Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Экология медоносной пчелы (Apis mellifera L.) и пчелиной семьи 11
1.2 Влияние тяжелых металлов и радиации на качество продукции пчеловодства 17
1.3 Основные микозы пчел, факторы их распространения, индикация и идентификация возбудителей 21
2 Основная часть 34
2.1 Материалы и методы исследования 34
2.2 Результаты собственных исследований 44
2.2.1 Ветеринарно-санитарная оценка территории Республики Замбия 44
2.2.1.1 Экологическая характеристика исследуемых районов 44
2.2.1.2 Уровень загрязнения почв и донных отложений выбросами горнодобывающих предприятий (тяжелые металлы и мышьяк) 51
2.2.1.3 Аккумуляция тяжелых металлов в термитниках загрязненных территорий 65
2.2.1.4 Пространственное распределение уровня радиоактивности почв на территории Республики Замбия 70
2.2.2 Разработка ускоренной дифференциальной диагностики микозов пчел и индикации и идентификации их возбудителей 74
2.2.2.1 Выделение культуры грибов из патматериала для сравнительного анализа классического и разрабатываемого методов индикации 74
2.2.2.2 Конструирование специфических праймеров возбудителей микозов 76
2.2.2.3 Биоинформационный анализ сконструированных праймеров 79
2.2.2.4 Оптимизация условий ПЦР для дифференциальной индикации возбудителей аспергиллеза и аскосфероза 83
Заключение 95
Список сокращений 101
Список литературы 103
- Основные микозы пчел, факторы их распространения, индикация и идентификация возбудителей
- Ветеринарно-санитарная оценка территории Республики Замбия
- Аккумуляция тяжелых металлов в термитниках загрязненных территорий
- Выделение культуры грибов из патматериала для сравнительного анализа классического и разрабатываемого методов индикации
Основные микозы пчел, факторы их распространения, индикация и идентификация возбудителей
Африканский подвид Apis mellifera scutellata Lepeletier встречается в восточно-южной части Африки, а также в центральной Америки и является восточно-африканской медоносной пчелой [158]. Яд пчел этого подвида не сильнее и не ядовитее, чем яд других пчел, но особенность их в том, что, защищаясь или нападая на свою жертву, она жалит не один раз, как большинство пчел, а многократно. Их жало не имеет сильно выраженных зазубрин, пчела легко вынимает его из тела жертвы. В остальном, Apis mellifera scutellata Lepeletier схожа со всеми другими пчелами. Эти пчелы живут семьями, в которых наблюдаются сложные взаимоотношения. В каждой семье выделяется матка, несколько сотней самцов – трутней и несколько тысяч рабочих пчел (недоразвитых в половом отношении самок). Рабочие пчелы собирают цветочный нектар и пыльцу, которые накапливаются на голенях задних ножек и заносятся в улья. На брюшке рабочей пчелы имеются воскоотделительные железы, от которых выделяется воск, из воска строятся соты. Для диких пчел, живущих в лесу, эти железы играют большую роль в получении строительного материала.
Наряду с переходом к питанию нектаром и пыльцой, у которой разнообразный состав, у большинства представителей жалящих перепончатокрылых (Aculeata) произошла прогрессивная эволюция и развитие общественных инстинктов. Сюда можно отнести совершенствование способов защиты гнезда, морфофункциональная дифференциация особей, постепенное усиление контакта с потомством и заботы о нем и т.д. Пчелиная семья выделяется своим составом и организацией [85]. Полиморфизм медоносной пчелы отражается на фоне всего надкласса насекомых своей высокой организацией. В состав пчелиной семьи по выполняемой функции входят две стазы женского пола: матка, основной функцией которой является откладывание яиц, рабочие пчелы, которые играют большую роль в поддержании всей семьи, летают за сбором нектара, защищают улья, кормят матку и ухаживают за ней, ухаживают за отложенными яйцами и т.д. В сообществе медоносной пчелы существуют также мужские особи – трутни. Трутни в ульях никакой роли не играют. По строению тела и по размеру они довольно большие по сравнению с другими рабочими пчелами [92]. Они выполняют оплодотворительную функцию вне улья, летают на встречу с не оплодотворенными матками. Сообщество медоносной пчелы рассматривается в качестве семьи потому, что рабочие пчелы и трутни развиваются из яйц, отложенных маткой. В пчелиной семье, как правило, существуют одна матка, несколько десятков тысяч рабочих пчел и несколько сотен трутней. В течение года, состав пчелиной семьи сильно меняется в зависимости от экологических факторов, таких как температура, экологические условия, наличие корма в природе. Семьи пчел интенсивно развиваются в весенне-летний период при благоприятных условиях, появляется расплод, то есть совокупность развивающих яиц, личинок и куколок [47].
