Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы
2.1 Этиология вирусных иммунодефицитов и лейкозов животных и эпизоотическая ситуация 13
2.2 Общебиологические и вид опосредованные патогенетические закономерности развития инфекционных болезней животных, вызываемых вирусами иммунодефицита и лейкоза 34
2.3 Витальная диагностика вирусных иммунодефицитов и лейкозов животных: клиническая, гематологическая, серологическая, вирусологическая и молекулярно-генетическая 42
2.4 Патоморфологические изменения при вирусных иммунодефицитах и лейкозах животных 67
2.5 Биологическая безопасность и качество продукции, полученной от крупного рогатого скота, инфицированного ретровирусами 72
2.6 Современное состояние и организация мер борьбы и профилактики при вирусных иммунодефицитах и лейкозах животных 75
3 Собственные исследования 87
3.1 Методология, материал и методы исследования 87
3.2 Результаты исследований и их анализ 97
3.2.1 Энзоотический лейкоз и вирусный иммунодефицит крупного рогатого скота 98
3.2.1.1 Анализ эпизоотической обстановки по энзоотическому лейкозу и вирусному иммунодефициту крупного рогатого скота 99
3.2.1.2 Особенности клинических проявлений BIV инфекции, гематологические, биохимические и цитоморфологические изменения при вирусном иммунодефиците и лейкозе крупного рогатого скота 124
3.2.1.3 Совершенствование методов лабораторной диагностики вирусного иммунодефицита и лейкоза крупного рогатого скота 141
3.2.1.4 Белково-аминокислотный состав молока коров при BIV инфекции и при BLV-BIV-коинфекции 159
3.2.1.5 Разработка и внедрение научно обоснованной системы профилактических и оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота, с учетом вирусного иммунодефицита 169
3.2.2 Вирусный иммунодефицит и лейкемия кошек 182
3.2.2.1 Эпизоотические особенности вирусного иммунодефицита и лейкемии кошек 182
3.2.2.2 Гематологические и биохимические изменения при FIV инфекции, ультраморфология лимфоцитов кошек при вирусном иммунодефиците и лейкемии 186
3.2.2.3 Клинические проявления и патоморфологические изменения при FIV-инфекции.. 193
3.2.2.4 Совершенствование методов лабораторной диагностики вирусного иммунодефицита и лейкемии кошек 223
3.2.2.5 Рекомендации по усовершенствованию профилактических и оздоровительных мероприятий при вирусном иммунодефиците и лейкемии кошек 2
4 Заключение 244
5 Список сокращений и условных обозначений 250
6 Список литературы
- Витальная диагностика вирусных иммунодефицитов и лейкозов животных: клиническая, гематологическая, серологическая, вирусологическая и молекулярно-генетическая
- Современное состояние и организация мер борьбы и профилактики при вирусных иммунодефицитах и лейкозах животных
- Анализ эпизоотической обстановки по энзоотическому лейкозу и вирусному иммунодефициту крупного рогатого скота
- Разработка и внедрение научно обоснованной системы профилактических и оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота, с учетом вирусного иммунодефицита
Введение к работе
Актуальность темы исследования.
Вирусные иммунодефициты и лейкозы животных относятся к инфекциям, не поддающимся терапии и специфической профилактике. Эти заболевания зарегистрированы у крупного рогатого скота и кошек. В эндемичных регионах степень распространения данных инфекций среди животных составляет 67 %, а в некоторых доходит до 83,9 % (В.В. Колотвин с соавт., 2006; C. McConnel, et al., 2015).
Возбудителями данных заболеваний являются РНК-содержащие вирусы семейства Retroviridae, паразитирующие в клетках иммунной системы. Развивающиеся вследствие этого патологические изменения приводят к многообразным морфофункциональным нарушениям на клеточном, тканевом, органном и организменном уровнях, что выражается полиморфизмом клинических проявлений и снижает эффективность существующих методов диагностики данных инфекций (М.В. Супотницкий, 2009).
Вопрос эпизоотической безопасности в отношении лейкоза крупного рогатого скота является актуальным как в Российской Федерации, так и в мире, особенно в странах с развитым молочным скотоводством (J. Otachel-Hawranek et al., 2007). Решение данной проблемы в первую очередь направлено на обеспечение защиты животных от заражения и, соответственно, на повышение экономической эффективности животноводства, связанной с сохранением генофонда и поголовья скота, а также получаемой от животных продукции (И.М. Донник с соавт., 2015).
Энзоотический лейкоз часто протекает в форме коинфекции с вирусным иммунодефицитом крупного рогатого скота, что усугубляет глубину и масштаб морфофункциональных нарушений в организме животного, затрудняет диагностику заболевания, а, следовательно, приводит к увеличению сроков оздоровления неблагополучных пунктов и росту экономических потерь в животноводстве (С.В. Криворучко с соавт., 2012).
