Содержание к диссертации
Введение
1. Введение
1.1 Актуальность работы
1.2 Цель и задачи исследований
1.3 Научная новизна работы
1.4 Теоретическая и практическая ценность работы
1.5 Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1.6 Соответствие диссертации паспорту научной специальности
1.7 Внедрение результатов
1.8 Апробация работы
1.9 Публикации научных исследований
1.10 Структура и объем диссертации
2. Обзор литературы
2.1 Этиологическая роль F. necrophorum в возникновении некробактериоза животных
2.2 Распространение некробактериоза животных
2.3 Источники возбудителя некробактериозной инфекции
2.4 Предполагающие факторы
2.5 Меры борьбы и профилактики
2.6 Анализ обзора литературы
3 Собственные исследования
3.1 Материалы и методы
3.2 Результаты собственных исследований
3.2.1 Конструирование вакцины против некробактериоза животных
3.2.2 Усовершенствование промышленной технологии производства сорбированной инактивированной вакцины против некробактериоза животных
3.2.2.1 Описание стадий технологического процесса и получение посевного материала
3.2.2.2 Производственное глубинное культивирование в ферментере
3.2.2.3 Расфасовка укупорка, обкатка, этикеровка, упаковка и хранение вакцины
3.2.2.4 Методы контроля вакцины
3.2.3 Доклинические, клинические и ветеринарные испытания сорбированной инактивированной вакцины против некробактериоза животных
3.2.3.1 Доклинические и клинические испытания вакцины (состав вакцины, стерильность, безвредность, РА после вакцинации – результаты клинических испытаний)
3.2.3.2 Оценка эффективности применения инактивированной сорбированной вакцины на оленях в условиях Республики Саха (Якутия) и на крупном рогатом скоте в хозяйствах Московской области .
3.2.3.3 Характеристика инактивированной сорбированной вакцины против некробактериоза конечной продукции производства.
3.2.4 Экономический эффект усовершенствования инактивированной сорбированной вакцины против некробактериоза животных
4 Обсуждение результатов
5 Выводы
6 Практические предложения
7 Список литературы
- Теоретическая и практическая ценность работы
- Распространение некробактериоза животных
- Усовершенствование промышленной технологии производства сорбированной инактивированной вакцины против некробактериоза животных
- Оценка эффективности применения инактивированной сорбированной вакцины на оленях в условиях Республики Саха (Якутия) и на крупном рогатом скоте в хозяйствах Московской области
Введение к работе
Актуальность темы. Совершенствование технологии производства
средств профилактики инфекционных болезней животных и внедрение в
ветеринарную практику эффективных биологических препаратов остается
актуальной задачей, направленной на ускоренное развитие животноводства.
В последние годы в животноводческих хозяйствах ряда регионов Российской
Федерации широкое распространение получили различные заболевания
конечностей, в том числе с участием F. necrophorum, которые связаны с нарушением технологии кормления и содержания животных, травматизмом и мацерацией кожи с нарушением ее защитных свойств с последующим внедрением в ткани микрофлоры различной ассоциации.
Значительный вклад в изучение болезней конечностей, в том числе и
некробактериоза, в совершенствование системы ветеринарно-санитарных,
профилактических и лечебных мероприятий внесли отечественные и
зарубежные ученые: Н.С.Островский (1968); И.И.Архангельский с
соавт.(1986); А.Х.Лайшев с соавт. (1966); Г.Н. Васин (1983); С.И. Братюка
(1985,1988); А.П. Кудрявцев (1985); А.А. Самоловов с соавт,
(1984,1988,2000,2010); Сидорчук А.А. с соавт.(2002,2006); Ю.Д.Караваев с
соавт.(1999,2003); С.В.Лопатин (2001); Н.В.Мельник, А.Я.Самуйленко,
А.М.Гулюкин(2015); Д.А.Хузин (1995,2015); P. D. Walker et. аl. (1981); S. Saginala et. аl. (1997) и многие другие.
В качестве мер профилактики в животноводческих хозяйствах проводят
общие ветеринарно-санитарные мероприятия, направленные на оздоровление
животных от некробактериоза, включая специфическую профилактику
(Гулюкин М.И., Юров К.П., Караваев Ю.Д. (2006). Однако применение
ветеринарно-санитарных и профилактических мероприятий не позволяет в
полной мере обеспечить оздоровление животноводческие хозяйства от
некробактериоза.
