине и дешёвых растворителей является диметилсульфоксид (ДМСО). Его использование перспективно для получения антигенных фракций бактерий [1,13].
Степень разработанности проблемы. В настоящее время в РФ нет коммерческих диагностических препаратов, позволяющих одновременно проводить индикацию Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica.
Диметилсульфоксид является недорогим полярным апротонным
растворителем с формулой (СН3)2SO. Широко используется в медицине, в качестве противовоспалительного и обезболивающего средства, облегчающего трансдермальный перенос лекарственных средств. Применение ДМСО для получения антигенных и антительных препаратов микробного происхождения до последнего времени проводилось только на M. tuberculosis и показало перспективность дальнейших исследований в данной области.
ТИФА на планшетах является одним из наиболее широко используемых методов иммунологической диагностики иерсиниозов в России и за рубежом. Он обладает высокой воспроизводимостью результатов, чувствительностью, специфичностью и скоростью проведения анализа, позволяет экономно расходовать реагенты, не требует наличия дорогостоящего оборудования и даёт возможность учёта результатов с помощью приборов.
ДИА с применением в качестве индикатора ЗНЧ используется для диагностики небольшого числа бактериальных инфекций, таких как бруцеллёз, мелиедоз, сифилис, туберкулёз, шигеллёз. Дот-иммунотест-система с коллоидным серебром опробована для выявления Y. pestis. ДИА хорошо подходит для применения в малооснащённых лабораториях, так как не требует использования регистрирующего и промывающего оборудования, полистироловых планшет и многоканальных дозаторов.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы является создание тест-систем для диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза животных на основе антител, полученных к ДМСО-фракции иерсиний.
Для достижения вышеуказанной цели были поставлены следующие задачи:
-
Получить ДМСО-фракцию кишечноиерсиниозного микроба и изучить её химическую и антигенную структуры.
-
Получить гипериммунную сыворотку к ДМСО-антигену кишечно-иерсиниозного микроба.
-
Создать на основе полученной сыворотки иммуноферментную планшетную тест-систему для диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза животных.
-
Создать на основе полученной сыворотки дот-иммунотест-систему с использованием ЗНЧ для диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза животных.
-
Установить возможность использования предложенных тест-систем для индикации возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза в средах накопления с фекалиями животных, контаминированных иерсиниями.
Научная новизна работы. Впервые установлена возможность
использования ДМСО для получения антигенно активных фракций иерсиний.
Изучены химический и антигенный составы ДМСО-фракции кишечно-иерсиниозного микроба.
Получена гипериммунная сыворотка к ДМСО-антигену кишечно-иерсиниозного микроба и изучена её специфичность.
На основе экспериментальной сыворотки созданы и испытаны тест-системы для индикации возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза в средах накопления при исследовании фекалий животных.
Впервые установлена возможность использования ЗНЧ при диагностике кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза.
Теоретическая и практическая значимость работы. Предложенные
диагностические тест-системы значительно повышают эффективность
бактериологического анализа при кишечном иерсиниозе и псевдотуберкулёзе. Разработанные методы получения, а также результаты изучения ДМСО-фракции иерсиний и антител к ней, обеспечивают более широкое использование аналогичных препаратов при создании диагностических тест-систем для индикации грамотрицательных бактерий. Результаты испытания ДИА с ЗНЦ при индикации иерсиний дают возможность в дальнейшем использовать данный метод при диагностике иерсиниозов.
По материалам диссертационной работы разработаны и утверждены
ректором ФГБОУ ВПО "Саратовский ГАУ" "Методические указания
по получению гипериммунной адсорбированной сыворотки крови кроликов
к ДМСО-антигену кишечноиерсиниозного микроба", "Инструкция по примене
нию иммуноферментной тест-системы для ускоренного выявления
возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза животных в средах
накопления", "Инструкция по применению дот-иммунотест-системы для уско
ренного выявления возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза
животных в средах накопления", которые используются аспирантами,
магистрантами и студентами ФГБОУ ВО «Саратовский ГАУ» для лабора
торной диагностики инфекционных заболеваний и создания диагностических
препаратов.