К концу лета – началу осени рост семьи замедляется, а зимой развитие вообще не наблюдается. Только в весенне-летнем периоде число пчел в одной семье может расти от нескольких десяток тысяч до сотен тысяч при наличии корма и благоприятных условий среды. Условия внешней среды определяют этапы развития пчелиной семьи. Среди экологических факторов, влияющих на развитие пчелиной семьи, выделяются и климатические. В тропической зоне, где вегетационный период продолжается круглый год, в течение всего года, рабочие пчелы собирают нектар и пыльцу. У пчелиных семей резко выраженных сезонных явлений не наблюдается. Однако, в условиях умеренного климата, в связи с изменениями во внешней среде, меняется, и характер жизнедеятельности внутри пчелиной семьи. В условиях умеренного климата можно выделить два периода. Первый, период активной деятельности, когда пчелиные семьи собирают и перерабатывают корм, создают запасы пищи, размножаются и воспитывают расплод. Второй, период относительного осенне-зимнего покоя, когда пчелиная семья живет за счет запасов, накопленных во время активного периода, не собирает пищу, не размножается. Период активной деятельности начинается с первым весенним облетом, когда пчела начинает собирать нектар и пыльцу с ране цветущих растений, после чего резко увеличивается яйценоскость матки и, соответственно, в гнезде увеличивается количество расплода, так как пчелиные семьи начинают получать новый свежий корм, богатый белком, ферментами и углеводом, стимулирующие откладку маткой яиц [95; 131]. В течение первых 3-4 недель активного периода старые пчелы, вышедшие из зимовки, погибают и их заменяют молодые (не только по календарному возрасту, но и по физиологическому состоянию). За это время количество пчел в семье, как правило, не увеличивается, но происходят важные качественные изменения в ее составе, после чего начинается интенсивный рост чисел пчел в каждой семье. Процент рождаемости в каждой пчелиной семье становится намного выше смертельности. Усиленными темпами возрастает численность пчелиных семей, активность пчел повышается, возрастает количество расплода (откладываемых маткой яиц, личинок и куколок). Важным является наличие в природе хорошего медосбора, то есть цветковых растений, с которых рабочие пчелы собирают нектар и пыльцу и вырабатывают высокопитательный и качественный мед [14]. Отсутствие хорошего источника питательных кормов приводит к образованию в семье многочисленных групп разновозрастных пчел, которые не выполняют свои функции, что приводит к снижению напряженности семьи в ульях и таким образом возникает инстинкт роения. В периоде роения продуктивная деятельность пчелиных семей уменьшается, вылет пчел за сбором нектара и пыльцы сокращается, выделение воска пчелами также сокращается, матка намного меньше откладывает яиц, пчелы прекращают строить соты и сидят под рамками и на них без действия. В период активной деятельности, большое значение имеет сбор кормов, накопление их запасов на зиму и конечно обеспечение пчеловода медом.