Экономический ущерб при некробактериозе животных, особенно
высокопродуктивного молочного скота, складывается из повышенной выбраковки, низких приростов живой массы, уменьшения надоя молока, увеличения риска возникновения ассоциаций других инфекций, расходов на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий.
В Российской Федерации для ускоренного развития молочного
скотоводства, улучшения генетического фонда, повышения молочной и
мясной продуктивности крупного рогатого скота, согласно государственной
программы развития АПК, по лизингу в животноводческие хозяйства
завозятся из ряда стран Западной Европы, Канады и Австралии нетели и
телки случного возраста черно-пестрой, голштинской породы. Однако при
реализации программы адаптации возникают трудности, связанные с высокой
заболеваемостью импортируемого поголовья крупного рогатого скота с
признаками поражения конечностей у 20-35% завезенных нетелей и коров
голштинской породы с регистрирацией через 2-3 недели после поступления на ферму.
Московская область входит в состав неблагополучных по некробактериозу
регионов, в которых в процессе переболевания животные теряют 30-40%
живой массы и производства молока до 1 тонны. Проблема профилактики и
оздоровления крупного рогатого скота от некробактериоза требует
комплексного подхода к её решению путем целенаправленных действий
исполнительной власти Московской области с учетом сложившейся
эпизоотической ситуации и внедрении в ветеринарную практику новых высокоэффективных средств специфической профилактики.
За последние 20 лет для профилактики некробактериоза животных
предложены и апробированы моно и ассоциированные вакцины, применение
которых способствовало снижению заболеваемости, а в отдельных случаях и
его ликвидации (Ю.Д.Караваев,И.Н.Семенова (1995,1998,2003); О.И.
Соломаха (1999); А.А.Сидорчук с соавт.,(2001,2006); А.Я. Самуйленко, Н.В. Мельник (2014); M. Katinka et. al. (1981). Однако большинство вакцин против
некробактериоза формируют у привитых животных непродолжительный иммунный ответ и обладают значительной реактогенностью.
В этой связи разработка эффективных средств специфической профилактики некробактериоза, обеспечивающих формирование у привитых животных напряженного иммунного ответа после вакцинации не менее года, имеет большое научное и практическое значение.
Цель и задачи исследований. Целью настоящего научного
исследования является совершенствование промышленной технологии изготовления вакцины сорбированной инактивированной для профилактики некробактериоза животных. Для реализации данной цели необходимо решить следующие задачи:
-обосновать научные принципы и стратегию конструирования
сорбированной вакцины против некробактериоза;
-усовершенствовать промышленную технологию производства вакцины сорбированной инактивированной против некробактериоза животных;
- приготовить и провести доклинические испытания опытно- промышленных серий сорбированной инактивированной вакцины;
-провести оценку эффективности сорбированной инактивированной вакцины в производственных условиях на оленях Республики Саха (Якутия) и на крупном рогатом скоте в хозяйствах Московской области;
- разработать нормативно-техническую документацию на производство, контроль и применение вакцины сорбированной инактивированной против некробактериоза животных.
Научная новизна работы. Усовершенствована промышленная
технология изготовления вакцины сорбированной инактивированной против
некробактериоза животных. Дано научное обоснование конструирования
сорбированной вакцины против некробактериоза животных, выбора
эффективной дозы и способа ее применения. В производственных условиях
показана профилактическая эффективность двукратного введения
сорбированной вакцины крупному рогатому скоту внутрикожно в суммарной
дозе 0,4см3 с интервалом 4-6 недель и однократной внутрикожной
иммунизации оленей в дозе 0,2 см3. Показано, что ежегодная вакцинация
сорбированной инактивированной вакциной способствовала формированию у привитых животных напряженного иммунного ответа длительностью не менее 1 года и предохраняла более 99% КРС и 97% оленей от заболевания некробактериозом в течение 2х лет (срок наблюдения).
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты
проведенных исследований вносят существенный теоретический и
практический вклад в совершенствование технологии производства вакцин
для профилактики некробактериоза животных. По усовершенствованной
технологии получена и апробирована сорбированная инактивированная
вакцина против некробактериоза животных, эффективность которой
подтверждена результатами испытаний в производственных условиях на
поголовье оленей и крупного рогатого скота. Предложена эффективная схема
иммунизации крупного рогатого скота и северных оленей сорбированной
вакциной F. Necrophorum штамма «0-1»(ВИЭВ) в комплексе мер борьбы с
некробактериозом животных. Результаты исследований учтены при разработке
нормативно-технической документации на производство, контроль и
применение сорбированной инактивированной вакцины для профилактики
некробактериоза животных, которая передана на регистрацию в единый реестр лекарственных средств Росветнадзора Минсельхоза России.