Методология и методы исследования. Методологической базой исследований послужили труды отечественных и зарубежных ученых, посвящённые вопросам получения антигенных и антительных препаратов, создания диагностических тест-систем и диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза животных и людей. В основу данного исследования положены комплексный анализ и системный подход к изучению предметной области. При проведении исследования и изложения материала автор опирался на общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа. Применение указанных методов, а также анализ фактического материала позволили обеспечить достоверность полученных выводов и результатов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. ДМСО-фракция кишечноиерсиниозного микроба имеет преимущественно белковую природу, обладает антигенными свойствами и позволяет в результате иммунизации кроликов получать антитела.
-
Гипериммунная сыворотка крови, полученная путем иммунизацией кроликов ДМСО-антигеном, имеет применение для индикации возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза в ТИФА на планшетах и ДИА с ЗНЧ.
-
Созданная на основе сыворотки крови к ДМСО-антигену иммуно-ферментная планшетная тест-система обеспечивает индикацию возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза в средах накопления с фекалиями животных, контаминированных иерсиниями.
4. Созданная на основе сыворотки крови к ДМСО-антигену дот-иммуно-тест-система с использованием ЗНЧ даёт возможность осуществлять индикацию возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза в средах накопления с фекалиями животных, контаминированных иерсиниями.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
доложены и обсуждены: на конференции профессорско-преподавательского
состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской, учебно-
методической и воспитательной работы за 2013 год (Саратов, 2014),
на международной научно-практической конференция "Биотехнология:
реальность и перспективы" (Саратов, 2014), на конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской, учебно-методической и воспитательной работы за 2014 год (Саратов, 2015).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 120
страницах и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных
исследований, заключения, практических предложений, списка сокращений и
условных обозначений, списка использованной литературы, списка
иллюстрированного материала, приложений. Работа иллюстрирована
2 рисунками и 17 таблицами. Список литературы включает 146 источников, из которых 72- иностранных.
Циркуляция возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза у животных и клиническое проявление вызываемых ими инфекций
Род Yersinia относится к семейству Enterobacteriaceae и содержит по данным определителя бактерий Берджи от 1997 года 11 видов бактерий: Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. rohdei, Y. ruckeri. Однако за последние 10 лет при помощи молекулярно генетических методов удалось идентифицировать ещё 6 видов иерсиний: Y. aleksiciae, Y. entomophaga, Y. massiliensis, Y. nurmii, Y. pekkanenii, Y. similis [131, 92, 111, 116, 117, 132]. Безусловное значение в патологии животных и человека из приведённых выше имеют только 3 вида бактерий: Y. pestis - возбудитель чумы человека и верблюдов, Y. enterocolitica - возбудитель кишечного иерсиниоза, Y. pseudotuberculosis - возбудитель псевдотуберкулёза. Роль остальных иерсиний в патологии животных и человека не значительная [15, 40, 33, 52, 64]. Имеются отдельные сообщения о выделения от теплокровных организмов Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii [34, 115] и даже случаи наличия у Y. intermedia плазмиды вирулентности, характерной для патогенных иерсиний [25].
Культурально-морфологические свойства возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis – мелкие, короткие грамотрицательные палочки. В мазках располагаются поодиночке. Y. pseudotuberculosis в мазках из жидких культур образует цепочки. Могут окрашиваться анилиновыми красителями биполярно, споры не образуют. Наличие капсулы у Y. pseudotuberculosis является спорным вопросом, у Y. enterocolitica данная структура отсутствует. Подвижностью обладают при температуре культивирования ниже 28 оС. Отдельные штаммы Y. enterocolitica подвижны в широком диапазоне температур. Перитрихи (у Y. enterocolitica жгутиков много, Y. pseudotuberculosis - 3-5 штук). По типу питания Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis являются хемоорганотрофами, по дыханию - факультативными анаэробами.
Оптимальными для роста иерсиний являются pH среды 7,2–7,4 и температура 22–28 оС (психрофилы), но они могут расти при рН от 5,2 до 10,0 и температуре от 2 оС до 40 оС. Иерсинии не требовательны к питательным веществам (олиготрофы), поэтому хорошо растут на обычных питательных средах: мясопептонном агаре, мясопептонном бульоне, и на бедных средах: ЗПВ (забуференная пептонная вода), ФСБ (фосфатно-солевой буферный раствор).
