Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Некробактериоз животных и его распространение 11
1.1.1. Этиология 11
1.1.2. Эпизоотологические данные 12
1.1.3. Патогенез и лечение 13
1.1.4. Профилактика и меры борьбы 20
1.1.5. Вакцины против некробактериоза 22
1.2. Сибирская язва 23
1.2.1. Особенности эпизоотологии и эпидемиологии сибирской язвы в современных условиях 23
1.2.2. Восприимчивость животных и людей к сибирской язве 25
1.2.3. Вакцины против сибирской язвы 28
1.3.Изготовление ассоциированных вакцин , анализ их технологий, компоненты вакцин 30
1.3.1. Питательные среды, используемые для культивирования бактерий. 30
1.3.2. Культивирование микроорганизмов 35
1.3.3. Адъюванты, применяемые при конструировании вакцин, действие на иммуногенез. 41
1.4. Заключение по обзору литературы 47
2. Собственные исследования 49
2.1. Методология и методы исследования 49
2.2. Анализ традиционных технологий изготовления вакцин . 53
2.3. Оптимизация технологических этапов производства ассоциированной вакцины против сибирской язвы и некробактериоза животных 55
2.3.1. Разработка эффективной питательной среды для культивирования противонекробактериозного компонента з
2.3.2 Оптимизация состава масляного адъюванта для ассоциированной вакцины 60
2.4. Изготовление опытных серий вакцины 63
2.4.1. Изготовление противосибиреязвенного компонента вакцины 63
2.4.2. Изготовление противонекробактериозного компонента вакцины 67
2.4.3. Приготовление масляного адъюванта 70
2.4.4. Объединение компонентов вакцины 70
2.5. Доклинические исследования ассоциированной вакцины 71
2.6. Разработка аппаратурно-технологической схемы получения ассоциированной вакцины 74
2.7. Клинические испытания ассоциированной вакцины 94
2.8. Экономический эффект от внедрения разработанной технологии промышленного производства ассоциированной вакцины 97
3. Заключение 100
4. Список сокращений 107
5. Список литературы 109
- Патогенез и лечение
- Анализ традиционных технологий изготовления вакцин
- Разработка эффективной питательной среды для культивирования противонекробактериозного компонента
- Клинические испытания ассоциированной вакцины
Введение к работе
Актуальность работы. В животноводстве Российской Федерации
благополучие по многим инфекционным болезням вирусной и бактериальной этиологии достигается профилактической вакцинацией восприимчивого поголовья. Важное место в инфекционной патологии животных занимают болезни, общие для нескольких видов. К возбудителям таких болезней относятся В. anthracis и F. necrophorum. Сибирская язва в виде спорадических случаев и реже эпизоотий регистрируется на территории РФ и граничащих с ней странах. В связи с тем, что не все почвенные очаги этой инфекции учтены и чрезвычайно трудно поддаются обеззараживанию, они представляют постоянную угрозу для животных и человека. Спорадическое возникновение болезни возможно в северных регионах страны, где раньше наблюдались эпизоотии сибирской язвы среди оленей. Это обусловлено способностью В. anthracis сохранять свою жизнеспособность и патогенность (И.А. Бакулов и др., 1996; В.А. Ведерников и др., 1996; К.А. Лайшев, В.А. Забродин, 2000).
Некробактериоз животных широко распространен и регистрируется во всех
странах мира с развитым скотоводством. Это, главным образом, связано с тем, что
местом естественного обитания F. necrophorum является желудочно-кишечный тракт
клинически здоровых и больных животных, который служит источником
некробактериозной инфекции. В России около 7% крупного и 16% мелкого рогатого скота, а также оленей, ежегодно болеют некробактериозом (О.И. Соломаха, Л.В. Кириллов, 2001). У крупного рогатого скота это заболевание протекает чаще в копытной форме. Весьма значительный экономический ущерб при некробактериозе связан, в основном, со снижением привесов и продуктивности, а также с расходами на преждевременную выбраковку, содержание, лечение больных животных и на проведение общего комплекса оздоровительных и профилактических мероприятий (Ю.Д. Караваев и др., 1997; А.А. Сидорчук и др., 2002).
Наличие этих инфекций является сдерживающим фактором развития
продуктивного животноводства и оленеводства (Ю.Д. Караваев и др., 1997; А.А. Сидорчук и др., 2002).В связи с тем, что сибирская язва и некробактериоз наносят значительный экономический ущерб, а сибирская язва имеет социальное значение, создание эффективной ассоциированной вакцины против этих инфекций является актуальной задачей.