Методология и методы исследования. В экспериментальных и
производственных исследованиях по усовершенствованию технологии
получения сорбированной инактивированной вакцины использовали
производственный штамм Fusobacterium necrophorum "0-1" (ВИЭВ). Для
конструирования вакцины использовали инактивированную формальдегидом
суспензию бактериальных клеток и препарат очищенного и
концентрированного экзотоксина, гидроокись алюминия (ГОА), сапонин и
глицерин в оптимальных соотношениях. Изготовление, контроль и
доклинические испытания опытно-промышленных серий инактивированной
сорбированной вакцины против некробактериоза животных проводили совместно со специалистами ФКП "Щелковский биокомбинат".
Технологическое оборудование. Культуру Fusobacterium necrophorum
производственного штамма "0-1"( ВИЭВ) выращивали в пробирках, бутылях
и ферментерах «Электролюкс» с системой автоматического контроля
основных параметров культивирования (ТоС, рО2, еН, рН,) согласно
технической документации. Концентрацию микроорганизмов в бактериальной
суспензии измеряли на ФЭК-56 с использованием стандартов мутности
«ГИСК» им. Л.А. Тарасевича (Москва). Препарат очищенного и
концентрированного экзотоксина получали ультрафильтрацией супернатанта,
полученного после центрифугирования культуральной бактериальной
суспензии на установке УПЛ–0,6 (Россия).
Методы доклинических испытаний. Доклинические испытания опытно-промышленных серий вакцины проводили согласно ГОСТ Р 54063-2010. Иммуногенную активность вакцины устанавливали определением в реакции агглютинации (РА) титров специфических противонекробактериозных антител в сыворотках крови вакцинированных кроликов, полученных на 30 день после двукратного введения вакцины подкожно в дозе 1 см3 с интервалом 14 суток.
Клинические испытания. Эффективность опытно-промышленных серий
сорбированной вакцины оценивали по реактогенности, уровню
противонекробактериозных антител в сыворотке крови вакцинированных
домашних северных оленей (п=90), стада №1 КРО «Нутендли»
Нижнеколымского района Республики Саха (Якутия) и крупного рогатого скота
(п=356) в Московской области и наблюдениям по заболеваемости животных
после вакцинации. Реакцию агглютинации (РА) ставили согласно наставлению
по применению антигена некробактериозного (производство ФКП
«Щелковский биокомбинат») в «Испытательном центре ветеринарных
препаратов» ФКП «Щелковский биокомбинат и отделе иммунологии ФГБНУ ВНИТИБП. Для оценки эффективности по принципу аналогов формировали
опытные группы КРС и оленей, которых иммунизировали сериями
сорбированной инактивированной вакцины, животных контрольной группы
прививали производственной серией эмульгированной вакцины против
некробактериоза согласно наставлению по ее применению.
Положения диссертации, выносимые на защиту:
-совершенствование промышленной технологии производства
сорбированной инактивированной вакцины против некробактериоза
животных;
-конструирование сорбированной инактивированной вакцины против
некробактериоза животных;
- доклинические и производственные испытания, оценка эффективности опытно-промышленных серий сорбированной инактивированной вакцины против некробактериоза животных.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
результатов исследований подтверждена соответствием теоретических данных
с результатами проведенных экспериментальных исследований. Полученные
результаты исследований обрабатывали с использованием общепринятых
методов статистики (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962) и с помощью
программы Microsoft Office 2007. Материалы диссертации доложены и
обсуждены в виде ежегодных отчетов на Ученом совете и методической
комиссии ВНИТИБП (2014-2016 гг.) и на Международных научно-
практических конференциях (Щелково, Армавир 2014-2016 гг.).
Публикации. Основные положения диссертационной работы
опубликованы в 7 печатных работах, в том числе 2 статьи в изданиях, в
перечени журналов, рекомендованных ВАК Минобрнауки России. По
результатам исследований получено 2 патента РФ.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Результаты научных исследований соответствуют пунктам 2, 3, 4 и 11 паспорта специальности 03.01.06 и пунктам 2,3,9 и 14 паспорта специальности 06.02.02.
Объем и структура и объем диссертации. Диссертационная работа построена по традиционному плану и включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть с заключением и выводами, списком литературы и приложений. Список литературы включает 199 источников, из которых 148 отечественных и 51 зарубежных авторов. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, её научную и практическую значимость. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 13 таблицами.