Вирусные иммунодефицит и лейкемия являются на сегодняшний день одними из самых распространенных причин гибели кошек, что связано с высокой контагиозностью заболеваний и выраженными альтеративными процессами в различных органах и тканях животного (J. Levy et al., 2008).
Диссертационная работа является составной частью научно-
исследовательской работы факультета ветеринарной медицины, пищевых и биотехнологий по реализации Федерального закона от 13.07.2015г. № 243-ФЗ «О внесении изменений в Закон Российской Федерации «О ветеринарии» и отдельные законодательные акты Российской Федерации» и поручения Правительства Российской Федерации от 18.09.2015г. № АД-П11-6390, исследования выполнены в рамках приоритетного научного направления ФГБОУ ВО Саратовский ГАУ «Интенсификация животноводства» (гос. рег. № 01201151794), подтема 3 «Разработка инновационных методов диагностики, коррекции, профилактики и лечения животных, птицы и рыбы».
Степень разработанности темы.
Фундаментальные исследования по изучению этиологии, патогенеза,
клинических и патоморфологических проявлениях инфекций, а также в
области диагностики, борьбы и профилактики данных заболеваний у животных
были осуществлены рядом зарубежных и отечественных ученых.
Вирусогенетическая теория Л.А. Зильбера (1968) и вирусоиммуногенетическая
теория В.П. Шишкова (1988) позволили не только установить этиопатогенез
ретровирусных инфекций, но и разработать серологические методы выявления
инфицированных животных. Открытие полимеразной цепной реакции (1983)
дало возможность в дальнейшем выделить, секвенировать, определить
таксономическое положение и изучить генетическое разнообразие
возбудителей вирусных иммунодефицитов и лейкозов животных. В Северной зоне Нижнего Поволжья подобные исследования выполнены впервые.
Несмотря на многолетний опыт и многочисленные попытки, до сих пор так и не удалось создать эффективные вакцины, защищающие животных от заражения ретровирусными инфекциями. Не получила распространения, в силу экономической нецелесообразности и низкой эффективности, терапия этих заболеваний у животных. В связи с этим, система мер контроля ретровирусных инфекций животных в настоящее время базируется на диагностике и ограничительных мероприятиях (Р.Ф. Галеев, 2000; P.M. Bczkowski et al., 2015).
Высокая степень распространения вирусных иммунодефицитов и
лейкозов среди животных, обусловленная малой эффективностью
существующих диагностических и превентивных мероприятий,
свидетельствует о необходимости изучения данных заболеваний, особенно в аспекте тенденции их к сочетанному течению, а также о необходимости совершенствования методов выявления данных патогенов и способов контроля над распространением возбудителей.
Цель исследования. Дать теоретическое и практическое обоснование
совершенствования диагностики и мер борьбы при вирусных
иммунодефицитах и лейкозах животных, разработать и внедрить в ветеринарную практику эффективные способы выявления данных заболеваний.
Задачи исследования.
-
Установить степень распространения и эпизоотические закономерности вирусных иммунодефицитов и лейкозов животных в Северной зоне Нижнего Поволжья.
-
Охарактеризовать клинические и патоморфологические проявления вирусного иммунодефицита животных.
-
Описать морфологические и биохимические параметры крови животных при вирусном иммунодефиците и лейкозе в зависимости от формы и течения инфекции (латентная, острая, моноинфекция, микст-инфекция).
-
Изучить влияние возбудителей иммунодефицита и лейкемии на морфофункциональное состояние основных клеток-мишеней в организме хозяина.
-
Оценить белковый и аминокислотный состав молока коров при BIV инфекции и при BLV-BIV-коинфекции.
-
Сравнить информативность существующих методов диагностики и разработать новые эффективные способы выявления животных, инфицированных возбудителями иммунодефицитов и лейкозов.
-
Усовершенствовать ветеринарные Правила по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота в хозяйствах различных организационно-правовых форм собственности и провести экономическое обоснование внедрения в производство усовершенствованных мероприятий.
Научная новизна.
Впервые выявлены эпизоотологические закономерности распространения вирусных иммунодефицитов и лейкозов животных в Северной зоне Нижнего Поволжья.
Представлены и проанализированы новые данные по морфологическим и биохимическим показателям крови животных при вирусном иммунодефиците и лейкемии, в зависимости от формы и течения инфекции.
Впервые изучены морфометрические и биофизические характеристики лимфоцитов животных, инфицированных вирусами иммунодефицита и лейкемии в сравнении с лимфоцитами интактных животных.
Впервые исследован и охарактеризован белково-аминокислотный состав молока BIV и BIV-BLV инфицированных коров и дана оценка его пищевой ценности.