В ульях сильных пчелиных семей ведется интенсивная работа. В их организмах происходит интенсивный обмен веществ и энергии. При благоприятных условиях за один день сильная пчелиная семья может собрать около 12 кг нектара и больше. Известны даже случаи, когда прирост массы контрольного улья за день достигал 24 кг на Дальнем Востоке. Сильная пчелиная семья при хороших условиях, массой 6-8 кг при хорошей кормовой базе, за время главного медосбора может собрать до 100 – 150 кг меда. Мед, перга, прополис, воск и другие продукты пчеловодства используются для разных целей в развитии пчелиной семьи, в том числе могут быть использованы в качестве биоиндикаторов радиоактивного загрязнения окружающей среды [3]. Перга или пчелиный хлеб представляет собой пыльцу-обножку, собранную пчелами с цветков растений, сложенную и утрамбованную в соты, залитая сверху медом. Пчелы используют прополис для замазывания щелей, отверстий в улье, и таким образом защищают его от сквозняков и сохраняют в нем особый микроклимат. Прополис имеет сложный химический состав. Он состоит из воска, смол, бальзамов, эфирных масел и цветочной пыльцы [151].
Ветеринарно-санитарная оценка территории Республики Замбия
Для определения параметров сконструированных нуклеотидных последовательностей использовали «Олиго Кальк: Программа для расчёта свойств олигонуклеотидов (праймеров)» [74].
В процессе использования поисковой базы данных изучали видовое и штаммовое разнообразие грибов родов Aspergillus и Ascosphaera. Для выявления степени совпадений с искомыми и нежелательными организмами использовали программу BLASTIN 2.2.30+ [110], доступную он-лайн на сайте NCBI [167]. Выделение ДНК и постановка полимеразно-цепной реакции.
Материалом для исследования являлись образцы пчел и продуктов пчеловодства. Работа проводилась в ламинарном боксе. В начале все пчелы и личинки размельчали на мелкие кусочки диаметром 0,5 мкм, которые вносили в пробирки объёмом 1,5 мл по 0,5 мг после взвешивания. К исследуемым материалам в каждую пробирку добавляли 200 мкл лизирующего раствора. В пробирку для отрицательного контроля вносили только 50 мкл стерильного физиологического раствора. Через 7-10 мин, каждую пробирку встряхивали на вортексе в течение 3-5 с и переносили надосодочную жидкость в новые пробирки объемом 1,5 мл. Дальше в каждую пробирку добавляли 20 мкл предварительно ресуспендированного сорбента. Плотно закрывали крышки пробирок и встряхивали на вортексе в течение 3-5 с. Дальше пробы инкубировали в термостате в течение 20 мин при 50С. После инкубации проводили серии промывок осадка общепринятыми методами. Затем пробирки помещали в термостат, открывали крышки и высушивали осадок при 50С в течение 5 мин. После высушивания к осадку добавляли по 300 мкл элюирующего раствора, встряхивали их на вортексе в течение 5-10 с и прогревали в термостате при 50С в течение 5 мин. Надосадочную жидкость, содержащую ДНК, переносили в чистые стерильные пробирки.
ПЦР ставили в режиме реального времени по общепринятой методике. Детекцию проводили используя амплификаторы «ДТ-322» и «DTlite-4». Статистическая обработка результатов исследований. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 8.0. Для вычисления средних значений выходных сигналов и проверки приемлемости выходных сигналов при исследовании методом абсорбционной спектрометрии использовали формулу: где Аід - концентрация рабочих градуировочных растворов, -концентрация фонового раствора, Кв - норматив предела повторяемости выходных сигналов, равный 10%. Градировочные характеристики устанавливали с помощью персонального компьютера (коэффициент корреляции не менее 0,98).
Для вычисления массовой доли определяемого химического элемента в анализируемой пробе (почве, донных отложениях, термитниках, термитах, растениях, меде и пчелах) по отдельно взятому определению (Xi), млн"1 использовали следующую формулу: где, Сш - массовая концентрация элемента в анализируемом растворе (параллельные определения), найденная по градуировочной характеристике, мг/дм3;
На устойчивое развитие пчеловодства, несомненно, будут оказывать экологические условия территорий, где будут располагаться пасеки. В отношении Замбии это особенно связано с антропогенными загрязнениями, как результат широко развитой в этой стране горнодобывающей промышленности.