Личный вклад автора заключается в научном обосновании основных положений диссертации, постановке цели и задач исследований, планировании экспериментальных исследований, обобщении результатов и рекомендаций их для практики. Результаты диссертационной работы получены лично автором или в качестве ответственного исполнителя отдельных этапов проведенных исследований.
Благодарности. Автор выражает благодарность научным
руководителям работы доктору биологических наук, профессору С.А. Гринь и
доктору биологических наук Е.В. Сусскому; директору ФГБНУ ВНИТИБП,
академику РАН А.Я. Самуйленко; профессору, доктору ветеринарных наук,
президенту национальной ассоциации "Ветбиопром" Н.В. Мельнику;
заведующей отделом иммунологии ВНИТИБП доктору биологических наук,
профессору В.И. Клюкиной; начальнику противобактерийного,
противовирусного и диагностического производства ФКП "Щелковский биокомбинат" А.С. Тройнину; сотрудникам института ФГБНУ ВНИТИБП и специалистам ФКП "Щелковский биокомбинат" за помощь в выполнении отдельных этапов выполнения диссертации.
Теоретическая и практическая ценность работы
Некробактериоз (род Fusobacterium содержит 17 видов) - инфекционная болезнь всех видов домашних, многих диких млекопитающих животных, а также птиц, характеризующаяся гнойно-некротическим поражением кожи, слизистой оболочки, внутренних органов и конечностей. Описаны случаи заболевания людей. Наиболее восприимчивы к заболеванию- КРС, затем северные олени, овцы, свиньи, лошади, менее –кролики, куры, человек и другие виды. Возбудитель некробактериоза- полиморфные не образующие спор и капсул, неподвижные, строгие анаэробы размером 0,7-1,0 х 100-300 мкм грамотрицательные палочки, кокки, коккобактерии, нити, подразделяющиеся на 4 (серо) типа А, АВ, В, С (А и В наиболее патогенные) [195]. Факторы патогеннности. Fusobacterium necrophorum образует ряд сильных токсинов (гемолизин, лейкоцидин, цитоплазматический токсин) и ферментов (лецитиназа, гиалуронидаза), которые разрушают клетки организма и угнетают его иммунную систему [155,178,183,198].
Патогенность представителей рода Fusobacterium определяется липополисахаридным (ЛПС) эндотоксином [170] и его содержание строго коррелирует со степенью воспаления [175,177,188]. Показано, что ЛПС F. nucleatum летален для мышей и куриных эмбрионов, пирогенен для кроликов, активирует комплемент человека и морской свинки, стимулирует резорбцию костной ткани [168,176,180,190,191] . Подтверждено влияние липополисахаридного эндотоксина, цитоплазматического токсина и надосадочных фракций F.necrophorum на формирование некроза печени, а также взаимосвязи токсинов с тяжестью инфекции [179]. Лейкотоксин давно рассматривается как важный фактор вирулентности F.necrophorum [155,158,160,161,193,194,197]. Ряд опытов показал, что существует зависимость между невосприимчивостью к лейкотоксину и устойчивостью к F.necrophorum [162]. Так сообщается, что скот, иммунизированный культуральным супернатантом, содержащим лейкотоксин, оказался довольно устойчивым к интердигитальному некробактериозу [156], тогда как пассивная иммунизация мышей кроличьей антилейкотоксиновой сывороткой не смогла защитить животных от экспериментальной инфекции [162,186].
Установлено, что культуральный супернатант обладает более иммуногенной и протективной активностью, чем другие компоненты F.necrophorum [192]. Иммунный ответ на бесклеточный культуральный супернатант выше, чем на клеточную культуру, при равном содержании лейкотоксина в обоих образцах [185].
Исследования биологических свойств лейкотоксина показали, что лейкотоксин - это термолабильный протеин, который инактивируется протеолитическими ферментами и чувствителен к изменениям рН [157,162]. По мнению других ученых лейкотоксин стабилен при рН от 3 до 11, устойчив к действию протеолитических ферментов и сохраняет свои свойства при 56 или 100 С0 [166,187,199].
Нестабильность лейкотоксина затрудняет очистку и изучение его свойств. После 4 часов инкубации при 37 0С наблюдалось снижение активности лейкотоксина на 19%. Предполагается, что продуцируемые Fusobacterium necrophorum протеолитические ферменты [193,194,199] частично являются причиной нестабильности лейкотоксина. Если патогенность Fusobacterium necrophorum принято связывать с продукцией лейкотоксина, то установлено, что биовар А продуцирует в 18 раз больше лейкотоксина, чем биовар В [187,193].
