Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 15
1.1. Диагностика бруцеллеза животных 15
1.2. Диагностическое и дифференциально-диагностическое значение различных серологических методов при бруцеллезе животных, в том числе в связи с использованием различных схем специфической профилактики 25
1.3. Роль О-полисахаридных антигенов бруцелл в серологической диагностике бруцеллеза животных .30
1.4. Заключение по обзору литературы .36
2. Собственные исследования .39
2.1. Материалы и методы исследований .39
2.2. Результаты исследования 40
2.2.1. Изучение диагностической эффективности РИД с О-ПС антигенами, изготовленными из различных видов и штаммов бруцелл, в сравнении с РА и РСК при естественном бруцеллезе животных 40
2.2.2. Использование РИД с О-ПС – антигенами, изготовленными из штаммов B. аbortus 19 (А-антиген) и B. melitensis Rev-1 (М-антиген) в сравнении с РА и РСК в целях выявления активных эпизоотических очагов бруцеллеза мелкого рогатого скота и определения их эпидемической значимости .45
2.2.3. Сравнительная оценка диагностической эффективности РИД с О-ПС А– и М-антигенами, РНГА, РА и РСК при комплексных исследованиях на бруцеллез мелкого и крупного рогатого скота, в том числе иммунизированного против указанной болезни по различным схемам, в разных эпизоотических ситуациях .53
2.2.4. Сравнительное изучение диагностической активности РИД с О-ПС А антигеном, изготовленным из штамма B. аbortus 19 и с О-ПС M-антигеном, изготовленным из штамма B. melitensis Rev-1, а также О-ПС М:А– антигеном, представляющим механическую смесь А- и М- антигенов в разных соотношениях, на мелком и крупном рогатом скоте с естественным течением бруцеллеза .70
3. Обсуждение результатов исследований 81
4. Выводы 94
5. Практические предложения .97
6. Список сокращений и условных обозначений 99
7. Список литературы
- Диагностическое и дифференциально-диагностическое значение различных серологических методов при бруцеллезе животных, в том числе в связи с использованием различных схем специфической профилактики
- Заключение по обзору литературы
- Изучение диагностической эффективности РИД с О-ПС антигенами, изготовленными из различных видов и штаммов бруцелл, в сравнении с РА и РСК при естественном бруцеллезе животных
- Сравнительное изучение диагностической активности РИД с О-ПС А антигеном, изготовленным из штамма B. аbortus 19 и с О-ПС M-антигеном, изготовленным из штамма B. melitensis Rev-1, а также О-ПС М:А– антигеном, представляющим механическую смесь А- и М- антигенов в разных соотношениях, на мелком и крупном рогатом скоте с естественным течением бруцеллеза
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Инфекционные болезни являются одним из основных факторов, сдерживающих развитие животноводства регионов страны. При этом особое место занимает бруцеллез, так как он наносит большой экономический ущерб отрасли и имеет большое социальное значение.
Опыт борьбы с бруцеллезом животных в нашей стране показывает, что
эффективность противоэпизоотических мероприятий всегда в значительной степени была зависима от уровня научной разработки и практической реализации различных схем специфической профилактики. В основе вакцинации лежит принцип создания и поддержания у восприимчивых животных неблагополучных и угрожаемых стад (отар) непрерывного и напряженного иммунитета на весь период неблагополучия и угрозы, при условии планомерного вытеснения всего скомпрометированного поголовья и замены его здоровыми животными.
Наиболее актуальна в эпизоотологическом и эпидемиологическом отношении
проблема бруцеллеза мелкого рогатого скота, успешное решение которой во многом зависит
от рационального использования в системе противобруцеллезных мероприятий вакцин и,
главным образом, живой вакцины из агглютиногенного штамма B.abortus 19 (Е.С. Орлов,
1962; Г.Н. Глотов, 1969; М.М. Иванов, 1971; Т.Е. Какоулин, 1975; В.И. Ким, 1991; И.А.
Косилов, 1995, 1999; П.К.Аракелян, 1997; В.М. Авилов и др., 1999; Н.А. Морозова, 2002;
К.С. Димов, 2008; А.С. Донченко с соавт., 2010 и др.). Изменение социальных и
экономических условий в стране привели к реструктуризации животноводства, в том числе
овцеводства и козоводства, к организации многочисленных мелких частных хозяйств, где все
половозрастные группы животных содержатся вместе, к их территориальной разобщенности.
Стало очень сложно эффективно осуществлять официально регламентированные
противобруцеллезные мероприятия, в частности, ежегодную иммунизацию животных против
бруцеллеза живыми агглютиногенными вакцинами, в том числе вакциной из штамма 19
традиционным подкожным методом. В этом случае на длительный срок сохраняются
поствакцинальные реакции, неподдающиеся дифференциации, препятствующие
возможности осуществлять эпизоотический контроль и выявление больных животных из неблагополучных отар (А.А. Иванов, 1996; А.Т. Рукин, 1998; В.М. Авилов с соавт., 1999; И.А. Косилов с соавт., 1999 и др.).