Разработаны, запатентованы и внедрены в практику четыре способа диагностики вирусных иммунодефицитов и лейкозов животных: патент РФ № 2553534 «Пара синтетических олигонуклеотидных праймеров, применяемых для выявления ДНК провируса и РНК вируса иммунодефицита кошек и способ диагностики вирусного иммунодефицита кошек с их использованием»; патент РФ № 2586504 «Две пары синтетических олигонуклеотидных праймеров и способ их применения для индикации вирусов иммунодефицита и лейкемии кошек в клиническом материале методом мультиплексной полимеразной цепной реакции»; патент № 2595373 «Набор для выявления ДНК провируса иммунодефицита крупного рогатого скота, содержащий пару специфичных праймеров и зонд, и способ диагностики вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени»; патент РФ № 2615465 «Диагностическая система для выявления ДНК провирусов лейкоза и иммунодефицита крупного рогатого скота методом мультиплексной полимеразной цепной реакции».
На основании проведенных исследований и экономических расчетов,
разработаны: комплекс диагностических, профилактических и
оздоровительных мероприятий, вошедший в «Ветеринарные Правила
осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных
мероприятий, направленных на предотвращение распространения лейкоза
крупного рогатого скота», принятые Департаментом ветеринарии
Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (2017), а также
«Методические рекомендации по профилактике и этиотропной терапии
вирусного иммунодефицита домашних и сельскохозяйственных животных»;
рекомендации «Лейкоз крупного рогатого скота» и рекомендации по
диагностике и проведению оздоровительных мероприятий по лейкозу и
вирусному иммунодефициту крупного рогатого скота, одобренные
Управлением ветеринарии Правительства Саратовской области (2017).
Теоретическая и практическая значимость работы. Настоящая работа относится к области фундаментальных и прикладных исследований.
Полученные сведения создают теоретическую базу для
совершенствования диагностики и мониторинга вирусных иммунодефицитов и
лейкозов животных. Полученные данные по клиническим, гематологическим,
биохимическим и патоморфологическим особенностям проявления вирусных
иммунодефицитов и лейкозов животных, а также выявленные
морфометрические и биофизические изменения в инфицированных
лимфоцитах позволяют понять сущность процессов, происходящих в системе возбудитель-восприимчивый организм и оценить характер обусловленных ими морфофункциональных нарушений. Результаты, полученные при изучении белкового и аминокислотного состава молока коров, инфицированных вирусами иммунодефицита и лейкоза, являются значимыми для определения пищевой и сырьевой ценности на молокоперерабатывающих предприятиях и определения путей его переработки.
Выявленные закономерности распространения вирусных
иммунодефицитов и лейкозов животных в Северной зоне Нижнего Поволжья
могут являться базовыми для оценки эффективности проводимых
превентивных мероприятий в эпизоотически неблагополучных регионах. Экономические расчеты по внедрению в производство разработанных Правил и Рекомендаций подтверждают эффективность предлагаемой научно обоснованной системы мероприятий. Запатентованные и применяемые в ветеринарной практике способы выявления животных, инфицированных вирусами иммунодефицита и лейкоза, позволяют с высокой степенью эффективности диагностировать данные заболевания.
Методология и методы исследований.
Методологической основой проведенных исследований является необходимость теоретического обоснования совершенствования диагностики вирусных иммунодефицитов и лейкозов животных с целью практической реализации новых подходов к мерам борьбы при данных заболеваниях.
Для решения поставленных задач использован комплекс как общенаучных, так и частно научных методов исследования.
Первые предусматривали применение совокупности общетеоретических и эмпирических методов исследования, таких как системный подход, статистическая обработка данных, анализ, эксперимент, измерение, сравнение моделирование, в том числе компьютерное и т.д.
Использованы эпизоотологические, клинические, патоморфологические,
гематологические, серологические, молекулярные, биохимические,
морфометрические, и другие методы исследования, выполненные на высокотехнологичном оборудовании научных подразделений ФГБОУ ВО Саратовский ГАУ, ФГБОУ ВО Ульяновский ГУ, ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
Положения, выносимые на защиту:
-
Вирусные иммунодефициты и лейкозы животных широко распространены в Северной зоне Нижнего Поволжья и характеризуются выраженными эпизоотологическими закономерностями и часто регистрируются в виде коинфекции.
-
Патогенетическая сущность вирусных иммунодефицитов и лейкозов животных обусловлена альтерацией основных клеток-мишеней, а развивающиеся вследствие этого морфологические и биохимические нарушения являются свидетельством изменения гомеостаза организма животного.
-
Комплекс клинических проявлений, гематологических, цитологических и патоморфологических изменений обусловлен многообразием форм проявления вирусных иммунодефицитов и лейкозов животных, что приводит к снижению эффективности классических методов диагностики данных инфекций.
-
Разработанная система мероприятий позволяет проводить раннюю диагностику инфекций, с высокой степенью достоверности, и своевременно осуществлять меры профилактики вирусных иммунодефицитов и лейкозов животных.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов обусловлена значительным объемом обработанного материала, полученного с использованием высокоинформативных методов исследования в лабораторных и производственных условиях с подтверждением данных математической статистикой.