Территория Замбии разделена на 9 провинций, которые представлены различными природными богатствами. Богатая флора лесных массивов Замбии создает предпосылки развития отрасли пчеловодства в этом регионе с устойчивым лесопользованием, но пчеловодство до сих пор остается неразвито. Медоносы широко представлены такими источниками нектара, как растения родов Брахистегия, Джулбернардия и Изоберлиния подсемейства Цезальпиниевые, семейства Бобовые, которые предпочитают дикие пчелы [132].
Согласно данным TopGlobus [79] климат в Замбии тропический, сезон дождей длится с октября по ноябрь; периодическая засуха и тропические штормы длятся с ноября по апрель. Ландшафт в основном представлен высоким плоскогорьем, имеются холмы и горы. Страна богата природными ресурсами, такими как медь, кобальт, цинк, свинец, каменный уголь, изумруды, золото, серебро, уран, гидроэнергетические ресурсы. Проблемы окружающей среды заключаются в загрязнении воздуха в районе разработок месторождений полезных ископаемых и их переработки, появление новых металлургических заводов, что приводит к выпадению кислотных дождей; вырубке лесов; эрозии почв; опустынивании. Замбия имеет международные соглашения по окружающей среде: Биоразнообразие, Изменение климата, Киотский протокол, Опустынивание, Исчезающие виды, Опасные отходы, Морское право, Запрет ядерных испытании, Защита озонового слоя, Водно-болотные угодья, которые подписаны, но не ратифицированы.
Аккумуляция тяжелых металлов в термитниках загрязненных территорий
По территории Анголы река течет также по индустриально малоразвитым районам провинции Мошико, в частности по территории Национального парка Камея. Река течет по узкой длинной полосе одноименной области Замбези (до 2013г область называлась Каприви), Намибия, и вблизи населенного пункта сельского типа Казунгула, СевероЗападный округ Ботсваны, территории которых нельзя назвать промышленно развитыми. Дальше правый берег реки Замбези принадлежит провинциям Зимбабве – Северный Матабилент и Западный Машоналенд, экономика которых в основном связана с туристическим бизнесом.
Остается открытым вопрос причины загрязнения верховья реки Замбези тяжелыми металлами. Возможно, это вызвано геологическими особенностями среды, а высокие уровни содержания Co и Cu в донных отложениях не связаны с антропогенным загрязнением.
Нашими исследованиями установлено, что коэффициент накопления кобальта и меди в донных отложениях устья реки Кафуэ составил 3,7 и 6,0, соответственно, что указывает на загрязнение воды отходами горнодобывающих предприятий провинции Коппербелт. Это, несомненно, влияет и на загрязнение реки Замбези, в которую впадает река Кафуэ. Помимо кобальта (50,85±30,95 мг/кг) и меди (2264,53±879,08 мг/кг) в донных отложениях реки Кафуэ были выявлены хром – 3,78±1,38 мг/кг, никель – 20,90±6,66 мг/кг и железо – 12168,35±2383,39 мг/кг.
Таким образом, нашими исследованиями подтверждается существование экологической проблемы, связанной с загрязнением реки Кафуэ, что особенно проявляется в кумуляции меди и кобальта в донных отложениях. 2.2.1.3 Аккумуляция тяжелых металлов в термитниках загрязненных территорий Биогенные компоненты окружающей среды могут быть хорошими индикаторами ее загрязнения благодаря их выраженной кумулятивной способности. Как и другие насекомые, термиты биоаккумулируют основные металлы для укрепления кутикулярных структур. Сотрудники австралийского Государственного объединения научных и прикладных исследований (Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation, CSIRO) [168] установили, что у термитов Tumulitermes tumuli пропорционально высокие концентрации Mn в нижней челюсти, а Мальпигиевы трубы значительно обогащены Zn (1,6%), Mg (4,9%), P (6,8%), Ca (2,7%) и K (2,4%).