На мясопептонном агаре при температуре 22–26 оС на вторые сутки оба возбудителя образуют мелкие, выпуклые, полупрозрачные, бесцветные колонии в S-форме, мягкой консистенции. Колонии Y. enterocolitica обычно крупнее, чем у Y. pseudotuberculosis. Культивирование возбудителей при температуре выше 28 оС способствует переходу колоний в шероховатые формы (R-формы). Чаще колонии в R-форме можно встретить у Y. pseudotuberculosis. Они имеют вид "яичницы-глазуньи". На мясопептонном бульоне Y. enterocolitica через сутки при 22–26 оС образуют средней интенсивности помутнение и пылевидный осадок. У Y. pseudotuberculosis слабо мутному бульону соответствует незначительный пылевидный осадок, иногда - нежная плёнка, а прозрачному бульону - осадок в виде хлопьев.
Для выделения возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза из загрязнённого посторонней микрофлорой материала используют комбинированные плотные питательные среды, сочетающие в себе признаки селективных и дифференциально-диагностических сред: Эндо, Левина, Серова, Мак-Конки, СБТС (среда с бромтимоловым синим), ИПС (иерсиниозно-псевдотуберкулезная среда), CIN (цефсулодин, иргазан, новобиоциновый агар), SSDC (сальмонелла/шигелла агар с дезоксихолатом натрия и хлоридом кальция), И-агар.
На агаре Эндо на вторые сутки Y. enterocolitica образуют среднего размера выпуклые, непрозрачные колонии в S-форме, имеющие розовый центр и бесцветную периферию. Y. pseudotuberculosis в аналогичных условиях на данной среде образует более мелкие и бесцветные колонии. Среда вокруг колоний остаётся розовой. Бактерии, разлагающие лактозу на данной среде образуют красные колонии на фоне покрасневшей срелы.
На висмут-сульфит агаре и среде Плоскирева возбудители кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза растут плохо [10, 15, 37, 38, 39, 9, 70, 34, 50, 52, 53, 64, 69, 71, 72]. Биохимические свойства возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза Всех представителей рода Yersinia можно различить между собой, а также от представителей других семейств по биохимическим признакам. При этом необходимо учитывать, что результаты биохимических тестов зависят от окружающей температуры культивирования бактерий. Наиболее ярко выражены биохимические тесты у представителей рода при температуре 25-28 оС. Возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза различают по отношению к мелибиозе, рамнозе, сахарозе, целлобиозе, сорбитолу, продукции орнитиндекарбоксилазы и по реакции Фогес-Проскауэра (Таблица 1) [43, 64, 73].
Заболеваемость людей кишечным иерсиниозом и псевдотуберкулёзом, а также роль животных и продуктов питания как источников заражения людей данными инфекциями
С целью обнаружения Y. enterocolitwa были проведены бактериологические исследования проб фекалий от 80 поросят 2-4 месячного возраста, содержащихся в свиноводческом хозяйстве Саратовской области.
Взятие материала для исследования проводилось из прямой кишки поросёнка с помощью стерильного ватного тампона, который затем помещали в пробирку с ФСБ или 1% ЗПВ. Пробу хранили при +4 C в течение 15 дней.
Высевы с транспортно-накопительных сред осуществляли на 5, 10 и 15-е сутки бактериологической петлей штрихом на секторы чашки Петри со средой Эндо. Перед посевом пробы подвергались "щелочной обработке". Для этого в лунки полистироловых планшетов для иммунологических реакций, предварительно обработанных 96%-м этиловым спиртом и высушенных на воздухе, помещали по 0,2 мл 0,5%-го щелочного раствора. Затем из верхней трети слоя среды накопления отбирали 0,2 мл материала и вносили на 3-4 минуты в лунки со щелочным раствором. Засеянные чашки Петри со средой Эндо инкубировали при 26 С в течение 48-72 часов.
Подозрительные колонии отбирали петлей на питательный бульон и помещали в термостат на 48 часов при 26 C. Затем осуществляли высев колоний на скошенный мясопептонный агар, который инкубировали в термостате при 26 C 24 часа. Идентификацию бактериальных культур проводили световой микроскопией с окраской по методу Грама, использованием диагностических пластин Микро-ЛА-Тест ЭНТЕРОтест 24 N и ОРА с сыворотками диагностическими к Y. enterocolitica О:3, О:9 серотипов.