Основные материалы диссертационной работы представлены, обсуждены и одобрены на русском и английском языках на межвузовских, международных, межрегиональных, всероссийских научно-практических конференциях; международных научных форумах; специализированных выставках (Саратов, 2008-2016 г.г.; Умань (Украина), 2009 г.; Казань, 2011,
2014 г.г.; Курск, 2011 г.; Москва, 2010, 2013 г.г.; Пермь, 2013 г.; Ульяновск,
2015 г.; Волгоград, 2015 г.; Ставрополь, 2016 г.).
Личный вклад соискателя. Все эпизоотологические, клинические,
патоморфологические, гематологические, биохимические,
цитоморфологические, молекулярно-генетические исследования, а также статистическая обработка полученных результатов проведены непосредственно автором. Личный вклад соискателя составляет 90 %.
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 58 научных работах, а именно: в 56 научных статьях, в том числе 19 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ и в 2 изданиях, включенных в базу данных Scopus и Web of Science; в 2 монографиях. По материалам диссертации опубликованы: учебное пособие; 4 методических
рекомендации. По результатам научных исследований выданы 4 патента РФ на изобретения.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 341 страницах стандартного компьютерного текста и включает в себя введение, основную часть, заключение. Работа содержит 36 таблиц, 80 рисунков и 11 приложений. Список использованной литературы включает в себя 569 источников, том числе 429 иностранных.
Витальная диагностика вирусных иммунодефицитов и лейкозов животных: клиническая, гематологическая, серологическая, вирусологическая и молекулярно-генетическая
Исследования показали, что BLV инфекция широко распространена на всех континентах, за исключением Европы. В естественных условиях к возбудителю ЭЛ КРС восприимчивы крупный рогатый скот, зебу и буйволы, экспериментально инфекция может быть воспроизведена на овцах, козах или альпаках (L.C. Lee et al., 2012; S. Meas, et al., 2000; S.M. Rodriguez, et al., 2011; A. Florins et al., 2012). Лейкозом болеют молодые и взрослые животные всех существующих пород и помесей, но чаще эту болезнь отмечают у животных старше 4 лет. Установлено, что телята до шестимесячного возраста проявляют резистентность к BLV. Уровень инфицированности скота в возрасте 6-24 месяцев самый низкий по сравнению с возрастными животными (Донник с соавт., 2015). Экспериментально установлено, что для заражения коровы достаточно ввести внутрикожно всего 2,500 лимфоцитов крови, содержащих вирус ЭЛКРС. Такое количество лимфоцитов, по мнению многих исследователей, может находиться в 0,0005 мл крови (Москалик Р.С., 1999). В сперме инфицированных быков BLV не выявлен. Кроме того, наличие вируса в фекалиях, моче и слюне инфицированных животных также не установлено. Степень восприимчивости животных к BLV, обозначаемая индексом контагиозности, незначительна. Установлено, что стадный прирост уровня инфицированных животных составляет в среднем 2,5 % в год (В.М. Нахмансон, 1986). Показано, что BLV распространяется горизонтально путем передачи инфицированных клеток. Так свободный вирус очень неустойчив, BLV-инфицированные клетки (B-лимфоциты, моноциты, макрофаги), присутствующие в крови или молоке являются эффективным средством естественной передачи вируса (С. В. Тимошина, 2015). Из-за большого количества инфицированных клеток в крови, животные с поликлональной пролиферацией особенно опасны в качестве источника инфекции (R. Kettmann, A. Burny, 1994; И.М. Донник, М.В. Петропавловский, 2015). В стадах ятрогенные процедуры, такие как удаление рогов, биркование, ректальная пальпация, использование не стерильных инструментов, способствуют распространению инфекции (С. В. Тимошина, 2015). Длительный контакт между инфицированными и здоровыми животными также рассматриваться как фактор риска при передаче BLV. Зафиксирована передача вируса гематофагами (Perino LJ, et al., 1990). Перинатальная или послеродовая передача BLV в условиях стада встречается чаще, чем внутриутробная, которая регистрируется в 4 – 18 % случаев и зависит от течения инфекции (M.L. Lassauzet et al., 1991; Галеев Р.Ф., 2000). Риск рождения BLV-инфицированных телят выше у коров с поликлональной пролиферацией (A. Agresti et al., 1993). Экспериментально была зафиксирована возможность передачи BLV от коровы к теленку с молоком (J.F. Ferrer et al., 1981). Несмотря на присутствие провирусной ДНК в молозиве BLV-инфицированных коров, телята могут не заражаться в течение длительного периода времени, вероятно, благодаря защитной роли колостральных антител, присутствующих в большом количестве в молозиве (M.L. Lassauzet et al., 1991). В Батон-Руж (Луизиана) BLV был выявлен у 50 % скота (J.W. Black 1990). Усилия в осуществлении мер по контролю и кампаний по искоренению BLV инфекции с 1966 по 1996 гг в Западной Европе были успешными (K. Knapen et al.,1993). Так вирус был искоренен на материковой части Финляндии и в 1996 году он регистрировался не более, чем у 0,03-5 % поголовья (L. Nuotio et al., 2003). В Литве с 1985 года серопозитивных животных выводили из стад, а телят выпаивали пастеризованным молоком. В итоге, в 1990 году распространение вируса не превышало 7,29 % на территории страны, и неуклонно снижалась до 0,32 % к 2006 году (J. Acaite et al., 2007). Европейское экономическое сообщество (ЕЭС) объявил большую часть своих членов официально свободными от ЭЛ КРС. В противоположность этому, ситуация отличается в Восточной Европе, где эта болезнь все еще присутствует в ряде стран: Болгария, Хорватия,