Проблема бруцеллеза крупного рогатого скота стоит в стране также достаточно остро. В целях эффективного управления эпизоотическим процессом важно использовать рациональные схемы специфической профилактики, ведущую роль в которых играют живые слабоагглютиногенные вакцины (И.А. Косилов с соавт., 1986;1999; С.К. Димов , 1993; А.С. Димова, 2003; А.С. Донченко с соавт., 2010 и др.). При этом реструктуризация животноводства создала сложности с диагностикой, в том числе с дифференциальной поствакцинальной, и у крупного рогатого скота.
В настоящее время в стране существует реальная угроза возникновения эпизоотических очагов бруцеллеза среди мелкого и крупного рогатого скота за счет заноса возбудителей болезни из неблагополучных регионов, в том числе близлежащих стран (Республика Монголия, Республика Казахстан).
С учетом изложенного, остро встал вопрос о необходимости пересмотра принципиальных подходов к контролю эпизоотического благополучия животных по бруцеллезу, в том числе к системе его специфической профилактики.
Еще большую актуальность приобрели методы диагностики, позволяющие не только выявлять среди оздоравливаемого поголовья максимальное число эпизоотически опасных животных, объективно осуществлять эпизоотический контроль в благополучных и угрожаемых стадах (отарах), но при этом обладающие способностью различать у животных, даже в ранние сроки после иммунизации против бруцеллеза, поствакцинальные реакции от постинфекционных.
Степень разработанности проблемы. В целях дифференциации больных бруцеллезом животных от здоровых, вакцинированных против указанной болезни, Cerwonogrodsky et al. (1988) разработал и изучил в реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) поли - В антиген (неочищенный препарат липополисахаридов бруцелл), в состав которого входил и О-ПС антиген ( О- цепь полисахаридов).
В.М. Чекишев с соавторами (1993) в этих же целях использовали в РИД высоко очищенный О-ПС антиген. Принципиальный механизм его дифференцирующих возможностей заключается в том, что у животных при их заражении вирулентными штаммами бруцелл происходит синтез специфических преципитирующих антител, а при сенсибилизации слабовирулентными штаммами, включая вакцинные, нет. Предложенный для широкой ветеринарной практики диагностикум (О-ПС А- антиген) готовят из штамма B. abortus 19. Его использование официально регламентировано при бруцеллезе как крупного, так и мелкого рогатого скота.
Однако, при бруцеллезе, происходит у мелкого рогатого скота происходит
бруцеллами вида melitensis, РИД с О-ПС А-антигеном оказалась недостаточно
чувствительной, что можно объяснить определенной гетерогенностью антигена по
отношению к возбудителю инфекции вида В. melitensis. Кроме того, у части здоровых овец
и коз, иммунизированных вакциной из агглютиногенного штамма B.abortus 19 подкожно, в
официально принятой дозе (40 млрд КОЕ/мл.), могут даже в отдаленный срок после
вакцинации (ревакцинации) наблюдаться положительные результаты РИД с указанным
диагностикумом по причине его гомогенного происхождения. Существует также проблема
недостаточной чувствительности известных методов диагностики, включая РИД с О-ПС
антигеном, в тех случаях, когда крупный рогатый скот заражается бруцеллами не только
вида abortus, но и melitensis, а мелкий рогатый скот- abortus (К.С. Димов, 2008 и др.). В этом
направлении проведены целенаправленные исследования, в результате которых для
использования в РИД по аналогичной методике был получен О-ПС М-антиген из
вакцинного штамма В. melitensis Rev-1, прошедший успешную экспериментальную и производственную проверку (П.К. Аракелян с соавт., 1995, 1996, 2007; Н.А. Морозова, 2002; К.С. Димов, 2008; П.К. Аракелян с соавт., 2010 и др.).
С учетом выше изложенного, очевидным является научный и практический интерес к сравнительному изучению диагностической эффективности О-ПС антигенов, изготовленных из штаммов различных видов бруцелл в РИД, при бруцеллезе животных, с целью использования полученных результатов в повышении их роли при оценке эпизоотического статуса стад (отар), в дифференциальной поствакцинальной диагностике, а также в максимальном выявлении эпизоотически опасных животных.
Цель и задачи исследования. Цель исследований - Сравнительное изучение диагностической эффективности в РИД О-ПС антигенов, изготовленных из штаммов различных видов бруцелл при бруцеллезе животных.
Для достижения указанной цели решались следующие задачи:
1. Изучить диагностическую эффективность О-ПС антигенов, изготовленных из
штаммов различных видов бруцелл, в РИД, в сравнении с РА и РСК, при естественном
бруцеллезе животных.
2. Изучить диагностическую эффективность РИД с О-ПС А - и М-антигенами, в
сравнении с РА и РСК, при естественной сенсибилизации овец бруцеллами вида melitensis с
целью выявления активных эпизоотических очагов и определения их эпидемической
значимости.
3. Изучить в сравнительном аспекте диагностическую эффективность РИД с О-ПС А-
и М-антигенами, РНГА, РА и РСК при бруцеллезе мелкого и крупного рогатого скота, в том
числе иммунизированного против указанной болезни по различным схемам, в разных
эпизоотических ситуациях.
4. Провести сравнительное изучение диагностической активности О-ПС А - и М-
антигенов с О-ПС-МА антигеном, представляющим разные соотношения механической
смеси этих антигенов в РИД на мелком и крупном рогатом скоте с естественным течением бруцеллеза.