К лейкотоксину F.necrophorum были получены моноклональные антитела, которые использовались для аффинной очистки лейкотоксина: из культурального супернатанта. Разработанная тест-система «сэндвич» варианта ИФА с использованием мАТ позволила обнаружить около 1 нг лейкотоксина [194]. Противонекробактериозная вакцина на основе лейкотоксина вызывала образование в сыворотке крови вакцинированных животных значительных титров антилейкотоксиновых антител. Вакцинированные данной вакциной животные были значительно менее склонны к развитию печеночных абсцессов при последующем экспериментальном интрапортальном заражении [184]. Иммунитет. Естественный иммунитет при переболевании практически не вырабатывается. По искусственному иммунитету долгое время были споры - есть или нет, единого мнения нет до сих пор.
Распространение некробактериоза животных
Диагностика некробактериоза животных проводится комплексно, с учетом эпизоотологических данных, клинических исследований, патологоанатомических изменений и лабораторных исследований. Лабораторная диагностика некробактериоза основана на результатах бактериологического исследования путем выделения культуры при посеве на питательные среды и бактериоскопическом исследовании мазков-отпечатков из пораженных тканей [147,148]. Некробактериоз необходимо дифференцировать у КРС от ящура, вирусной диареи, везикулярного стоматита, чумы, контагиозной плевропневмонии, дерматофилеза. У мелкого рогатого скота некробактериоз дифференцируют от копытной гнили, ящура, оспы, блутанга, у ягнят- от стрептококкового полиартрита. Бактериологическое исследование. Прижизненно исследуют соскобы ткани в области венчика, межкопытной щели, ротовой полости, ноздрей. Посмертно от крупных животных берут паренхиматозные органы и ткани с некротическими очагами. Из-за низкой устойчивости возбудителя материал необходимо исследовать сразу после взятия или после консервирования в глицерине. В мазках-отпечатках, окрашенных по Граму или Романовскому, F.necrophorum имеет форму длинных переплетающихся нитей, или единичных клеток [128,134]. Выделение возбудителя. Возбудитель некробактериоза хорошо культивируется при температуре 36-37 С, рН 7,4-7,6 на агаровых средах с добавлением цельной крови, сыворотки крови, глюкозы, лактозы, дрожжевого экстракта или в печеночном бульонe с добавлением сыворотки крови. Идентификацию F.necrophorum проводят по ферментативной активности и способности гидролизовать гиппурат, эскулин, образовывать индол, сероводород, кислоту из углеводов.
Биопробу проводят заражением патматериалом или выделенной культурой кроликов путем введения исследуемого материала подкожно в область средней трети наружной поверхности уха или внутрикожно в область живота, на мышах подкожно у основания хвоста. В положительных случаях на месте инъекции через 3-4 дня или позднее развивается воспалительный процесс с некрозом кожи [164].
Метод флюорисцирующих антител (МФА) оказался высокоэффективным и специфическим диагностическим тестом в диагностике возбудителя некробактериоза [165]. Метод ПЦР является наиболее чувствительным и специфическим, основан на выявлении фрагментов генома возбудителя в биологическом материале с помощью молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции [122].
Имеются сообщения по мРНК и ДНК-маркированию культур Fusobacterium necrophomm с целью их дифференциации по родам. Впервые в РФ разработан способ мономорфного STSs- генотипирования Fusobacterium necrophorum с помощью мультипраймерной ПЦР, позволяющей проводить обнаружение генетических признаков характерных для патогенного подвида Fusobacterium necrophorum. subspecies necrophorum, обладающих патогенным свойством агглютинировать эритроциты [96].
Серологические методы включают: реакцию связывания компонента (РСК), реакцию гемагглютинации (РГА), реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), кровекапельную реакцию непрямой гемагглютинации (КРНГА), реакцию диффузной преципитации в геле агара и иммунофлюоресцентный метод [172,196]. Метод иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения антител с использованием в качестве антигена экзотоксина применяется в исследованиях сывороток крови вакцинированных и больных животных [23,110,165]. Контроль эффективности применения вакцин определяют по титру антител сыворотки крови животных, иммунизированных инактивированными микробными клетками Fusobacterium necrophorum на которые вырабатываются агглютинины.. В настоящее время для обнаружения антител против возбудителя некробактериоза F. pecrophorum используют реакцию агглютинации (РА) с антигеном F. necrophorum.