Эстония, Латвия, Польша, Румыния, Украина (OIE, 2015). Подобные попытки искоренить BLV инфекции в молочных стадах Австралии и Новой Зеландии началось в середине 1990-х годов. Более 98 % животных из этих стад были отрицательными в 2005 году (NAHIS-AHA, 1998). За исключением случаев в Европейском Союзе, распространенность BLV во всем мире колеблется от 30 % до 90 %. Подробная информация по распространению BLV в США была собрана с помощью системы национального мониторинга здоровья животных (NAHMS). Исследования показали, что в 2007 году в США 83,9 % молочных стад были BLV-положительны (C. McConnel et al., 2015). Эпизоотологический мониторинг ситуации в нескольких провинциях Канады указал на высокий уровень распространенности BLV: до 89 % в фермерских хозяйствах и 20,8-37,4 % у животных индивидуальной собственности (J.A. Van Leeuwen et al., 2001, 2005, 2006; H.M. Scott et al., 2006). В Южной Америке, показатели инфицирования ЭЛ КРС колеблются между 34 и 50 % в Колумбии, Венесуэле, Чили и Уругвае чуть меньше (R. Alfonso et al., 1998; G. Rama et al., 2011). В Аргентине, в индивидуальной собственности и на уровне фермерских хозяйств уровень распространенности BLV доходил до 32,8 % и 84 %, соответственно (K.G. Trono et al., 2001). В Бразилии, распространенность BLV-инфекции значительно варьирует между регионами и достигает более 50 % (L.. Leuzzi Junior et al., 2001; R. Cerqueira-Leite et al., 2001; C. Del Fava, E.M. Pituco, 2004). Эпизоотическая ситуация в Азии более неопределенная.
Международная организация по эпизоотии (OIE) признает, что BLV присутствует в Индонезии, Тайбэй (Китай) и Монголии. Самый низкий уровень, около 5 % BLV-инфицированных животных, зарегистрировано в Камбодже и на Тайване (C.T Wang, 1991; S. Meas et al., 2000). В Японии он значительно выше: 28,6 % и 68,1 % в частном владении и на фермах, соответственно (K. Murakami et al., 2011).
Современное состояние и организация мер борьбы и профилактики при вирусных иммунодефицитах и лейкозах животных
В течение десяти лет после открытия BLV в 1969 году, исследованиями с использованием РИД и РСК не удалось найти антитела к BLV в человеческой сыворотке. Это привело к распространенному мнению, что воздействие на человека BLV и его потенциал для инфекции человека не являются существенными. Однако исследования с использованием более чувствительного иммунологического метода (иммуноблоттинга) в крови людей был обнаружен капсидный BLV р24 антигена в 74 % тестируемых сыворотках крови человека. Всего было протестировано 257 человек. Было высказано предположение, что BLV-антитела могли быть ответом на денатурированные нагреванием BLV антигены, потребляемые в пищу с молоком и мясом инфицированных коров (G.C. Buehring et al., 2003). В работе, выполненной с использованием двух современных методов исследования (ИФА и ПЦР), было показано, что из 454 обследованных методом ИФА человек, 12,5 % дали положительный результат, показав присутствие в сыворотке крови противолейкозных антител. Все положительно реагирующие в ИФА люди были протестированы с помощью ПЦР. В результате 12,3 % из них оказались носителями провирусной ДНК BLV. По мнению Климова и соавторов (2012), интеграция вируса лейкоза КРС в геном клеток крови человека возможна с достаточно высокой долей вероятности. Вскоре ученые обнаружили вирус ЭЛ КРС в ткани молочной железы женщин, больных раком молочной железы, в 44 и 59 % случаев (G. Sinha, 2016; G.C. Buehring et al., 2014). Так была снята догма о том, что вирус ЭЛ КРС не представляет никакой опасности для человека.
Классическую ПЦР успешно используют для постановки диагноза на лейкоз КРС (M.R. Mohammadabadi et al., 2011). Для сомнительно реагирующих в ИФА животных использовали гнездную ПЦР для подтверждения диагноза на лейкоз КРС, а ПЦР в реальном времени показала чувствительность на 7,8 % выше, чем классическая ПЦР (M. Rola-uszczak et al., 2013). Количественную ПЦР в реальном времени использовали для установления вирусной нагрузки при BLV-инфекции скота, что позволяет судить о прогрессировании заболевания (M. Jimba et al., 2010). ПЦР дает возможность выявить фрагменты генома BLV в образцах крови уже через 1-2 недели после заражения (А.П. Ломакин и соавт., 1999; Н.В. Кузнецова, 1997; И.В. Виноградова, 2012).