Научно обоснованное решение проблемы создания и внедрения
промышленной технологии производства ассоциированной вакцины позволит решить проблему профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных.
Степень разработанности проблемы. В настоящее время для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных в России, в основном, применяют моновакцины, одну из которых изготавливают на основе высокоиммуногенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы, другую - из инактивированных культур вирулентных штаммов Fusobacterium necrophornm (Покровский биозавод, Орловская биофабрика). В некоторых регионах РФ
регистрируются случаи возникновения некробактериоза в стационарно
неблагополучных по сибирской язве зонах. На территории Архангельской области и Республики Коми зарегистрировано более 100 случаев, на Ямале более 60, на Таймыре около 40, в Якутии более 200, большое количество их было и в других северных регионах.
Ранее разработанные ассоциированные вакцины против сибирской язвы и некробактериоза остались на уровне лабораторных технологий и опытно-промышленных серий (патенты RU 2191599, 2480237 и др.).
Поэтому задача создания эффективной ассоциированной вакцины против этих инфекций является актуальной.
Цель и задачи исследований. Цель работы – разработать технологию производства новой ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных и оценить ее эффективность.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
- провести анализ традиционных технологий промышленного изготовления
вакцин для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных;
- научно обосновать и разработать схемы технологических процессов
изготовления ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и
некробактериоза животных;
- оптимизировать параметры технологических процессов производства
противонекробактериозного компонента вакцины;
- оптимизировать технологические этапы производства ассоциированной
вакцины;
- изготовить опытные серии ассоциированной вакцины и провести
доклинические исследования;
- изготовить опытно-промышленные образцы ассоциированной вакцины и
провести клинические испытания на животных;
- разработать нормативную документацию и организовать серийное
производство новой ассоциированной вакцины.
Научная новизна работы. Научно обоснована и разработана промышленная технология производства новой ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза.
Определен оптимальный состав питательной среды для культивирования штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, что позволило интенсифицировать процессы выращивания указанных микроорганизмов, повысить жизнеспособность и уровень их накопления.
Оптимизированы технологические этапы производства ассоциированной вакцины.
Определен эффективный адъювант для ассоциированной вакцины.
Определены показатели качества нового препарата и их значения.
Проведено масштабирование технологии производства ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных.
В клинических испытаниях показана эффективность нового препарата. Новизна способа получения ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных защищена патентом РФ №2524430.
Теоретическая и практическая значимость исследований. Разработанная технология обеспечивает получение новой ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных, эффективность которой подтверждена на животных.
Прогнозируемая чистая прибыль по итогам годовых продаж ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных составит 1380,27 тыс. руб., а рентабельность продукции составит 13,1%.(в ценах 2014г.).
Определены требования к качеству ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных.
Внедрена в производство «Система обеспечения качества» ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных в соответствии с требованиями стандартов ГОСТ ИСО 9001-2011, Правил GLP (ГОСТ 318834-2012), GMP (ГОСТ Р 52249-2009).
Эффективность ассоциированной вакцины проверена в производственных испытаниях на ограниченном поголовье северных оленей (860 голов) в ПСК «Оленевод» (г. Воркута), СПК (Фактория) «Томпо» Томпского района Республика Саха (Якутия). Комплексный подход к профилактике и лечению животных против сибирской язвы и некробактериоза позволяет снизить заболеваемость и падеж оленей в 4-6 раз, повысить результаты терапии до 97-100%.
Разработаны и утверждены в установленном порядке нормативные документы на производство, контроль и применение ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных.
Методология и методы исследования.
Объекты исследований. При исследовании и разработке технологических процессов и этапов производства вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных использовали производственные штаммы Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ, Bac. Antracis 55-ВНИИВВиМ, для контрольного заражения – штамм Bac. Antracis М-71 - второй вакцины Цепковского против сибирской язвы.
Материалы и животные. Масляный адъювант, эмульгаторы 394 (1) и 139, минеральное масло «Маркол», перевар Хоттингера, печеночный экстракт, пептон, дрожжевой автолизат, морские свинки, кролики, белые мыши, северные олени, крупно рогатого скота.