Для приготовления антигена F. Necrophorum культуру бактериальных клеток освобождали от среды центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин., промывали физио-:тическим раствором 5-6 раз. Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере (рН 7,6) до концентрации 10 млрд микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту. Антиген инактивировали 0,4%-ным эаствором формалина. Учет реакции проводят визуально и результаты РА определяют в крестах. Показатели агглютинации в пробирках на четыре, три или два креста характеризуются как положительная реакция. Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается агглютинация с оценками на два, три или четыре креста, считают ее титром.
Усовершенствование промышленной технологии производства сорбированной инактивированной вакцины против некробактериоза животных
Положительные результаты доклинической оценки инактивированной сорбированной вакцины позволили перейти к испытаниям их в производственных условиях на оленях родовой общины «Нутендли» Нижнеколымского района Республики Саха (Якутия), где общей вакцинацией было охвачено 90 голов и на 356 головах крупного рогатого скота ЗАО «Памяти Ильича», «Макеево» Зарайского Муниципального района Московской области, неблагополучных по некробактериозу. Исследование сыворотки крови до вакцинации выявило в 50% проб КРС и в 20% проб оленей наличие агглютинирующих некробактериозных антител в максимальном титре 1:8, что подтверждает неблагополучие данных хозяйств по заболеваемости некробактериозом.
Нашими предыдущими исследованиями была установлена оптимальная иммунизирующая суммарная доза для КРС- 0,4см3 и 0,2 см 3 для оленей, которые были взяты нами за основу (Т.Н.Пышкина 2000, А.А.Плохова 2007, Е.И.Винокуров2015). Оценку эффективности схемы применения сорбированной вакцины проводили по результатам определения напряженности и длительности иммунного ответа, а также по заболеваемости КРС и оленей в сравнительном аспекте с эмульгированной вакциной против некробактериоза на основе экзотоксина вакцинного штамма F.necrophorum «О-1» в масляном адьюванте. Вакцинацию КРС и оленей считали эффективной, если титр агглютинирующих противонекробактериозных антител в сыворотках крови вакцинированных животных составляет не менее 1:16 (Ю.Д.Караваев, И.Н.Семенова, 2003).
В опытах на поголовье КРС по принципу аналогов формировали 2 группы, каждую группу делили на 3 подгруппы по 25 голов, которых иммунизировали в суммарной дозе 0,4 см3 однократно каждой серией вакцины (группа-1); двукратно – с интервалом 4-6 недель, вторая доза (бустерная иммунизация) – по 0,4 см3 (группа-2). Животных контрольной - (группа– 3) иммунизировали однократно в дозе 0,4 см3 эмульгированной вакциной. Подопытных и контрольных оленей вакцинировали однократно в дозе 0,2 см3. Схема и методика применения сорбированной инактивированной вакцины представлена в таблице 4. Схема и методика применения вакцины сорбированной инактивированной против некробактериоза животных Количество голов № серии Способ применения Первая группа животных 1 25 Суммарная вакцинальная для КРС доза 0,4 см 3 вводится внутрикожно при помощи безыгольного инъектора в две точки на расстоянии 7-10 см по 0,2 см3. 2 25 Суммарная вакцинальная доза 0,4 см 3 вводится внутрикожно при помощи безыгольного инъектора в две точки на расстоянии 7-10 см по 0,2 см3. 3 25 Суммарная для КРС вакцинальная доза 0,4 см 3 вводится внутрикожно при помощи безыгольного инъектора в две точки на расстоянии 7-10 см по 0,2 см3. Вторая группа животных 1 25 Суммарная для КРС вакцинальная доза 0,4 см 3 вводится внутрикожно при помощи безыгольного инъектора в две точки на расстоянии 7- 10 см по 0,2 см3. Повторное введение проводят через 4-6 недель, в дозе 0,4см3 на расстоянии 7-10 см по 0,2см3 . 2 25 Суммарная для КРС вакцинальная дозы 0,4 см 3 вводится внутрикожно при помощи безыгольного инъектора в две точки на расстоянии 7-10 см по 0,2 см3. Повторное введение проводят через 4-6 недель, в дозе 0,4см3 на расстоянии 7-10 см по 0,2см3 . 3 25 Суммарная для КРС вакцинальная дозы 0,4 см 3 вводится внутрикожно при помощи безигольного инъектора в две точки на расстоянии 7-10 см по 0,2 см3. Повторное введение проводят через 4-6 недель, в дозе 0,4см3 на расстоянии 7-10 см по 0,2см3 .