Научная новизна. Впервые при естественном бруцеллезе у мелкого и крупного рогатого скота доказаны значительные диагностические преимущества в реакции иммунодиффузии (РИД) О-ПС М- и А-антигенов, изготовленных из аттенуированных вакцинных штаммов бруцелл, соответственно видов melitensis и abortus, в сравнении с вирулентными штаммами бруцелл этих же видов. При этом у животных, инфицированных гомологичными видами бруцелл, подтверждена их определенная видоспецифичность.
Впервые установлена диагностическая эффективность использования в РИД О-ПС МА-антигена, представляющего механическую смесь О-ПС М- и А- антигенов в разных соотношениях, оптимальным из которых признано 1:1. При этом дополнительно из общего числа реагирующих в РИД с тремя антигенами (М-, А- и МА-) МА-антиген выявлял при естественном бруцеллезе минимум в 2 раза больше инфицированного мелкого рогатого чем при исследовании крупного рогатого скота. На разработанный с учетом полученных результатов способ диагностики бруцеллеза животных в 2011году получен патент РФ на изобретение № 2417098.
Доказана возможность использования РИД с О-ПС А- и М-антигенами в сочетании с
другими диагностическими средствами на мелком рогатом скоте с естественным течением
бруцеллеза в целях объективной оценки активности эпизоотических очагов и их
эпидемической значимости, с особой ролью О-ПС М-антигена.
На большом поголовье мелкого и крупного рогатого скота при применении комплекса
диагностических тестов, включающих РБП, РНГА, РА и РСК, подтверждена ведущая роль
РИД на основе определенной видоспецифичности О-ПС М - и А-антигенов в качестве
индикатора степени эпизоотической опасности реагирующих животных(как при
естественном бруцеллезе, так и на фоне их иммунизации различными
противобруцеллезными вакцинами по разным схемам).
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований по комплексному изучению в РИД различных О-ПС антигенов в большинстве своем являются новыми и теоретически значимыми. Они в значительной степени расширяют научные представления об их роли в выявлении животных, обладающих наибольшей эпизоотической опасностью, даже в условиях широкого использования противобруцеллезных вакцин, а также в оценке активности эпизоотических очагов бруцеллеза и их эпидемической значимости и создают перспективу дальнейших исследований в этом направлении.
Очевидна и практическая значимость данной работы, результаты которой прежде всего открывают возможность широкого использования О-ПС А- и М- антигенов в объективной эпизоотологической оценке стад и отар животных по бруцеллезу, в том числе в условиях применения вакцин даже в ранние сроки после вакцинации, в выявлении особо опасных бруцеллоносителей, что в конечном итоге обеспечит повышение уровня осуществляемых в масштабах страны противобруцеллезных мероприятий. Имеет перспективу практического использования и О-ПС МА-антиген,способствующий более полному выявлению особо опасных бруцеллоносителей.
Методология и методы исследования. Объектами исследований явились экспериментальные препараты, сельскохозяйственные и лабораторные животные, биологический материал, культуры вирулентных и вакцинных бруцелл, питательные среды для культивирования бруцелл, методы диагностики бруцеллеза. Предмет исследований – научное обоснование, разработка и совершенствование методов диагностики бруцеллеза.
В работе использовали аналитический, эпизоотологический, серологический, иммунологический, бактериологический и биологический методы исследований.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Значительная диагностическая ценность в реакции иммунодиффузии (РИД) О-ПС М - и А-антигенов, изготовленных из аттенуированных вакцинных штаммов бруцелл,
соответственно видов melitensis и abortus, по сравнению с вирулентными штаммами бруцелл этих же видов при естественном бруцеллезе у мелкого и крупного рогатого скота.
2. Ообоснование возможности использования РИД с О-ПС А- и М-антигенами в сочетании с другими диагностическими средствами на мелком рогатом скоте с естественным течением бруцеллеза в целях объективной оценки активности эпизоотических очагов и их эпидемической значимости с особой ролью О-ПС М-антигена
3.Ведущая роль РИД в качестве индикатора степени эпизоотической опасности реагирующих животных как при естественном бруцеллезе, так и на фоне их иммунизации различными противобруцеллезными вакцинами по разным схемам, на основе определенной видоспецифичности О-ПС М- и А-антигенов.
4.Диагностическую эффективность использования при естественном бруцеллезе мелкого и крупного рогатого скота в РИД О-ПС МА-антигена, представляющего механическую смесь О-ПС М- и А- антигенов в соотношении 1:1.
Степень достоверности и апробация результатов.
Достоверность полученных показателей подтверждена использованием большого объема фактического материала и современных методик исследований, а ее степень в необходимых случаях оценена. Цифровой материал подвергался статистической обработке на персональном компьютере по критериям Стьюдента с использованием программы Microsoft Exel.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:
- Международной научно-практической конференции, посвященной памяти
выдающегося организатора Сибирской ветеринарной науки А.В. Копырина «Актуальные
проблемы инфекционных и незаразных патологий животных», Омск, 2010;
- Х Сибирской ветеринарной конференции посвященной международному году
ветеринарии «Актуальные вопросы ветеринарной медицины», (17-18 февраля), Новосибирск,
2011;
- Международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию
СибНИВИ-ВНИИБТЖ «Инфекционная патология животных», Омск, 2011;
- XII Сибирская ветеринарная конференция «Актуальные вопросы ветеринарной
медицины», Новосибирск, 2013;
- Международной научно-практической конференции «Современные проблемы
пастбищного животноводства в аридной зоне Центрально-Азиатского региона», г. Кызыл,
2015;
- заседаниях ученого совета ФГБНУ ВНИИБТЖ (2009 - 2016 гг.)
Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном совещании сотрудников ФГБНУ ВНИИБТЖ (2016 г.)
Личный вклад автора. Планирование и проведение большинства экспериментов и контролируемых производственных опытов (включая эпизоотологические обследования хозяйств, забор крови и другого биоматериала и др.), анализ всех полученных результатов в сопоставлении с изученными литературными данными, обобщение и оформление диссертационных материалов осуществлены автором лично.
Часть экспериментальных исследований была проведена совместно с Барабановой Е.Б., Бондаревой О.В., Власовой С.А., Разницыной Г.В.
Часть исследования по изучению диагностической эффективности РИД с О-ПС А- и
М-антигенами, РНГА, РА и РСК сывороток крови мелкого рогатого скота из
неблагополучных по бруцеллезу хозяйств с течением инфекции на фоне вакцинации против бруцеллеза вакциной из штамма 19 по различным схемам, в разных эпизоотических ситуациях была проведена совместно с Димовым К.С.
Внедрение результатов исследований. Результаты исследований послужили основой для включения ряда практических предложений в: методические положения «Концепция контроля рисков возникновения и распространения эпизоотических очагов
зооантропонозов» (протокол № 2 от 29 апреля 2011г.); «Концепция новых методов диагностики и специфической профилактики бруцеллеза животных» (протокол № 3 от 21 сентября 2011 г.), рассмотренные и утвержденные подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протоколы № 2 от 29 апреля 2011г. и № 3 от 21 сентября 2011 г. соответственно); «Рациональная схема использования РИД с О-ПС антигенами в дифференциальной диагностике бруцеллеза животных»(рассмотрена и утверждена подсекцией «Инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» Отделения сельскохозяйственных наук РАН, протокол № 2 от 14 октября 2015г.).
О-ПС А- и М-антигены были использованы в процессе практического осуществления противобруцеллезных мероприятий у животных в Омской области и Ставропольского края для объективной эпизоотической оценки стад и отар с 2008 по 2015 год.
Кроме того, в ряде регионов РФ был успешно внедрен конъюнктивальный метод иммунизации мелкого рогатого скота вакциной из штамма 19, схема практического применения которого предусматривает рациональную схему поствакцинальной диагностики бруцеллеза с использованием РИД с О-ПС М- и А-антигенов.
Публикации результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, списка литературы, списка иллюстративного материала и приложений. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 5 рисунками.
Диагностическое и дифференциально-диагностическое значение различных серологических методов при бруцеллезе животных, в том числе в связи с использованием различных схем специфической профилактики
Бактериологическое исследование основано на выделении культуры возбудителя бруцеллеза при посеве патологического материала от зараженного животного на искусственные питательные среды.
Материалом от животных для бактериологического посева обычно служат содержимое желудка, печень и селезенка абортированного плода. В отдельных случаях возникает необходимость проведения бактериологических исследований органов и лимфатических узлов от убитого животного. Обычно отбирают для этих целей 20-26 объектов.
Некоторые биовары В. abortus в первой генерации требуют повышенного (10%) содержания углекислого газа (СО2). Поэтому при исследовании материала от крупного рогатого скота половину засеянных пробирок агара выдерживают при атмосферном режиме, а вторую половину инкубируют при повышенной концентрации СО2.
Бруцеллы довольно чувствительны к условиям выращивания и не всегда могут вырасти на питательных средах. Поэтому отсутствие роста бруцелл не дает оснований для отрицательного заключения, т.е. для исключения бруцеллеза.
Чувствительность и специфичность бактериологического метода значительно повышается при использовании для индикации бруцелл в патологическом материале или в смешанных культурах таких методов, где взаимодействуют иммунологические реакции между антигеном и антителом или используются иные связи с антигеном микробного происхождения (М.А. Журнакова, 1959; Ш.А. Барамова и др., 1989; Б. Каральник и др., 1991; А.П. Кузьмиченок, В.И. Мельниченко, 1995; М.Ю. Шестопалов, 1996; К.В. Шумилов, О.Д. Скляров, Н.Л. Обухов и др., 1996; А.Л. Гинзбург, 1998 и др.). К такого рода методам относятся реакция иммунофлюоресценции в прямом и непрямом варианте (РИФ и РНИФ), реакция непрямой гемагглютинации с использованием антительного диагностикума (РНГА), которую еще называют реакцией нейтрализации антител (РНАт); иммуноферментный анализ (ИФА), ДНК-ДНК гибридизация, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и другие методы генной диагностики. Биологический метод
Этот метод индикации возбудителя бруцеллеза в исследуемом материале наиболее чувствительный и надежный. Положительный диагноз на бруцеллез ставится как в случае выделения культуры от животного, зараженного патологическим материалом, так и при выявлении у него в сыворотке крови противобруцеллезных антител. Этот метод имеет особую ценность при необходимости получения чистой культуры возбудителя в случае загрязнения материала посторонней микрофлорой.