Ученые Копенгагенского университета [120] провели исследования по определению содержания железа, цинка и кальция в тканях и органах различных насекомых, обычно употребляемых в пищу народом луо в Кении. Было выявлено содержание железа в диапазоне до 1562 мг/100г сухого вещества, цинка до 25 мг/100г, кальция до 341 мг/100г у пяти различных насекомых: один вид муравьев (onyoso mammon), три вида термитов (oyala, ogawo и agaor), один вид сверчков (onjiri mammon). Ученые-эпидемиологи сделали вывод, что употребление в пищу насекомых может оказаться важным элементом для борьбы с болезнями населения, связанными с дефицитом железа и цинка, в развивающихся странах.
Ученые Института органической химии и биохимии Академии наук Чешской Республики (г.Прага, Чехия) [165] обнаружили и доказали, что рабочие термиты Neocapritermes taracua развивают необыкновенный двухкомпонентный суицидальный аппарат, состоящий из медьсодержащих белковых кристаллов, хранящийся в наружных сумках и внутренних слюнных железах. Во время агрессивных столкновений их тела разрываются, а кристаллы вступают в реакцию с секретом слюнной железы и таким образом образуется токсическая капля. Как количество оборонительных веществ, так и готовность к взрыву увеличиваются с возрастом рабочей особи, по мере снижения их способности к сбору пищи.
Ученые Sri Venkateswara University (г.Тирупати, штат Андхра-Прадеш, Индия) [116] указывают, что термитники являются обильными компонентами окружающей среды Tummalapalle, области уранового оруднения в индийском округе Каддапа. Они выявили урановые скопления в термитниках в концентрациях 10-36 мг/кг, а биогеохимический параметр (коэффициент биологического поглощения) термитников указывает на тот факт, что термитники содержат во много раз превышающее количество химических элементов, по сравнению с прилегающими землями.
Наши исследования подтвердили аккумулятивные способности термитов, а накопительные особенности термитников могут использоваться не только как указатели месторождений отдельных элементов, что применительно в геологических разведках, но и как биоиндикаторы загрязнения окружающей среды.
Один из факторов, влияющих на накопление тяжелых металлов в теле пчелы, представляет собой расстояние от дорог и разных металлургических заводов до места расположения пасек [160].
В организме пчел накапливаются также разные тяжелые металлы, особое внимание уделяется свинцу и кадмию, часто встречаемых в избытке в организмах медоносной пчелы [26; 27]. Собирая нектар с медоносной растительности, пчелы могут перехватывать вместе с нектаром и пыльцой, определенное количество тяжелых металлов, например свинца, кадмия и других, которые накапливаются в разных частях медоносной растительности [25].
Выделение культуры грибов из патматериала для сравнительного анализа классического и разрабатываемого методов индикации
Проект «Пчеловодство для снижения уровня бедности», финансируемый Transformation Business Network, заключается в расширении отрасли пчеловодства на территории Республики Замбия. Учитывая тропический климат в стране, с ее богатой флорой лесных массивов, создаются предпосылки развития отрасли пчеловодства в этом регионе с устойчивым лесопользованием. Кормовая база широко представлена массивами медоносов, такими как растения родов Брахистегия, Джулбернардия и Изоберлиния подсемейства Цезальпиниевые, семейства Бобовые и другие, которые предпочитают дикие пчелы. Популяция диких пчел, имеющая довольно большую плотность в Замбии, вполне может быть использована как биоресурс для развития пчеловодства в стране. Однако при разработке плана размещения пасек следует учитывать тот факт, что окружающая среда некоторых районов Замбии подвергается загрязнению выбросами рудных проявлений и горнодобывающей промышленности. Миграция тяжелых металлов и других поллютантов и ксенобиотиков по трофическим цепям почва-растения-пчелы-продукты пчеловодства представляет серьезную опасность и для человека, как потребителя продуктов пчеловодства. Кроме того повышенный уровень полиметаллического загрязнения существенно снижает резистентность медоносных пчел к инфекционным заболеваниям, летную активность, медовую продуктивность, что в конечном счете может привести к снижению эффективности пчеловодства, как важной отрасли сельского хозяйства.