Контроль 10 Согласно инструкции по применению препарата «Вакцина против некробактериоза животных эмульгированная». В таблицах 5,6 представлены результаты исследований в РА выборочных проб сыворотки крови КРС и оленей, взятых через 1, 3, 9 и 12 месяцев после вакцинации. Таблица – 5 Результаты исследований сыворотки крови КРС первой группы Сроки после вакцинации Титр антител в РА Серии вакцины/всего сывороток /количество положительных сывороток (абс.,%) Серия №1 Серия №2 Серия №3 Эмульгированная вакцина 1 месяц 1:16 10/8 (80%) 10/8 (80%) 10/8 (80%) 1:32 10/4 (40%) 10/2 (20%) 10/6 (60%) 3 месяца 1:64 10/8 (80%) 10/10 (100%) 10/4 (40%) 10/10 (100%) 1:128 10/4 (40%) 10/4 (40%) 10/4 (40%) 10/6 (60%) 1:256 10/2 (20%) 10/4 (40%) 10/2 (20%) 1:512 10/2 (20%) 10/4 (40%) 10/2 (20%) 1:1024 10/2 (20%) 9 месяцев 1:16 10/6 (60%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 1:32 10/10 (100%) 10/6 (60%) 10/10 (100%) 1:64 10/2 (20%) 10/4 (40%) 10/6 (60%) 1:128 10/4 (40%) 12 месяцев 1:16 10/10 (100%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 10/8 (80%) 1:32 10/6 (60%) 10/4 (40%) 10/6 (60%) 1:64 10/2 (20%) 10/2 (20%) 10/4 (40%) 1:128 10/2 (20%) Таблица – 6 Результаты исследований сыворотки крови КРС второй группы Сроки после ревакцинации Титр антител в РА Серии вакцины/всего сывороток /количество положительных сывороток (абс.,%) Серия №1 Серия №2 Серия №3 Эмульгированная вакцина 1 месяц 1:16 10/8 (80%) 10/10 (100%) 10/10 (80%) 1:32 10/4 (40%) 10/8 (80%) 10/2 (20%) 1:64 10/4 (40%) 10/2 (20%) 3 месяца 1:64 10/10 (100%) 10/8 (80%) 10/4 (40%) 10/6 (60%) 1:128 10/4 (40%) 10/6 (60%) 10/4 (40%) 10/6 (60%) 1:256 10/2 (20%) 10/4 (40%) 1:512 10/2 (20%) 9 месяцев 1:16 10/10 (100%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 1:32 10/4 (40%) 10/10 (100%) 10/8 (80%) 10/8 (80%) 1:64 10/2 (20%) 10/4 (40%) 10/6 (60%) 10/4 (40%) 1:128 10/2 (20%) 12 месяцев 1:16 10/10 (100%) 10/4 (40%) 10/10 (100%) 10/2 (20%) 1:32 10/8 (80%) 10/2 (20%) 10/8 (80%) 1:64 10/2 (20%) 10/4 (40%) Представленные в таблице данные показали, что через 12 месяцев агглютинирующие противо-некробактериозные антитела в титре 1:16 были выявлены в 100% сывороток КРС первой и второй групп после иммунизации вакцинами всех 3-х серий. Максимальный титр 1:128 антител был выявлен в сыворотках крови 20% КРС, привитых вакциной №3, титр 1:64 у 20% КРС, привитых вакциной №1 и №2.
Оценка эффективности применения инактивированной сорбированной вакцины на оленях в условиях Республики Саха (Якутия) и на крупном рогатом скоте в хозяйствах Московской области
Коробки с вакциной упаковывали в фанерные ящики массой брутто не более 15 кг, которые при соблюдении правил транспортирования и хранения должны обеспечивать сохранность вакцины. Внутрь каждого ящика вкладывали контрольный лист с указанием наименования вакцины, количества коробок в ящике, номеров серий, даты упаковки, фамилия или номер упаковщика.
На каждый ящик наклеивали этикетку, где указывают данные об упакованной продукции: наименование препарата, его количество в ящике, срок годности, условия хранения, обозначение ТУ (СТО).