Из лабораторных животных, которых используют для биопробы, наиболее восприимчивы морские свинки. Посевы делают из участков печени, селезенки, матки, а также из костного мозга и лимфатических узлов (подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, паховые, тазовые, парааортальные, гипогастральные). Выделенные культуры идентифицируют по общепринятой методике (И.А. Косилов и др., 1999; Наставление по диагностике бруцеллеза животных, 2004; Н.П. Иванов, 2007; и др.). Серологический метод
Серологическая диагностика инфекционных болезней, в том числе бруцеллеза, основывается на иммунологических реакциях. В отличие от клеточных реакций, с помощью гуморальных тестов представляется возможность с большей достоверностью производить не только качественные, но и количественные измерения, что достигается применением широкого набора серологических тестов.
Основными методами, используемыми при серологической диагностике бруцеллеза являются роз - бенгал проба (РБП), реакция агглютинации (РА), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), реакция связывания комплемента (РСК), кольцевая реакция (КР), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция иммунодиффузии с олиго-полисахаридным антигеном в агаровом геле (РИД с О-ПС антигеном).
Роз бенгал проба (РБП). При диагностике бруцеллеза в качестве экспресс метода на не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами животных
используется роз бенгал проба. Впервые этот тест предложен P. Nicoletti в
1967 году. В основе этой реакции лежит непосредственное соединение антигена и антитела. Работами многих исследователей (С.Х. Боциева, 1979; Л.В. Дегтяренко и др., 1978; С.Е. Сайдашева, 1980; П.С. Уласевич, 1981; М.И. Чернышова и др., 1982; И.Н. Каликин, 2012; M.A. Abeledo, 1979, 1982; Bednivic et al., 1981; B. Cunningham et al., 1978; O. Erganis, 2005; M.F. Geral et al., 1975; J.F. Gomes et al., 1978; F.C. Heck et al., 1979; W.J. Morgan et al., 1969; P. Nicoletti, 1967; O Reilli et al., 1972; Pilet Ch. Et al., 1972; E. Scheibner et al., 1977; L. Tablida et al., 1979; D. Trap et al., 1976) установлено, что РБП является специфичным и чувствительным методом, с помощью которого можно получить быстрый ответ. Положительные результаты этой реакции, как правило, совпадают с выделением культур бруцелл. По данным ряда авторов РБП по своим диагностическим свойствам вполне может заменить РА (М.М. Иванов, 1975; Е.С. Орлов с соавт., 1976; М.С. Абиджанов с соавтр., 1980; П.С Уласевич с соавт., 1981; W. Morgan et all., 1969; A. Contini et all.,1973; D.Trap and A. Gaumont, 1976; R. Fensterbank and M. Moquere, 1978; A. Shimi and A. Tabatabayi, 1981; D. Trap and R. Gaumont, 1976).
Заключение по обзору литературы
Сравнивая приведенные выше общие показатели, (по всем пяти эпизоотических очагам, по двум эпизоотическим очагам сельхозпредприятий и трем эпизоотическим очагам личных подсобных хозяйств), какие либо однозначные выводы сделать сложно.
Однако, результаты оценки каждого эпизоотического очага на основе приведенных в таблицах 3 и 4 показателей как внутри своей категории (сельхозпредприятие, личное подсобное хозяйство), так и между ними вызывают определенный научный и практический интерес.
Так, в категории «Сельхозпредприятия» в эпизоотическом очаге №1 (таблица 3) из 843 исследованных проб сывороток крови овец на бруцеллез положительная РИД с обоими О-ПС антигенами была отмечена в 69 пробах (8,2% из числа исследованных), из них в 12 пробах - только с О-ПС М-антигеном (17,4% от общего числа реагирующих в РИД с обоими антигенами). В 63 пробах из 69 (91,3%) положительная РИД совпала с высокими титрами РА и РСК. Дополнительно к 69 пробам с положительной РИД выявлено 28 проб с положительными РА и РСК в высоких титрах (40,6%). В указанном эпизоотическом очаге из 6 людей, контактировавших с овцами заболело острым бруцеллезом 4 человека (66,7%).
В эпизоотическом очаге №2 вышеуказанной категории из 104 исследованных проб сывороток крови овец на бруцеллез положительная РИД с О-ПС антигенами была отмечена в 27 пробах (25,9% от числа исследованных), из них в 8 пробах - только с О-ПС М-антигеном (29,6% от общего числа реагирующих в РИД с обоими антигенами). В 24 пробах из 27 (88,9%) РИД совпала с высокими титрами РА и РСК. Дополнительно к 27 пробам с положительной РИД выявлено 7 проб (25,9%) с положительными РА и РСК в высоких титрах. В указанном эпизоотическом очаге из трех людей, контактировавших с овцами, заболело острым бруцеллезом два человека (66,7%).