Технологическое оборудование. Культуры микроорганизмов выращивали в пробирках, флаконах и бутылях, а также в ферментерах АНКУМ-2М емкостью 10 дм3 и «BioFlo Pro» емкостью 100 дм3, которые оснащены системами автоматического контроля и регулирования основных параметров культивирования (температура, рН, рО2, еН, расход воздуха на аэрацию, скорость вращения мешалки и оптическая плотность бактериальной суспензии).
Отделение бактериальной массы от культуральной жидкости, содержащей экзотоксин, его очистку и концентрирование проводили на установке «Сартокон-мини» («Владисарт», г. Владимир, мембраны «Ультрасарт» на основе полисульфона с порогом задержания 300 кДа), ультрафильтрационной установке УПЛ–0,6 с полыми волокнами (материал мембраны – фенилон), размер пор – 0,22 мкм и нутч-фильтрах.
Методы доклинических исследований (ДИ). В ДИ определяли:
микробиологическую чистоту, безвредность и иммуногенность вакцины; остаточную вирулентность и капсулообразование противосибиреязвенного компонента вакцины; стабильность вакцины при хранении с учетом требований ГОСТ Р 54063-2010.
Определение микробиологической чистоты вакцины, капсулообразования и остаточной вирулентности противосибиреязвенного компонента проводили согласно ГОСТ Р 52616-2006 «Вакцина против сибирской язвы животных из штамма 55-ВНИИВВиМ живая. Технические условия».
Иммуногенную активность противосибиреязвенного компонента вакцин определяли на морских свинках по результатам контрольного заражения вакцинированных животных. Морским свинкам массой 350-400 г подкожно в область живота вводили по 0,1 см3 (25 млн. спор) и 0,2 см3 (50 млн. спор) вакцины. На каждую дозу использовали по 10 морских свинок, 10 интактных морских свинок данной партии животных оставляли в качестве контрольных. Через 14 суток после вакцинации по 10 животных из числа вакцинированных каждой иммунизирующей дозой вакцины и 10 интактных морских свинок подвергали контрольному заражению штаммом второй вакцины Цепковского М-71 в дозе 1 млн. жизнеспособных спор путем введения подкожно в область живота по 0,5 см3. За зараженными животными вели наблюдение в течение 10 дней.
Специфичность гибели вакцинированных и интактных животных определяли
микроскопически (просмотром окрашенных по Граму и синькой Лёффлера мазков –
отпечатков из паренхиматозных органов павших морских свинок) и
бактериологически (выделением культуры заражающего штамма М-71 путем посева патологического материала от морских свинок на питательную среду МПА).
Определение иммуногенной активности противонекробактериозного
компонента вакцины проводили в реакции агглютинации некробактериозного антигена с разными разведениями сывороток от трёх кроликов, иммунизированных дважды подкожно в дозе 1 см3 с интервалом 14 суток, кровь от кроликов для изготовления сывороток брали через 30 суток после последней инъекции вакцины.
Реакцию РА ставили в пробирках в объёме 1 при разведении испытуемых сывороток от 1:16 до 1:4096.
Постановку реакции сопровождали следующими контролями:
- с нормальной (отрицательной) сывороткой, не содержащей специфических
антинекробактериозных антител, в тех же разведениях;
- с заведомо уже исследованной положительной сывороткой, содержащей
специфические антинекробактериозные антитела, в тех же разведениях;
- контроль антигена (антиген + 9%-ный раствор натрия хлорида).
Во все пробирки пипеткой вносили по 0,05 см3 некробактериозного антигена, встряхивали реагенты до образования лёгкой опалесценции, выдерживали при температуре 37±1С в течение 5±1 часов, затем при комнатной температуре 21±1С в течение 19±1 часов. Учет результатов РА проводили через сутки после постановки.
Титром сыворотки считали её конечное разведение, при котором происходит агглютинация фузобактерий, оцениваемая в три или четыре креста.
Ассоциированную эмульсионную вакцину проверяют на стабильность эмульсии путем центрифугирования в пробирках в течение 30 минут при 3000 об./мин. Отсутствие расслоения свидетельствуют об её стабильности.
Клинические испытания. Иммуногенность опытно-промышленных серий вакцины и устойчивость животных (северных оленей) к заражению сибирской язвой и некробактериозом определяли в животноводческих хозяйствах Республики Саха (Якутия).