Методы определения морфологических, культуральных, биохимических и патогенных свойств иерсиний и их подвижности Морфологию иерсиний определяли микроскопией фиксированных и окрашенных по методу Грама бактериальных мазков. Маслянная иммерсионная система микроскопа позволяла получать увеличение микробных клеток в 1600 раз. Культуральные признаки иерсиний определяли по внешнему виду микробных колоний на плотных питательных средах. Биохимические свойства иерсиний определяли на диагностических пластинах Микро-ЛА-Тест ЭНТЕРОтест 24 N и в тестах на обнаружение индола и оксидазы фирмы "Erba Lachema", а также полужидкой среде Гисса с глюкозой. Постановка и оценка биохимических тестов фирмы "Erba Lachema"осуществлялась в соответствии с прилагаемой к ним инструкцией. Посев иерсиний на полужидкую среду Гисса с глюкозой проводился методом укола. Инкубирование засеянной среды длилось 48 часов при 26 С. Изменение цвета питательной среды свидетельствовало об образовании кислоты в результате ферментативного сбраживания сахара.
Подвижность бактерий определяли на полужидком агаре после посева уколом в течение 10 дней при 26 C и 37 C. Посев проводили с суточной агаровой культуры, выращенной при 26 С.
Патогенность иерсиний, связанную с плазмидой вирулентности, выявляли в тестах аутоагглютинации и в ОРА со СВИ.
Для определения способности к аутоагглютинации суточную агаровую культуру иерсиний, выращенную при 26 C, засевали в две пробирки со средой Кларка. Одну из пробирок инкубировали в наклонном положении при 37 С, а другую - при 26 C в течение 48 часов. Патогенные иерсинии агглютинировали при 37 C в виде хлопьев, оседающих на дно и стенки пробирки. ОРА с СВИ осуществляли в соответствии с прилагаемой к препарату инструкцией. Метод получения ДМСО-антигена Y. enterocolitica Для получения бактериальной массы проводили выращивание Y. enterocolitica на питательном агаре в бактериологических матрасах при 26 С в течение 2-3-х суток. Отмывали, полученную бактериальную массу двух кратно центрифугированием в физиологическим растворе при 5 тыс. об./мин. 20 минут. Из отмытых микробных клеток готовили "ацетоновый порошок". Для этого бактериальные клетки заливали ацетоном в соотношении 1:3, инкубировали на шейкере при 37 С 1,5 часа, осаждали центрифугированием и удаляли ацетон. Заливку ацетоном, инкубацию, центрифугирование и удаление ацетона повторяли двух кратно. Убитую ацетоном бактериальную массу оставляли при комнатной температуре с доступом воздуха до полного высушивания.
"Ацетоновый порошок" Y. enterocolitica О:3; О:5; О:6 и О:9 серовариантов использовали для получения ДМСО-антигена. Для этого "ацетоновый порошок" заливали 100%-м ДМСО в соотношении 1:6, инкубировали на шейкере при 37 С 40 минут, осаждали центрифугированием при 5 тыс. об./мин. 20 минут и удаляли осадок. Супернатант диализировали против 0,01 М КББ с рН=9,2-9,4 в течение 10 часов при комнатной температуре и механическом перемешивании диализирующей жидкости. Смену КББ проводили четырёхкратно. Полученный ДМСО-аетиген концентрировался путем испарения из него влаги в токе воздуха. Готовый ДМСО-антиген хранили в замороженном виде. Метод получения дезинтегрированных мембран Y. enterocolitica
Суточную культуру Y. enterocolitica засевали поверхность питательного агара в бактериологических матрасах. Смытую с матрасов двух-трёх суточную бактериальную культуру 2–3 раза отмывали центрифугированием физиологического раствора для освобождения от остатков питательной среды. Микробную массу в количестве 5 г суспензировали в 40 мл физиологического раствора. Взвесь подвергали ультразвуковой обработке на дезинтеграторе при 22 кГц 8 раз по 60 секунд, и охлаждению между обработками в течение 90 секунд в ледяной бане. Разрушенную бактериальную массу освобождали от целых клеток центрифугированием при 5 тыс. об./мин. в течение 20 минут. Надосадочную взвесь повторно центрифугировали при 18 тыс. об./мин. 20 минут. Цитоплазму и периплазму вместе с надосадочной жидкостью удаляли. Влажную массу клеточных стенок в количестве 1 г суспензировали в 10 мл 2%-го раствора SDS-Na (додецилсульфат натрия) на дистиллированной воде, инкубировали при комнатной температуре 20 часов с непрерывным перемешиванием. Не экстрагируемые компоненты из раствора удаляли центрифугированием при 18 тыс. об./мин. в течение 20 минут. Освобождение дезинтеграта от SDS-Na проводили диализом в течение 3 суток в дистиллированной воде с постоянным её механическим перемешиванием и шести-девяти кратной сменой. В составе ДМ кишечноиерсиниозного микроба преобладали белки]. Их концентрацию контролировали спектрофотометрически по методу Лоури [118]. Полученный дезинтеграт концентрировали испарением влаги в токе воздуха и хранили в замороженном виде.