Сравнивая выше приведенные показатели по двум эпизоотическим очагам бруцеллеза мелкого рогатого скота из категории «сельхозпредприятия», следует отметить следующий принципиальный момент: заболеваемость острым бруцеллезом людей, контактировавших с овцами неблагополучных отар в обоих эпизоотических очагах оказалась одинаковой - 66,7%. При этом положительная РИД (общеизвестная, как объективный показатель эпизоотической опасности животных) в эпизоотическом очаге №1 была зарегистрирована у 8,2% исследованных животных, а в эпизоотическом очаге №2 - у 25,9% (выявлено в 3,2 раза больше больных животных). Количество же животных, реагировавших в РИД только с М-антигеном, в эпизоотическом очаге №2 было больше, чем в эпизоотическом очаге №1, лишью в 1,7 раза. Иными словами, можно предположить, что одинаковую эпидемическую значимость этих двух эпизоотических очагов обусловили показатели не общего реагирования в РИД с О-ПС антигенами, а реагирования в РИД с О-ПС М-антигеном. Последние показатели, по сравнению с первыми, отличались в данных эпизоотических очагах незначительно.
В категории «Личные подсобные хозяйства» (таблица 4) в эпизоотическом очаге №1 из 87 исследованных проб сывороток крови овец на бруцеллез положительная РИД с О-ПС антигенами была отмечена в 15 пробах (17,2% из числа исследованных), из них в 4 пробах - только с О-ПС М-антигеном (26,7% от общего числа реагирующих в РИД с обоими антигенами). В 100% случаев положительная РИД совпала с высокими титрами РА и РСК. Дополнительно к 15 пробам с положительной РИД выявлено 23 пробы с положительными результатами РА и РСК в высоких титрах (153,3%). В указанном эпизоотическом очаге, из 4 людей, контактировавших с овцами, заболели острым бруцеллезом все четверо (100 %).
В эпизоотическом очаге №2 вышеуказанной категории из 14 исследованных проб сывороток крови овец на бруцеллез положительная РИД с О-ПС антигенами была отмечена в 12 (85,7%); в том числе только с О-ПС М-антигеном положительных результатов не отмечено ни в одной пробе. В 10 пробах из 12 (83,3%) положительная РИД совпала с высокими титрами РА и РСК. Дополнительно к 12 пробам с положительной РИД выявлено 2 пробы с положительными результатами РА и РСК в высоких титрах (16,7%). В указанном эпизоотическом очаге из 2 людей, контактировавших с овцами, заболел острым бруцеллезом 1 человек (50,0%).
В эпизоотическом очаге №3 этой же категории из 11 исследованных проб сывороток крови овец на бруцеллез положительная РИД с О-ПС антигенами была отмечена в 2 (18,2%), в том числе только с О-ПС М-антигеном положительных результатов не отмечено ни в одной пробе. В 100% РИД совпала с высокими титрами РА и РСК. Из 2 человек, контактировавших с овцами в указанном эпизоотическом очаге, бруцеллезом не заболел ни один.
Приведенные в таблице 4 показатели по 3 эпизоотическим очагам бруцеллеза мелкого рогатого скота из категории «личные подсобные хозяйства», можно прокомментировать следующим образом. Заболеваемость острым бруцеллезом людей, контактировавших с овцами неблагополучных отар, зарегистрирована в 2 эпизоотических очагах из 3. В эпизоотическом очаге №3 заболели острым бруцеллезом 100 % людей, контактировавших с овцами. При этом, как и в эпизоотических очагах №1 и №2 из категории «сельхозпредприятия» (таблица 3), можно предполагать, что эпидемическую значимость этого эпизоотического очага также обусловил, прежде всего, показатель реагирования в РИД с О-ПС М антигеном. Что касается 100 % заболеваемости контактировавших лиц, то это можно объяснить более тесными контактами в личных подсобных хозяйствах. В эпизоотическом очаге №2 заболели острым бруцеллезом 50,0 % лиц, контактировавших с овцами. Эпидемическую значимость данного эпизоотического очага обусловил на наш взгляд, высокий общий показатель реагирования в РИД (83,3%).
По сравнению с эпизоотическим очагом №3 (100 %), 50% заболеваемость контактировавших лиц с овцами в данном эпизоотическом очаге можно объяснить отсутствием РИД только с О-ПС М-антигеном. В эпизоотическом очаге №5 два человека, контактировавших с овцами, бруцеллезом не заболели. Это можно объяснить низким уровнем общего реагирования овец в РИД и отсутствием положительной РИД только с О-ПС М-антигеном.
Таким образом, обобщая результаты проведенных исследований, следует отметить, что доказана эффективность использования РИД с О-ПС А- и М-антигенов в сочетании с другими диагностическими средствами на мелком рогатом скоте с целью выявления активных эпизоотических очагов и определения их эпидемической значимости. При этом особая роль принадлежит О-ПС М-антигену, так как наличие у животных неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота отар положительной РИД только с О-ПС М-антигеном совпадает с высокой заболеваемостью острым бруцеллезом людей, контактировавших с животными таких отар. Высокий уровень реагирования в РИД с О-ПС антигенами при отсутствии положительной РИД только с О-ПС М-антигеном также может обуславливать заболеваемость острым бруцеллезом людей, контактировавших с животными таких отар. Способствовать более высокой заболеваемости людей могут более тесные контакты с овцами неблагополучных отар. В личных подсобных хозяйствах такие контакты более тесные.
Изучение диагностической эффективности РИД с О-ПС антигенами, изготовленными из различных видов и штаммов бруцелл, в сравнении с РА и РСК при естественном бруцеллезе животных
Нами была предпринята попытка определить в РИД оптимальное соотношение частей О-ПС-М и О-ПС А- антигенов при их механическом смешивании для приготовления О-ПС МА-антигена. Для опыта использовали следующие соотношения О-ПС М-антигена и О-ПС А-антигена - 2:1, 1:2, 1:1.