Степень достоверности и апробация результатов. Для оптимизации технологических этапов производства ассоциированной вакцины использовали методы математического планирования ПФЭ 2n и метод Гаусса – Зайделя. Расчеты и построение технологических графиков осуществляли с помощью пакета MICROSOFT OFFICE EXCEL 2010, построение технологических и аппаратурных схем – с помощью программы Microsoft Office VISIO 2010. В работе использовали общепринятые методы статистической обработки результатов (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962).
Достоверность результатов исследований подтверждается соответствием
теоретических данных с полученными результатами экспериментальных
исследований и производственных испытаний. Экспериментальные данные, выводы и рекомендации основаны на общепринятых теоретических закономерностях, не противоречат и с достаточной степенью точности согласуются с известными концепциями, апробированы и подтверждены в промышленных условиях.
Основные материалы диссертации вошли в инновационную программу ФГБНУ
ВНИТИБП «Разработка вакцины для профилактики сибирской язвы и
некробактериоза животных и способ её получения», доложены и обсуждены в виде
ежегодных отчетов по темам госзаданий на Ученом совете и методической комиссии
ВНИТИБП (2012-2015 гг.), на четырех Международных конференциях,
проводившихся в Щелково, Екатеринбурге, Витебске (2014-2015 гг.).
Структурно-методологическая схема достижения цели диссертационной работы представлена на рисунке 1.
Рис.1. Структурно-методологическая схема достижения цели диссертационной работы.
Положения диссертации, выносимые на защиту:
- Технология производства новой ассоциированной вакцины для профилактики
сибирской язвы и некробактериоза животных.
- Оптимизация технологических этапов производства ассоциированной вакцины.
- Доклинические исследования и показатели качества новой вакцины.
- Эффективность применения опытно-промышленных серий ассоциированной
вакцины в Республике Саха (Якутия).
Соответствие диссертации паспорту научной специальности Результаты научных исследований соответствуют пунктам 2, 3, 4 и 11 паспорта специальности 03.01.06 и пунктам 2, 8 и 9 паспорта специальности 06.02.02.
Личный вклад автора заключается в формулировании и разработке основных положений диссертации, постановке целей и задач исследований, планировании эксперимента и выполнении исследований, обобщении результатов и использовании их в практике. Результаты диссертационной работы являются совокупностью научных исследований, проведенных лично автором и при его непосредственном участии в качестве ответственного исполнителя.
Публикации. По теме диссертационной работы подготовлено и опубликовано 9 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, 1 патент РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 странице машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 6 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, списка литературы и приложения. Список литературы включает 152 источника, из которых 111 отечественных и 41 зарубежных авторов. В приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, её научную и практическую значимость.
Патогенез и лечение
Заражение животных в основном происходит через раневые (воспаленные) участки кожи или слизистых оболочек. На месте проникновения возбудителя нек-робактериоза может возникнуть патологический процесс только в том случае, если он найдет подходящие условия для своего развития. Благоприятным моментом для размножения возбудителя некробактериоза является повреждение тканей (механическое, травматическое, токсическое, физическое, химическое, биологическое), при котором прекращается поступление в них кислорода, происходит разрыв кровеносных сосудов, образование гематом, тромбов, флегмон, омертвление тканей, т.е. создается хорошая питательная среда для развития палочки некроза. Первоначально в очаге проникновения бактерий образуется небольшая язвочка, затем в воспалительный процесс вовлекаются окружающие ткани, повреждаются стенки сосудов, откладываются обильные массы фибрина, выходит большое количество белка, появляются тромбы; в результате всего этого наступает омертвление мышц, связок, хрящей, фаланг конечностей [16, 18, 27, 38, 46, 50, 58, 85, 94, 99, 104, 132, 134, 137, 138, 139].
Из первичного некротического очага палочки некроза прорастают в тромбы и с оторвавшимися от них частицами могут уноситься с током крови в различные внутренние органы, где оседают в капиллярах. Появляются метастатические поражения в легких, кишечнике, печени, селезенке, головном мозге и других органах. В зависимости от места локализации патологического процесса развиваются бронхопневмония, плеврит, перитонит, абсцессы, флегмоны и т. д. Течение болезни осложняется развитием смешанной инфекции – стафилококков, стрептококков, возбудителей газовой гангрены, гноеродных микрококков и др. Болезнь в таких случаях приобретает злокачественный характер [16, 18, 27, 46, 73, 94, 104].
При благоприятном исходе болезни дальнейшее развитие патологического процесса приостанавливается, первичный некротический очаг инкапсулируется и животные выздоравливают [38, 110, 140].