Непрямой иммунофлуоресцентный анализ (РНИФ) был первым методом, который позволил обнаруживать ретровирусы кошек в полевых условиях. Вначале была разработана тест-система для диагностики вирусной лейкемии кошек (W.D. Hardy et al., 1973), затем вирусного иммунодефицита кошек (N.C. Pedersen et al., 1987).
Одна из модификаций метода основана на обнаружении группового специфического антигена в гранулоцитах, лимфоцитах и тромбоцитах инфицированных кошек (р27 при FeLV-инфекции). С этой целью фиксированные ацетоном мазки крови обрабатывают антителами, меченными флуорохромом. Иногда, в короткие сроки до и после виремии, антиген обнаруживается в плазме крови. Диагностическая чувствительность метода, по сравнению с современными, была значительно ниже, но положительный результат, как правило, говорил о стойкой виремии. Но если у кошки наблюдалась лейкопения или процент инфицирования лейкоцитов в периферической крови был не высоким, наличие инфекции могло остаться незамеченным (D.M. Hawks et al., 1991).
Другая модификация метода основана на обнаружении антител к р24 антигену FIV в сыворотке крови с помощью меченного флуорохромом антигена. Так, по данным Pedersen и соавт. (1987) методом РНИФ антитела к вирусу иммунодефицита были обнаружены у 10 из 25 кошек, имевших клинические проявления СПИДа и у 1 из 18 клинически здоровых. Результаты исследований были подтверждены электронной микроскопией (N.C. Pedersen et al., 1987). В настоящее время эти методы не имеют широкого распространения, но все же используются на практике (N.R. de Almeida et al., 2012)
Первые ИФА тесты с применением поликлональных антител, позволяли количественно определять трансмембранный вирусный белок, но временами давали ложноположительные результаты, так как антитела обнаруживали не только вирусные белки, но иногда и не вирусные компоненты (H. Lutz et al., 1980). Улучшенные высокоспецифичные тесты были построены на основе твердофазного ИФА. Современные ИФА тесты имеют высокую диагностическую чувствительность (90 %) и специфичность (100 %), но при диагностике ретровирусных инфекций, из-за биологических особенностей возбудителей, они нуждаются в подтверждении наличия или отсутствия провирусной ДНК (K. Hartmann et al., 2001; R. Hofmann-Lehmann et al., 2001).
В настоящее время для обнаружения вирусного антигена и разных классов противовирусных антител (вируснейтрализующие и антитела против комплексного FOCMA антигена) применяют ИФА тест-системы с использованием моноклональных и поликлональных антител. Однако все они обладают ограниченной чувствительностью в отношении выявления острой фазы инфекции либо в период сероконверсии. Недавно разработанная ИФА тест-система 4-го поколения обнаруживает вирусный антиген и антитела к нему, и поэтому способна выявлять инфекцию до сероконверсии. Однако у нее есть второе «диагностическое окно» - тест-система дает ложноотрицательный результат, если в крови пациента уровни антигена и антител к нему одинаковы (А.Е. Дробченко, 2015).
Анализ эпизоотической обстановки по энзоотическому лейкозу и вирусному иммунодефициту крупного рогатого скота
Изучение морфофункционального состояния лимфоцитов животных, инфицированных ретровирусами, в сравнении с интактными, выполняли методом АСМ-сканирования в лаборатории сканирующей и зондовой микроскопии НИТИ УлГУ. Для АСМ-сканирования, лимфоциты выделяли из периферической крови в градиенте плотности фиколл урографина (плотность 1,077 г/мл) по стандартной методике. Адгезию осуществляли при 37C, в течении 60 минут. Адгезированные лимфоциты фиксировали безводным метиловым спиртом 5 минут. Для оценки локализации клеток, препараты окрашивали по Романовскому-Гимза. Для исследования поверхности клеток использовали сканирующий зондовый микроскоп Solver P47-PRO). Сканирование поверхности фиксированных препаратов проводили в полуконтактном режиме на воздухе. Использовались неконтактные кремниевые зонды серии NSG10 (NT-MDT) с жесткостью 5,5-22,5 Н/м, резонансной частотой 150 кГц, радиусом закругления 10 нм, высота зонда 10-20 мкм. Для характеристики шероховатости поверхности образцов использовали среднюю арифметическую шероховатости (Ra), измеряемую в нанометрах (nm). Все полученные изображения сканированных поверхностей клеточных мембран обрабатывали в программе Nova 1.0.26.1443.
Четвертый этап наших исследований предполагал изучение белкового и аминокислотного состава молока инфицированных ретровирусами коров с целью установления взаимосвязи выявленных патогенетических проявлений, с качеством получаемого от коров молока.