Предварительно 300 проб сыворотки крови от интактного крупного и мелкого рогатого скота (100 и 200 проб соответственно) исследовали в РА, РСК и РИД с О-ПС антигенами в соотношениях М:А - 2:1, 1:2, 1:1, где были получены отрицательные результаты.
Затем исследование по изучению антигенов продолжили на сыворотках крови от этих же видов животных, но с естественным течением инфекции. Из реагирующих на бруцеллез в РА и РСК животных сформировали по две группы для определения оптимального соотношения частей антигенов и изучения их чувствительности.
Результаты исследований, приведенные в таблице № 13 и рисунок 2 показывают, что у мелкого рогатого скота в 1 группе из 36 исследованных проб сывороток крови в РИД всего реагировала 31 проба (86,1%), во 2 группе - из 48 исследованных проб - 20 (41,7%).
В РИД с помощью О-ПС-М-антигена в 1 группе выявлено 28 реагирующих (90,3%), во 2 группе - 12 (60%). С помощью О-ПС-А - антигена в 1 группе выявлено 20 реагирующих проб (64,5%), во 2 группе - 8 (40,0%). С помощью О-ПС МА-антигена при соотношении частей О-ПС М- и А- антигена 1:2 в 1 группе выявлено 18 реагирующих проб (58,0%), во 2 группе - 7 (35,0%) от общего числа проб, реагирующих в РИД. С помощью О-ПС МА-антигена при соотношении частей О-ПС М- и А- антигена 2:1 в 1 группе выявлена 31 реагирующая проба (100%), во 2 группе - 19 (95,0%). С помощью О-ПС МА антигена при соотношении частей О-ПС М- и А- антигена 1:1 в 1 группе выявлена 31 реагирующая проба (100%), во 2 группе - 20 (100%). Достоверность составила 99,9%. Таблица 13. Исследования сывороток крови от мелкого рогатого скота в РИД при соотношениях частей О-ПС М:А- антигенов - 2:1 , 1:2, 1: Груп пы Кол-вореагирующихживотныхв РА, РСК Реагировало в РИД всего М А М:А 2:1 1 1:2 1:1 гол % гол % гол % гол % гол % гол % 1 36 31 86,1 28 90,3 20 64,5 31 100±0,2 18 58,0±8,9 31 100±0,2 2 48 20 41,7 12 60,0 8 40,0 19 95,0±4,9 7 35,0±10,7 20 100±0,2 всего 84 51 60,7 40 78,4 28 54,9 50 98,0±2,0 25 49,0±6,9 51 100±0,2 Примечание: % от числа реагирующих в РА и РСК, % от числа реагирующих в РИД; Р0,001
При исследовании сывороток крупного рогатого скота (таблица 14 и рисунок 3) в 1 группе из 9 исследованных проб в РИД реагировало 5 (55,6%), во 2 группе из 21 исследованной пробы - 15 (71,4 %). Из общего числа реагирующих в РИД с помощью О-ПС М – антигена в 1 группе выявлены 4 реагирующие пробы(80,0%), во 2 группе - 12 (80,0%); с помощью О-ПС А -антигена в 1 группе выявлены 4 реагирующие пробы (80,0%), во 2 группе - 14 (93,3%); с помощью О-ПС МА – антигена, при соотношении частей М- и А-антигенов 2:1 в 1 группе - 3 (60,0%), во 2 группе - 13 (86,7%); при соотношении частей М- и А антигенов 1:2 в 1 группе -4 (80,0%), во 2 группе - 14 (93,3%); при соотношении частей М- и А- антигенов 1:1 в 1 группе - 5 (100% ), во 2 группе - 14 (93,3 %). 100 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 О
Результаты исследований сывороток крови от мелкого рогатого скота в РИД при соотношениях частей антигенов М:А - 2:1 , 1:2, 1:1 Таким образом, исследования показали, что оптимальное соотношение частей О-ПС М- и О-ПС А - антигенов при их механическом смешивании является 1:1, так как выявляет максимальное количество (от 90 до 100%) инфицированных животных, выявленных при исследовании сывороток крови в РИД с О-ПС М- и А-антигенами.
Изучение специфичности и чувствительности наиболее эффективного варианта МА- антигена в сравнении с М- и А-антигенами проводили при исследовании сывороток крови от поголовья мелкого и крупного рогатого скота, свободного от бруцеллеза (без вакцинации), а также неблагополучного(с естественным течением инфекции). Из 521 пробы сывороток крови мелкого рогатого скота и 201 пробы сывороток крови крупного рогатого скота из 6 благополучных по бруцеллезу хозяйств реагирующих на бруцеллез, в том числе в РИД с О-ПС А-, М- и МА-антигенами не выявлено. Дальнейшие исследования проводили на неблагополучном поголовье крупного и мелкого рогатого скота с естественным течением инфекции. Из шести отар овец из числа реагирующих на бруцеллез РА и РСК сформировали шесть групп животных(305 гол.). Из таблицы 15 и рис. 4 видно, что из 305 реагирующих в РА и РСК проб выявлено всего реагирующих в РИД 182 пробы (59,7%). Из 182 реагирующих в РИД проб с помощью О-ПС М- антигена выявлено 158 (86,8 %) , О-ПС А-антигена -114 (62,6 %), О-ПС -МА-антигена -182 (100%). Проведенные исследования показывают, что О-ПС-МА-антиген дополнительно выявляет в среднем до 13,0% животных, а по отдельным группам от 4,0 до 40,0%. Бактериологические исследования биоматериала, взятого от трех животных, реагирующих на О-ПС МА-антиген, подтвердили носительство возбудителя бруцеллеза.