Инкубационный период 1 – 3 дня. Клиническое проявление зависит от формы и течения болезни, вида и возраста животных.
У молодняка некробактериоз чаще протекает остро, у взрослых животных – подостро и хронически. Различают 4 формы болезни: кожный некробактериоз – с поражением кожи и подлежащих тканей; некробактериоз слизистых оболочек и подлежащих тканей; некробактериоз внутренних органов; некробактериозный остит и остеомиелит [5, 27, 87, 104, 105, 141].
Кожный некробактериоз является самой распространенной формой болезни. Он протекает с поражением внешних тканей и чаще всего локализуется на конечностях животных. У крупного рогатого скота и свиней встречаются поражения шеи, туловища и вымени, у молодняка – пупочного канатика, кончиков ушей и хвоста. Чаще поражаются задние конечности, вначале одна, затем другая. У овец некротические очаги могут появляться одновременно на нескольких конечностях. Патологический процесс возникает на месте маленьких ран и царапин. Здесь появляются покраснение и отечность. Животные подергивают больной конечностью, они становятся угнетенными, отказываются от корма, у них наблюдается повышение температуры тела до 40 С и выше, которая держится в течение 1 – 2 дней и постепенно приходит в норму. Появляется хромота. Воспалительный процесс с межпальцевых поверхностей и мякиша распространяется на венчик. Животные больше лежат. При злокачественном течении болезни наступает флегмо-нозное воспаление, которое захватывает глубже лежащие мышцы, связки и сухожилия, образуются язвы с гнойным содержимым неприятного запаха. В результате изъязвлений и омертвлений тканей происходит спадение рогового башмака и возможно отторжение фаланг. Больные овцы малоподвижны, опираются на путовые или карпальные суставы. У лошадей развивается гангренозный дерматит с общими септическими явлениями [5, 27, 87, 142].
Некробактериоз слизистых оболочек довольно часто регистрируют у молодняка в первые недели жизни в виде некротического стоматита и реже – у взрослых животных. Поражаются слизистые оболочки ротовой полости, носа, половых органов и кишечника. Ранение слизистых оболочек десен, языка и. щек у молодняка происходит при прорезывании зубов, а заражение – через инфицированный корм, подстилку и загрязненные соски матерей. Болезнь протекает остро. Слизистая оболочка ротовой полости воспаляется, отекает, на ней образуется дифтеритический налет. В процесс вовлекаются слизистые оболочки гортани, трахеи и носа, а также соседние ткани. Появляются некротические изъязвления на щеках, деснах, твердом нёбе, губах и крыльях носа. Животные стоят с открытым ртом, у них наблюдается одышка. Изо рта выделяется пенисто-тягучая слюна с гнилостным запахом. Развивается периостит и периодонтит, наблюдается выпадение зубов. Пораженный язык высовывается из ротовой полости наружу. В связи с распадом тканей могут возникать эмболические очаги некроза в легких, печени, мозге и перикарде. Больные животные погибают на 7 – 10-й день от истощения с явлениями сепсиса и сердечной недостаточности [5, 87, 143].
При некробактериозе внутренних органов болезнь проявляется высокой температурой и сильным поносом (кал серо-зеленого цвета). Отмечается болезненность брюшной стенки, особенно в области печени.
Шерсть у животных взъерошена, живот подтянут. Животных с некротическим энтеритом обычно убивают, так как прогноз неблагоприятный.
При поражении других внутренних органов некробактериоз протекает без характерных признаков. Больные животные отстают от стада, угнетены, плохо поедают корма, худеют и теряют продуктивность. При локализации патологического процесса в легких у больных животных развиваются бронхопневмония, плеврит, слышны хрипы, частый и глухой кашель. Некротические очаги в головном мозге вызывают различные нервные расстройства, а поражение сердца сопровождается сердечной недостаточностью. Установить некробактериоз удается только при вынужденном убое животных по патологоанатомическим изменениям[5, 27, 87].
Анализ традиционных технологий изготовления вакцин
Склянки с бакмассой шуттелируют в течение трёх часов, затем из них берут пробы для проверки культур на чистоту и типичность.
Для изготовления ассоциированной эмульсионной вакцины производят концентрирование споровой бакмассы методом спонтанного осаждения спор или при помощи флокулянта - 1%-ного раствора натриевой соли карбоксиме-тилцеллюлозы.