На каждое грузовое место наносили транспортную маркировку по ГОСТ 14192-77 с указанием манипуляционных знаков: «Осторожно, хрупкое!», «Боится нагрева!», «Соблюдение интервала температур» и предупредительную надпись «Биопрепараты!». Совмещение транспортной маркировки и маркировки, характеризующей данные об упакованной продукции, на одной стороне транспортной тары не допускается.
Вакцину сорбированную инактивированную, против некробактериоза животных хранили на предприятии-изготовителе и в организации потребителе в сухом темном помещении при температуре +4+10С. Срок годности вакцины -один год со дня изготовления.
Транспортируют вакцину всеми видами транспорта в соответствии с «Правилами перевозок скоропортящихся грузов и багажа», действующими на данном виде транспорта.
7 этап.Методы контроля вакцины против некробактериоза животных
1.Отбор проб. Отбор проб проводят по ОСТ 10.07.001. Из выборки 10 флаконов используют для испытаний, а 10 - хранят в архиве ОБК в течение сока годности. 2.Маркировка архивных образцов по ОСТ 10-07-001.
3.Определение внешнего вида, цвета, наличия плесени и механических примесей. Определение внешнего вида, цвета, наличия плесени и механических примесей, трещин флаконов с вакциной проводят визуально, одновременно флаконы проверяют на прочность укупорки и правильность этикетирования.
4.Определение стабильности. Для определения стабильности эмульсии не менее двух образцов (флаконов) вакцины выдерживают в течение 14 сут. при температуре (37-38)С. Вакцина должна оставаться без изменений внешнего вида. Допускается отслоение адъюванта с толщиной слоя не более 1,0 см3 над гомогенным слоем вакцины.
5. Определение стерильности. Стерильность препарата определяют в соответствии с ГОСТ 28085. Вакцины должна быть стерильной.
6. Определение безвредности. Для проведения испытания берут 5 флаконов с препаратом. Из каждого образца отбирают по 1,5-2,0 см3 в стерильный флакон, смесь вакцины встряхивают и полученную среднюю пробу вводят 4 клинически здоровым кроликам внутримышечно в дозе 1,0 см3, мышам - 5 гол., внутримышечно по 0,2 см3. Животные находятся под наблюдением в течение 10 сут. Вакцину считают безвредной, если все животные остаются живыми в течение периода наблюдения. Допускается образование незначительных отеков у кроликов на месте введения вакцины. При гибели любой части животных, проверку повторяют на удвоенном количестве данного вида. При повторной гибели хотя бы одного животного, серию препарата бракуют. Каждое животное используют в опыте один раз.
7. Определение иммуногенной активности. Определение иммуногенной активности заключается в определении титров агглютининов к возбудителю некробактериоза в сыворотках крови вакцинированных кроликов. С этой целью отбирают 6 клинически здоровых кроликов серонегативных к некробактсриозу. Смесь вакцины из 5 флаконов вводят двукратно с интервалом 12 суток внутримышечно в дозе 0,5 см3 - первый раз и 0,75 см3 - второй раз. Через 12 суток после второго введения вакцины у животных берут кровь из уха, получают сыворотку и исследуют ее в реакции агглютинации с антигеном F.necrophorum .
8. Постановка реакция агглютинации. Из испытуемых сывороток делают основное разведение 1:4. Для этого в пробирку 1,8 см3 физиологического раствора вносят калиброванной пипеткой 0,6 см3 сыворотки и перемешивают. После этого готовят двукратные серийные разведения испытуемых сывороток от 1:4 до 1:512.
С этой целью в первую и вторую пробирки вносят по 1,0 см3 основного разведения (1:4), во вторую, третью и т.д. по 1,0 см3 физиологического раствора. Путем перемешивания и последовательного переноса жидкости по 1,0 см5 из второй пробирки в третью, из третьей в четвертую и т.д.
Получают соответствующие разведения сыворотки. Из последней пробирки 1,0 см3 жидкости после смешивания удаляют.
Аналогично разводят позитивную и нормальную контрольные сыворотки. В отдельную пробирку наливают 1,0 см3 физиологического раствора (контроль антигена на спонтанную агглютинацию). Флакон с антигеном F.necrophorum встряхивают до получения гомогенной взвеси.
Во все пробирки калиброванной пипеткой вносят по 0,05 см3 взвеси антигена, встряхивают до образования в них гомогенной, слегка опалесцирующей взвеси и ставят при температуре (37±1)С на 4-6 ч, затем дополнительно выдерживают при комнатной температуре до 24 ч, после чего проводят учет реакции.