Сравнительное изучение диагностической активности РИД с О-ПС А антигеном, изготовленным из штамма B. аbortus 19 и с О-ПС M-антигеном, изготовленным из штамма B. melitensis Rev-1, а также О-ПС М:А– антигеном, представляющим механическую смесь А- и М- антигенов в разных соотношениях, на мелком и крупном рогатом скоте с естественным течением бруцеллеза
Имеющиеся данные подтолкнули нас на попытку создания «универсального» антигена, способного выявлять инфицированных вирулентными бруцеллами животных среди мелкого и крупного рогатого скота. Первоначально была предпринята попытка определить в РИД оптимальное соотношение частей антигенов при механическом смешивании: О-ПС М- и О-ПС А- антигенов. Для опыта использовали соотношения М:А- 2:1, 1:2, 1:1. Предварительно сыворотки крови от интактного крупного и мелкого рогатого скота исследовали в РА, РСК и РИД с О-ПС антигенами в соотношениях М:А- 2:1, 1:2, 1:1, где были получены отрицательные результаты.
Затем исследование по изучению антигенов продолжили на сыворотках крови от этих же видов животных, но с естественным течением инфекции. Смесь О-ПС антигена М:А- в соотношении 1:1 показала наилучший результат выявляя до 100% инфицированных бруцеллезом животных, что было подтверждено бактериологически. Полученный антиген стали именовать, как МА- антиген.
Изучение специфичности и чувствительности полученного варианта МА-антигена в сравнительном аспекте проводили на неблагополучном по бруцеллезу поголовье мелкого и крупного рогатого скота с естественным течением инфекции.
Из шести отар реагирующих на бруцеллез в реакциях РА, РСК было сформировано шесть групп животных.
Проведенные исследования показали, что О-ПС МА-антиген у мелкого рогатого скота дополнительно выявлял до 13%, а по отдельным группам от 4 до 40% инфицированных животных. В дальнейшем исследования проводили в 5 стадах крупного рогатого скота с естественным течением инфекции. Из реагирующих на бруцеллез в реакциях РА (реакция агглютинации) и РСК (реакция связывания комплемента) сформировали соответственно пять групп животных.
В 5 группах животных из числа реагирующих в РА и РСК (всего - 125 гол.), всего выявлено реагирующих в РИД - 45 (36,0%) в том числе с помощью О-ПС М- антигена – 37 ( 82,2 % от общего числа реагирующих в РИД), с помощью О-ПС А-антигена - 42 (93,3 % от общего числа реагирующих в РИД), с помощью О-ПС МА- антигена - 42 т.е. (93,3% от общего числа реагирующих в РИД). При этом у трех животных отметили РИД только с А- антигеном, а у трех – только с МА- антигеном. Показания МА– антигена с показаниями А- и М- антигеном совпали в в 93,3 % случаев, дополнительно выявив 6,7 % из общего числа выявленных в РИД тремя антигенами. Бактериологические исследования биоматериала, взятого от двух животных, реагирующих на О-ПС МА- антиген, подтвердили носительство возбудителя бруцеллеза. Полученные результаты также являются новыми и на этот счет в доступной нам литературе мы каких-либо сведений не нашли. Таким образом, обобщая материалы данного раздела диссертации, следует отметить, что нами в сравнительном аспекте изучена диагностическая эффективность О-ПС антигенов, изготовленных из разных видов бруцелл в РИД при бруцеллезе животных.
Установлено, что диагностическая эффективность О-ПС антигенов от степени вирулентности штаммов бруцелл различных видов, из которых их готовили, не зависила, а была наиболее эффективной у О-ПС антигенов, изготовленных из аттенуированных вакцинных штаммов бруцелл видов abortus и melitensis, проявляя определенную видоспецифичность при выявлении животных инфицированных различными видами возбудителя.
Доказана ведущая роль А- и М- антигенов в сочетании с другими диагностическими реакциями в оценке активности эпизоотических очагов и их эпидемической значимости. Положительная РИД с М- антигеном у овец совпадала с высокой заболеваемостью людей, контактировавших с этими животными.
Результаты исследований показали, что РИД с О-ПС М- и А антигенами, совпадая с показаниями РБП, РНГА РА, РСК в разных сочетаниях у крупного и мелкого рогатого скота, в диагностическом отношении в значительной степени уступает указанному комплексу. Однако положительная РИД выступает в качестве объективного индикатора степени эпизоотической опасности того или иного стада и обладает дифференцирующими возможностями в условиях вакцинации.
Предложенный О-ПС МА- антиген повышает точность и достоверность диагностики бруцеллеза как мелкого рогатого скота, так и крупного рогатого скота от 90,0 до 100% по сравнению с известными О-ПС А- и М- антигенами. Эпизоотическая опасность выявленных животных данным антигеном подтверждена бактериологически.