Бутыли с концентрированной споровой бакмассой хранят при температуре от 2 до 10С в течение десяти дней. За это время её проверяют на чистоту, типичность роста, подвижность бацилл и на концентрацию жизнеспособных (ж/с) спор в 1 см3.
Сконцентрированная бакмасса до смешивания с некробактериозным эк-зоанатоксином должна иметь концентрацию от 4,5 до 12 млрд спор в 1 см3.
Получение производственной суспензии спор вакцинного сибиреязвенного штамма 55 в мясной кислотно-гидролизатной жидкой среде (МКГЖС) реакторным методом.
В биореактор, в котором производят культивирование, из подготовительного цеха по стерильной трубе из нержавеющей стали перекачивают расчётное количество кислотного гидролизата мяса. Соли в необходимой массе растворяют в дистиллированной воде и смешивают с кислотным гидролизатом мяса. Необходимым условием для роста и полноценного спорообразования культуры штамма 55 в МКГЖС является подача растворенного кислорода. При этом количество растворённого кислорода должно быть на уровне (3,5±0,2) миллимолей в 1 дм3 среды за 1 час. Снижение или наоборот повышение концентрации кислорода в среде приводит к ослаблению роста, уменьше 66 нию или прекращению спорообразования. Поэтому для достижения необходимого уровня оксигенации среды, перед культивированием вакцинного штамма, определяют массообмен кислорода в используемом реакторе, применяя сульфитный метод.
Засев МКГЖС в реакторе при суспензионном культивировании штамма 55 проводят споровой бакмассой, проверенной на чистоту, типичность, подвижность бацилл и на содержание жизнеспособных спор в 1 см3. Устанавливают температуру (37±1)С. В течение (28±1) часов культивирования через барботёр в реактор подают определённое по калибровочной прямой количество стерильного воздуха.
После указанного срока из реактора берут пробу культуры, из которой готовят препарат «раздавленная капля» для предварительного определения чистоты и степени спорообразования.
Для дальнейшей работы культура должна быть без посторонней микрофлоры и иметь не менее 80% спор на разных стадиях формирования.
Затем культуру в реакторе выдерживают без аэрации в течение 20 часов при температуре (37±1)С. После чего культуру перемешивают мешалкой при 85 об/мин в течение 20-30 минут и берут пробу для контроля на чистоту, типичность, морфологию, подвижность, однородность, степень спорообразования. Кроме того, если в культуральной суспензии содержится не менее 90% спор, производят определение концентрации жизнеспособных спор.
Концентрат спор из бутыли проверяют на чистоту, типичность, морфологию, однородность и концентрацию спор. Количество жизнеспособных спор в 1 см3 должно быть в пределах от 4,5 до 12 млрд.
При положительных результатах бактериологической проверки и после определения количества живых спор сконцентрированную споровую бакмассу, полученную в реакторе, считают пригодной для производства ассоциированной эмульсионной вакцины. 2.4.2. Изготовление противонекробактериозного компонента вакцины
Приготовление посевной серии (Production seed) штамма «0-1» F.necrophorum для глубинного культивирования в реакторах
При изготовлении посевной серии (Production seed) из штамма « 0-1» ВИЭВ используют рабочий посевной материал в ампуле (Working seed), изготовленный из главного посевного материала (Master seed). Для этого в ампулу с сухой культурой штамма «0-1» вносят стерильный 0,9%-ный раствор натрия хлорида в объёме 2-3 см3, после полного разведения сухой микробной массы засевают 5-10 пробирок с МППБ, параллельно делают посев на/в МПА и МПБ. Посевы культивируют в течение 2-3 суток при температуре (37,0±0,5) С. В посевах в/на МПБ и МПА не должно быть роста. Рост в МППБ проверяют световой микроскопией и делают пересевы пастеровской пипеткой на ту же среду во флаконы объёмом 0,5 дм3, содержащие от 300 до 350 см3 среды, из расчёта одна пробирка на флакон, дополнительно засевают 1-2 пробирки с МПБ и МПА для контроля микробиологической чистоты. Посевы культивируют в течение 2-3 суток при температуре (37,0±0,5)С. Рост во флаконах проверяют микроскопией. Затем делают пересевы в бутыли вместимостью от 16 до 20 дм3 с МППБ из расчета один флакон на бутыль. Бутыли помещают в термостат на срок от 36 до 72 часов и культивируют при температуре (37±0,5)С.