Результаты исследований и их обсуждение патогенных
Непрямом ТИФА на планшетах коммерческая диагностическая агглютинирующая кишечноиерсиниозная сыворотка взаимодействовала с ДМСО-фракцией в титре 1:12800, а с ДМ кишечноиерсиниозного микроба в титре 1:800. Исследования антигенов проводили в концентрации 30 мкг/мл. Полученные данные свидетельствует о более высокой антигенной активности ДМСО-фракции (в 16 раз) по сравнению с ДМ.
Различий в антигенной активности ДМСО-фракций, полученных из различных серовариантов кишечноиерсиниозного микроба, выявлено не было (Таблица 3).
В ТИФА наблюдалась значительная перекрёстная реакция кишечноиерсиниозной ДМСО-фракции с псевдотуберкулёзной диагностической агглютинирующей сывороткой к О:1 и О:3 серовариантам, эшерихиозными диагностическими агглютинирующими ОК-поливалентными сыворотками, бруцеллёзной диагностической поливалентной сывороткой для РА. Сыворотка диагностическая агглютинирующая сальмонеллёзная адсорбированная поливалентная основных серогрупп АBCDE с ДМСО-фракцией не взаимодействовала (Таблица 3).
Значительные перекрёстные реакции свидетельствуют о слабой специфичности ДМСО-фракции Y. enterocolitica. Однако соотношение величин перекрёстных реакции кишечноиерсиниозной ДМСО-фракции с псевдотуберкулёзной, эшерихиозной и бруцеллёзной сыворотками определить трудно из-за разной активности гипериммунных сывороток. Таблица 3 - Результаты сравнительного анализа антигенной активности ДМСО-фракции О:3 сероварианта кишечноиерсиниозного микроба в концентрации 30 мкг/мл в ТИФА с диагностическими сыворотками Диагностические сыворотки ДМСО-фракция О:3 сероварианта кишечно-иерсиниозного микроба реагировала в ТИФАс сыворотками в титрах
Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии получены препараты трёх фракций белков ДМСО-антигена с массами 21, 27 и 38 кДа. Концентрация ДМСО-антигена, составлявшая 4 мг/мл, при разделении уменьшилась в 100 раз. Изучение антигенной активности отдельных белковых фракции ДМСО-антигена кишечноиерсиниозного микроба проводилось в ТИФА с экспериментальной кишечноиерсиниозной сывороткой к ДМСО-антигену (Таблица 4). Таблица 4 - Результаты сравнительного анализа антигенной активности белковых фракций ДМСО-антигена кишечноиерсиниозного микроба в ТИФА с экспериментальной кишечноиерсиниозной сывороткой к ДМСО-антигену Фракции белковДМСО-антигенакишечноиерсини-озного микроба Реагировали с экспериментальной сывороткой к ДМСО-антигену кишечноиерсиниозного микроба в титрах
Наивысшая антигенная активность отмечена у преобладающей белковой фракции с массой 21 кДа (Таблица 4). Для данной фракции антигенная активность оказалась в 6,4 раза выше, чем у фракции массой 38 кДа, с учётом разницы концентраций фракций 9:1 (Рисунок 1). Полученные данные указывают, что в ДМСО-фракции кишечноиерсиниозного микроба доля антигенно неактивного компонента незначительна. Таким образом, проведённые исследования позволили установить белковую природу ДМСО-антигена кишечноиерсиниозного микроба с преобладанием фракции белков массой 21 кДа. Данная фракция отвечает за высокую антигенность ДМСО-фракции. ДМСО-антиген кишечноиерсиниозного микроба имеет эпитопы к кишечноиерсиниозным, псевдотуберкулёзным, эшерихиозным бруцеллёзным антителам. С сальмонеллёзными антителами ДМСО-антиген кишечноиерсиниозного микроба не взаимодействует.