В ходе наших исследований территорий 4-х провинций Республики Замбия установлен повышенный уровень техногенной нагрузки и естественно-фоновых значений содержания ряда тяжелых металлов в почвах таких районов как Китве, Чилилабомбве и Калулуши провинции Коппербелт, а также Ливингстон и Сиавонга провинции Южная, что указывает на неблагоприятные условия для размещения пасек на этих территориях. Немаловажное значение имеет и радиационный фон территорий, на которых пчелы собирают нектар. При радиоактивном загрязнении окружающей среды вместе с пыльцой пчела переносит на себе множество радиоактивных частиц и соответственно вносит их в улей. Миграция радионуклидов идет по цепочке почва - медоносные растения - мед, обножка - пищеварительный аппарат личинки - кал личинки - соты. Суммарная радиация сильно возрастает из-за аккумуляции радиоактивных изотопов в перге, что приводит к возникновению мощных ионизирующих излучений в пчелином гнезде. Следовательно, нужно учитывать эти факторы при ветеринарно-санитарной оценке территорий, где планируется размещение пасек. Нашими исследованиями установлено, что на территории Республики Замбия общий фон оценивается в пределах от 0,1 Бк/кг до 2,7 Бк/кг для -излучений и от 0,02 Бк/кг до 2 Бк/кг для -излучений, что не выходит за пределы общего фона планеты Земля. При оценке суммарной альфа- и бета-активности выявлено отсутствие цезия137 на территории исследуемых районов Республики Замбия.
Биогенные компоненты окружающей среды могут быть хорошими индикаторами ее загрязнения благодаря их выраженной кумулятивной способности. Наши модельные эксперименты по энтомоиндикации показали высокие кумулятивные свойства организмов термитов на территории Республики Замбия, что раскрывает потенциал их использования в качестве биоиндикаторов загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами, особенно в условиях загрязнения выбросами рудных проявлений и горнодобывающей промышленности. Было установлено, что термитники как биогенные образования окружающей среды Африки, в частности в Республике Замбия, обладают биоиндикаторными признаками загрязнения тяжелыми металлами, что связано с их высокой аккумулирующей способностью – содержание тяжелых металлов в термитниках было в 1,5-165 раз выше, чем в почвах. Полученные данные могут быть использованы в качестве критериев оценки состояния окружающей среды при проведении ветеринарно-санитарных мероприятий, разработке средств и методов реабилитации загрязненных территорий для развития различных отраслей сельского хозяйства, в т.ч. пчеловодства.
С другой стороны, серьезный экономический ущерб пчеловодству причиняют микозы пчел. В связи с чем, своевременная ранняя индикация и дифференциация их возбудителей является основополагающим инструментом эффективных мер борьбы с этими заболеваниями. Используемые в настоящее время средства для этих целей недостаточно эффективны из-за высокой трудоемкости, длительности постановки точного диагноза, разнообразия микрофлоры в объектах окружающей среды и ветеринарно-санитарного надзора, разнообразия штаммов возбудителей, различий в клинических проявлениях заболеваний и т.д.
Основными возбудителями микозов пчел являются представители грибов рода Ascosphaera – A.apis и рода Aspergillus – A.fumigatus, A.niger и A.flavus. Разные подходы в профилактике, лечении и мерах борьбы с заболеваниями, вызываемыми этими возбудителями, требуют создания ускоренных средств их индикации и идентификации. Наиболее перспективным средством для этих целей являются молекулярно-биологические методы, а именно ПЦР. Высокая диагностическая эффективность ПЦР достигается за счет использования праймеров, специфичных для разнообразных штаммов возбудителей.