Параллельно с посевом в бутыли из флаконов делают контрольные посевы в пробирки с МПБ и МПА и флаконы с МПБ, которые культивируют при 37,0±0,5 С в течение трёх суток. Посевы в эти среды не должны давать роста культур штамма «0-1».
При изготовлении посевной серии допускается из одной ампулы с посевным материалом (Working seed) засевать 5-10 пробирок с МППБ, из которых затем производят пересевы во флаконы с той же средой из расчёта - одна пробирка на один флакон.
Через 2-3 суток выросшие культуры F. necrophorum из флаконов пересевают в бутыли из расчета - один флакон на бутыль.
Разработка эффективной питательной среды для культивирования противонекробактериозного компонента
Масляную основу адъюванта соединяют с эмульгатором в соотношении: 8% эмульгатора №139 и 92% минерального масла «Маркол», соотношение глицерина к масляному адъюванту – 1/1.
Полученную смесь тщательно перемешивают в реакторе или емкости снабженной мешалкой, затем стерилизуют при 0,1 МПа в течение одного часа.
После охлаждения масляный адъювант проверяют на стерильность высевами на МПА и в МПБ и МППБ. Адъювант должен быть стерильным.
Безвредность масляного адъюванта определяют путём подкожного введения в дозе 1 см3 двум кроликам массой 1,5-2 кг; внутримышечного введения пяти морским свинкам массой 400-450 г; подкожного введения по 0,2 см пяти белым мышам массой 20-25 г. Наблюдение за подопытными животными ведут 10 суток, в течение которых все лабораторные животные должны оставаться клинически здоровыми.
Для определения реактогенности масляный адъювант в дозе 1 см3 вводят внутримышечно шести морским свинкам массой 400-450 г. В течение срока наблюдения масса тела животных не должна снижаться и температура тела должна быть в пределах нормы. На месте введения масляного адъюванта не должны образовываться абсцессы и свищи, допускаются небольшие асептические отеки. Масляный адъювант должен быть умеренно реактогенным.
К отмытому экзоанатоксину добавляют споры вакцинного сибиреязвенного 55-ВНИИВВиМ ( штамм 55). Первоначальная концентрация спор штамма 55 до смешивания с экзоанатоксином должна быть в пределах от 7 до 10 млрд спор в 1 см3.
К смеси экзоанатоксина и спор добавляют масляный адъювант с эмульгатором в соотношении: 65% масла + 35% смеси из анатоксина и спор штамма 55. Смесь экзоанатоксина со спорами штамма 55 с эмульгированным маслом подвергают гомогенизации на коллоидной мельнице.
Антиген из смеси адсорбированного на ГОА инактивированного экзотоксина штамма «0-1» и спор штамма 55 соединяют со стерильным масляным адъювантом из расчёта: в 0,2 см3 вакцины должно содержаться количество эк-зоанатоксина, полученного из 4 млрд микробных клеток возбудителя некробак-териоза.
Готовую ассоциированную эмульсионную вакцину против сибирской язвы и некробактериоза животных расфасовывают в стерильные флаконы вместимостью 10, 20 или 50 см3, закрывают стерильными пробками, которые укрепляют алюминиевыми колпачками.
Готовая ассоциированная эмульсионная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза животных должна содержать в 1 см3 225±25 млн. живых сибиреязвенных спор штамма 55 и белка экзоанатоксина возбудителя некробакте-риоза штамма «0-1» должно быть 6±1 мг/см3.
В ДИ определяли безвредность, микробиологическую чистоту, остаточную вирулентность, капсулообразование и иммуногенность вакцины с минеральным маслом (серия № 1) и сапонином (серия № 2, контроль) в качестве адъюванта, стабильность вакцины при хранении.
В качестве исходных материалов для изготовления вакцин обеих серий использовали суспензию спор вакцинного сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ, в 1 см3 которой содержалось 7 млрд. спор, и экзоанатоксин культуры фузобактерий некробактериоза штамма «0-1» с содержанием белка 15±2 мг/см3.
Серия № 1 ассоциированной вакцины изготовлена путем эмульгирования суспензии спор сибиреязвенного и некробактериозного экзоанатоксина в минеральном масле «Маркол» с эмульгатором №139.