Материалом для определения белково-аминокислотного состава молока BIV и BLV - BIV инфицированных коров, явились пробы цельного молока, полученные от коров молочных пород (3-7 лет), инфицированных вирусом бычьего иммунодефицита и коров с BLV-BIV коинфекцией. Белковый состав коровьего молока исследовали на базе Центра коллективного пользования лаборатории «Молекулярно-биологических исследований» ФГБОУ ВО Саратовский ГАУ. Анализ аминокислотного состава белковых фракций молока коров выполняли в НИЛ Физико-химических свойств и текстуры продуктов ФГБОУ ВО Саратовский ГАУ.
Белковый состав коровьего молока исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с предварительной пробоподготовкой на 1-й, 3-й и 6-й день хранения при +4С. Исследования выполнялись на системе жидкостной хроматографии «Стайер-Аквилон» с УФ детектором, снабженным колонкой Рhenomenex BioSep-SEC-S2000 с размером пор 145 , 300 х 7,80 мм (Россися). Детектирование проводили при длине волны 214 нм, в качестве подвижной фазы использовали раствор, содержащий 0,025 % азида натрия и 0,1 М фосфатно-солевого буфера со скоростью потока 2 мл/мин. Цельное молоко в объеме 10 мл центрифугировали при 10 тыс. об/мин., и температуре +5 C 30 мин. Отделяли верхнюю фракцию липидов и осадок. Затем в обезжиренное молоко при 37 C по каплям, при постоянном помешивании, вносили соляную кислоту до достижения рН 4,5, далее продолжали перемешивание на протяжении 30 минут. Полученный раствор центрифугировали при 5 тыс. об/мин и температуре +25 C на протяжении 10 минут, отделяли супернатант 1 М раствором натрия, рН осадка доводили до 6,5.
Анализ аминокислотного состава белковых фракций молока коров выполнялся с использованием системы капиллярного электрофореза «Капель 105М» (Россия). Методика М-04-38-2009 с изменениями №1 от 01.02.2010, применяемая для определения массовой доли аминокислот, по миграции анионных форм ФТК-производных аминокислот под действием электрического поля в кварцевом капилляре в фосфатном или боратном электролите и регистрации электрофореграммы при длине волны 254 нм. Методика предусматривает проведение анализа из трех навесок пробы, различающихся процедурой пробоподготовки, условиями электрофоретического определения и перечнем определяемых аминокислот. Аминокислоты определяли разложением проб кислотным или щелочным гидролизом с переводом аминокислот в свободные формы, получение фенил изотиокарбамильных производных.
Заключительным этапом наших исследований явилась разработка эффективных способов диагностики вирусных иммунодефицитов и лейкозов животных, совершенствование на их основе мер борьбы при данных инфекциях и обоснование экономической целесообразности внедрения разработок.
С этой целью первоначально был осуществлен сравнительный анализ эффективности серологических и молекулярно-генетических медодов диагностики ретровирусных инфекций животных.
Затем был проведен сравнительный компьютерный анализ геномов возбудителей вирусных иммунодефицитов и лейкозов животных и подбор праймеров на консервативных участках вирусных геномов для разработки ПЦР диагностики инфекций. Сравнение между собой нуклеотидных последовательностей BIV и BLV, размещенных на web-ресурсе NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) было выполнено с помощью программы Blast 2 sequences (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_Query_237855). С целью выявления наиболее консервативного участка генома BIV, полногеномный сиквенс BIV был проанализирован с помощью программы BLAST Conserved Domains (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi). Подбор праймеров на геноме BIV был выполнен в программе GENRUNR version 3.00 (Hastings software, UK).
Разработка и внедрение научно обоснованной системы профилактических и оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота, с учетом вирусного иммунодефицита
При развитии клинических признаков BLV-инфекции в крови животных отмечают резкое снижение количества гемоглобина (в 1,5 раза) и эритроцитов (в 1,7 раза), повышение СОЭ (в 2 раза), тромбоцитопению (на 41 %), лимфоцитоз (на 30 %) с преобладанием незрелых белых кровяных телец, гипоальбуминемию (на 45,4 %) на фоне увеличение уровня общего белка (26,3 %), значительное повышении количества билирубина (в 2,8- 3,5 рааз) и активности щелочной фосфатазы (в 4 раза).
У BIV-инфицированных животных отмечают умеренное повышение СОЭ (в 2,3 раза), лимфопению (в 2 раза), тромбоцитопению (в 2,4 раза), незначительный сдвиг нейтрофильного ядра влево, снижение уровня общего белка (19,2 %) и альбуминов (35,1 %), увеличение активности щелочной фосфатазы (в 2,1 раз), АСТ и АЛТ (в 1,6 и 2 раза, соответственно), повышенное содержание креатинина (в 1,9 раза).