Была получена гипериммунная сыворотка крови кроликов, иммунизированных ДМСО-антигеном из Y. enterocolitica О:3 № 58. Данный штамм иерсиний первоначально выделен от поросёнка с признаками диареи, что делает его более перспективным для создания ветеринарных препаратов. Иммунизация проводилась цельным ДМСО-антигеном без разделения его на отдельные фракции.
Предварительным этапом получения гипериммунной сыворотки от кроликов было определение токсичности ДМСО-антигена для белых мышей.
Как видно из таблицы 5, при незначительных дозах ДМСО-антиген стимулировал иммунную систему мыши и не проявлял токсичных свойств. Наибольшая дыхательная активность наблюдалась у макрофагов при иммунизирующей дозе 31 мкг на мышь или 1,6 мг на 1 кг живой массы. Данная доза была выбрана, как оптимальная для введения белым мышам. При более высоких дозах нарастал токсичный эффект препарата. При дозах 250-500 мкг на мышь наступала гибель животных. Исходя из того, что коэффициент пересчёта дозы препарата с 1 кг живой массы мыши на 1 кг живой массы кролика имеет значение 3,7, следует, что иммунизирующая доза ДМСО-антигена для кролика составляет 0,43 мг/кг массы.
Для получения гипериммунной сыворотки крови кроликам массой 3,0 кг вводили по 1,3 мг ДМСО-антигена. Иммунизацию проводили в течение двух месяцев. После 5-9 иммунизаций исследовали кровь кроликов в ТИФА с ДМСО-антигеном в концентрации 1 мкг/мл. После 5-6 иммунизаций титр антител сыворотки крови животных с ДМСО-антигеном (1мкг/мл) в ТИФА составил 1:409600, после 7-8 - 1:819200, после 9 - 1:1638400. Таким образом, количество антител к 5-й иммунизации достигло высокого уровня, а затем увеличивалось медленно.
Результаты иммунизации кроликов ДМСО-антигеном показали, что он обладает значительными иммуногенными свойствами и пригоден для получения гипериммунных сывороток крови.
Сравнительный анализ антительной активности экспериментальной и коммерческих адсорбированных диагностических кишечноиерсиниозных сывороток в непрямом
Массовость исследований, проводимых при иерсиниозах, требует поиска дешёвых диагностических препаратов. В себестоимости диагностикумов не малую долю затрат составляет процесс выделения и очистки антигенов. Поэтому было принято решение для выделения кишечноиерсиниозных антигенов использовать широко применяемый в медицине и дешёвый растворитель ДМСО. Соотношение белков и углеводов в ДМСО-фракции кишечноиерсиниозного микроба составило 55:1. Хроматограммы ДМСО-фракций всех исследованных серовариантов Y. enterocolitica имели сходный рисунок. В процессе исследований были выявлены три фракции белков с массами 21, 27 и 38 кДа. Преобладающая фракция белка имела массу 21 кДа и обладала наиболее ярко выраженными антигенными свойствами.
Различий в антигенной активности ДМСО-фракций, полученных из различных серовариантов кишечноиерсиниозного микроба, выявлено не было. ДМСО-антиген кишечноиерсиниозного микроба имеел эпитопы к кишечноиерсиниозным, псевдотуберкулёзным, эшерихиозным бруцеллёзным антителам. С сальмонеллёзными антителами ДМСО-антиген кишечноиерсиниозного микроба не взаимодействовал. Была получена гипериммунная сыворотка крови кроликов, иммунизированных ДМСО-антигеном кишечноиерсиниозного микроба.
Для этого был выбран штамм Y. enterocolitica, выделенный от животного с признаками диареи, но утративший плазмиду патогенности. Отсутствие плазмиды вирулентности и связанных с нею клеточных структур позволяет использовать данный штамм для получения диагностической сыворотки, способной выявлять в патологическом материале иерсинии вне зависимости от степени их вирулентности.