Серия № 2 – путем смешивания спор штамма 55-ВНИИВВиМ и некробакте-риозного анатоксина с сапонином 0,048 мг в 1 см3. В обоих случаях смешивание производили в асептических условиях на магнитной мешалке в течение 40 мин при 3000 об/мин. В обеих сериях ассоциированных вакцин концентрация жизнеспособных спор вакцинного штамма была доведена до 250 млн в 1 см3 и содержала в 0,4 см3 – 100 млн спор, в 0,2 см3 – 50 млн спор и в 0,1 см3 – 25 млн спор.
В готовой вакцине серии №1 расчётная концентрация жизнеспособных спор штамма 55 в 1 см3 составляла 225±25 млн. спор, расчётное количество белка нек-робактериозного экзоанатоксина штамма «0-1» в 1 см3 вакцины – 6±1 мг. При использовании минерального масла была получена стойкая хорошо эмульгированная вакцина. Показатели качества ассоциированной вакцины: Безвредность образцов ассоциированных вакцин против сибирской язвы и некробактериоза серий № 1 и № 2 определяли на кроликах, морских свин ках и белых мышах. Вакцина серии № 1 показала себя безвредной и умеренно ре актогенной для всех видов животных.
Вакцина серии №2 (с сапонином) была гораздо более реактогенная: у морских свинок в местах введения вакцины (0,1 и 0,2 см3) наблюдали отеки, которые трансформировались в незаживающие язвы и некрозы. У выживших кроликов после проверки безвредности вакцины из мест введения вакцины регистрировали казеозные выделения.
Клинические испытания ассоциированной вакцины
В процессе исследований оптимизированы технологические этапы производства ассоциированной вакцины.
Одной из задач исследований была оптимизация масляного адъюванта ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных [1, 25].
Определен эффективный адъювант для ассоциированной вакцины для чего использовали метод математического планирования ПФЭ 23. Параметром оптимизации «Уi» выбрали иммуногенность новой вакцины. С учетом литературных данных и результатов предварительных опытов выбрали следующие факторы: - Х1 - концентрация эмульгатора в масляном адъюванте; -Х2 - соотношение глицерина к масляному адъюванту; - Х3 - эмульгатор 394 (1) / Эмульгатор 139 (2). Оптимальным по составу является масляный адъювант, в котором концентрация основных компонентов имеет следующие значения: - Х1 - концентрация эмульгатора 139 в масляном адъюванте 8%; - Х2 - соотношение глицерина к масляному адъюванту- 1/1; - Х3 - эмульгатор 139 является оптимальным. Для обеспечения качества новой ассоциированной вакцины важными были этапы подготовки посевного материала (для двух компонентов). В работе использовали производственные штаммы Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ и Bac. Antracis 55-ВНИИВВиМ. При изготовлении посевных серий - (Production seed) из обеих штаммов использовали рабочий посевной материал в ампулах (Working seed), изготовленный из главного посевного материала (Master seed). Изготовление посевных серий является частью управления жизненным циклом продукции и проводится в соответствующих условиях (по требованиям ФСК предприятия), подготовлена внутренняя документация на их изготовление (по требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации).
Опытные образцы новой вакцины прошли доклинические иследования, в ходе которых были определены показатели качества нового препарата и их значения. Проведено масштабирование технологии производства ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных. Подготовлена к регистрации нормативная документация и проведены мероприятия по организации серийного производства новой ассоциированной вакцины.
В клинических испытаниях показана эффективность нового препарата. Новизна способа получения ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных защищена патентом РФ №2524430.
В результате проделанной научно-практической работы были выполнены все поставленные задачи и достигнута поставленная цель научной работы. Полученные результаты исследования согласуются с данными других исследователей и отражают современное состояние проблемы - разработки технологии производства новой ассоциированной вакцины для профилактики сибирской язвы и некро-бактериоза животных и оценке ее эффективности.
1. Разработана и внедрена опытно-промышленная технология получения ассоциированной вакцины против сибирской язвы (штамм 55-ВНИИВВиМ) и нек-робактериоза (штамма- Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ).
2. Разработан эффективный состав питательной среды для суспензионного культивирования штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ на основе пеп-тонно-печёночного бульона Хоттингера, её состав: перевар Хоттингера 0,35 дм3; печеночный экстракт 0,25 дм3; пептон 0,0015 кг; натрий хлористый 0,0005 кг; вода питьевая (по ГОСТ Р 51232-98) до 1,0 дм3.
3. Накопление микроорганизмов штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ при использовании разработанной питательной среды составило 5,6 млрд/см3 через 36 часов культивирования, что выше чем на инструктивных (промышленных) средах на 30 – 40 %.