При ретровирусной коинфекции в крови обнаруживают резкое снижение гемоглобина и эритроцитов (в 2,3 раза), количества тромбоцитов (в 5,3 раза), увеличение СОЭ (в 2,7 раза) и удельного содержания лимфоцитов (на 23,8 %) и молодых форм лейкоцитов, умереную базофилию, резкое снижение уровня белка (в 2,5 раза) и активности щелочной фосфатазы (в 4 раза), значительное повышение содержания общего и прямого билирубина (в 3,3 и 5,6 раза, соответственно), мочевины (в 3,2 раза) и креатинина (в 2,1 раза), увеличение активности трансаминаз более чем в 3 раза.
По нашему мнению, базофилы, отвечающие за продуцирование гистамина, будут стимулировать развитие аллергических реакций у BLV носителей и при ретровирусной коинфекции скота, снижая тем самым диагностическую ценность аллергических тестов. Цитопении свидетельствуют о снижении защитных и трофических свойств крови, а уменьшение количества гемоглобина - о гипоксии во всех органах и тканях. Увеличение СОЭ является в данном случае может выступать маркером как развития сопутствующих инфекционно-воспалительных заболеваний, так и поражения почек и печени, эндокринных нарушений. Лейкоцитоз со сдвигом нейтрофильного ядра влево свидетельствует о возникновении острых воспалительных процессов в организме.
Выявленные нами биохимические изменения повышения уровня креатинина в данном случае может свидетельствовать о почечной патологии, а увеличение активности трансаминаз – о воспалительных и деструктивных изменениях в печени. Увеличение количества билирубина так же может присутствовать как маркер гепатита у животного и свидетельствует о гемолитической анемии. Значительное увеличение активности щелочной фосфатазы свидетельствует о патологических состояниях, происходящих в селезенке. Снижение общего белка позволяет нам предполагать о развитии нефротических патологий – выведение белка почками, и, в тоже время, указывает на патологии печени (относительное снижение фракции альбумина).
Полученные нами данные сопоставимы с результатами отечественных и зарубежных исследователей. I. Schwartz с соавт. (2013) сообщают, что примерно у 30 % BLV-инфицированного КРС развивается стойкий лимфоцитоз. Zhang и соавторы (1997) наблюдали уменьшение СД4/СД8 соотношения и возросшую пролиферацию лимфоцитов уже через 2-6 недель после заражения телят BIV. По данным S Carpenter с соавт. (1992) у телят, искусственно зараженных BIV, через 5-15 дней в крови обнаруживалась нейтропения, которая усугублялась через 4 недели после заражения. Исследования Пономаревой И.С. (2012) подтверждают наши данные, что гематологические показатели коров в условиях инфекционного процесса характеризуются лейкоцитозом, анемией и тромбоцитопенией. Наши данные коррелируют с результатами исследований Гизатуллина И.А. (2014) и Пономаревой И.С. (2012), которые свидетельствуют, что в крови КРС при BLV-инфекции и коров с гематологическими изменениями, обнаруживают достоверные сдвиги биохимических показателей: гиперпротеинемия при снижении количества глобулинов и альбуминов, повышение уровня щелочной фосфатазы, креатинина и АЛТ.
Таким образом, результаты наших исследований показывают, что вирусные лейкоз и иммунодефицит крупного рогатого скота, как в моноинфекции, так и в форме коинфекции, сопровождаются значительными и многообразными изменениями морфологических и биохимических показателей крови. Это свидетельствует об изменении метаболических и реактивных свойств организма.
Морфометрические и биофизические характеристики лимфоцитов BIV-и BLV- инфицированного крупного рогатого скота
АСМ-сканирование является эффективным методом изучения мембраны и подмембранных структур лимфоцитов. К таким структурам, в первую очередь, относится цитоскелет. Лимфоциты характеризуются хорошо выраженным цитоскелетом: микротрубочками, промежуточными виментиновыми филаментами и микрофиламентами. Микрофиламенты не только пучками или поодиночке лежат в цитоплазме, но и образуют зону сгущения под плазмолеммой - кортикальную сеть, прикрепляясь к ней при помощи интегральных белков. Главное ее функциональное назначение -предотвращение резкой деформации клетки при внешнем механическом воздействии. Микрофиламенты так же участвуют в процессах адгезии лимфоцитов.
Предварительные данные показали, что метод АСМ-сканирования лимфоцитарной цитолеммы позволяет получить данные характеризующие не только морфологические параметры, но и функциональное состояние клетки. Нами были установлены достоверные различия мембран опухолевых и здоровых клеток. Это позволяет нам предположить, что сравнение АСМ профиля лимфоцитов, инфицированных ретровирусами животных и не инфицированных, будет иметь важное фундаментальное значение при понимании механизмов, развивающихся в инфицированной клетке и прикладное значение, как арбитражный метод при сравнительном анализе существующих методов лабораторной диагностики ретровирусных инфекций животных.
С целью изучение в сравнительном аспекте структурно функционального состояния цитоскелета лимфоцитов, здоровых и инфицированных вирусами лейкемии и иммунодефицита животных, мы использовали метод полуконтактного АСМ сканирования фиксированных лимфоцитов периферической крови здоровых и зараженных животных.