Иммунизирующая доза ДМСО-антигена для кролика составила 0,43 мг/кг массы. Количество антител к 5 иммунизации достигло высокого уровня. В ТИФА на планшетах с ДМСО-антигеном в концентрации 1 мкг/мл титр антител составил 1:409600. При последующих иммунизациях титр специфических антител продолжал медленно увеличиваться.
Экспериментальная сыворотка к ДМСО-антигену в ТИФА и РА в равной степени взаимодействовала с кишечноиерсиниозными и псевдотуберкулёзными клетками. Более низкая специфичность сыворотки определялись с энтеропатогенной кишечной палочкой и бруцеллой бычьего типа, что потребовало её адсорбции клетками данных возбудителей.
Ведущая роль кишечного иерсиниоза в инфекционной патологии человека определяется его широкой распространённостью в продукции свиноводства, через которую и происходит заражение. Не редко у свиней, инфицированных возбудителем кишечного иерсиниоза, в кишечнике выявляют одновременную циркуляцию возбудителя псевдотуберкулёза. Окончательно роль Y. pseudotuberculosis в патологии животных не выяснена. Однако у людей данный возбудитель может вызывать вспышки тяжело протекающей инфекции. Антигенное родство и схожесть схем бактериологической диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза ставит перед исследователями задачу разработки тест-систем для одновременной индикации обоих возбудителей иерсиниозов. В работе была предпринята попытка создания именно таких тест-систем.
Высокая специфичность адсорбированной экспериментальной кишечноиерсиниозной сыворотки в реакциях с липополисахаридным и белковым антигенами клеточных стенок обоих видов иерсиний делают её перспективной для создания диагностических тест-систем, позволяющих одновременно определять Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis. Коммерческие тест-системы не обладают необходимыми характеристиками. На основе экспериментальной сыворотки созданы две тест-системы: для непрямого варианта ТИФА на планшетах и непрямого варианта ДИА с конъюгатом ЗНЧ. ТИФА на планшетах является одним из наиболее широко используемых методов иммуннологической диагностики пищевых иерсиниозов в России и за рубежом. Он обладает высокой воспроизводимостью результатов, чувствительностью, специфичностью и скоростью проведения анализа, позволяет экономно расходовать реагенты, не требует наличия дорогостоящего оборудования и даёт возможность учёта результатов с помощью приборов.
Клетки Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica выявлялись в ТИФА адсорбированной экспериментальной сывороткой, разведеной 1:50, в количестве 4106 м.к./мл. ДИА хорошо подходит для применения в малооснащённых лабораториях, так как не требует использования регистрирующего и промывающего оборудования, полистироловых планшет, многоканальных дозаторов, а также ориентирован для проведения одиночных анализов.
В непрямом ДИА с золотыми наночастицами экспериментальная адсорбированная сыворотка, полученная к ДМСО-антигену кишечноиерсиниозного микроба, взаимодействовала в разведении 1:50 с клетками кишечноиерсиниозного микроба - 6,2107 м.к./мл, клетками псевдотуберкулёзного микроба - 2,5108 м.к./мл.
Постановка окончательного диагноза при иерсиниозах возможна только по результатам бактериологического исследования. Существует несколько схем выделения иерсиний и поиск новых приёмов обогащения патологического материала при иерсиниозах продолжается. Это связано с высокими трудоёмкостью, длительностью, затратностью или недостаточной эффективностью отдельных схем бактрериологической диагностики.
Увеличению эффективности бактериологического метода и сокращению сроков выделения бактерий может способствовать индикация иерсиний в средах накопления с использованием современных иммунологических методов, поэтому созданные тест-системы были использованы именно на этапе раннего накопления иерсиний. Испытания экспериментальных тест-систем показали возможность их использования для индикации возбудителей кишечного иерсиниоза ипсевдотуберкулёза в средах накопления с фекалиями на 3-и и 6-е сутки "холодового обогащения" иерсиний. Исходное количество иерсиний в фекалиях инфицированных свиней при этом может составлять от 5103 м.к./см3 и выше. Наилучший результат индикации иерсиний получен на среде накопления 1% ЗПВ.