Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Усовершенствование методов получения антигена вируса африканской чумы свиней для серологических исследований Шарыпова Дарья Викторовна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Шарыпова Дарья Викторовна. Усовершенствование методов получения антигена вируса африканской чумы свиней для серологических исследований: диссертация ... кандидата Ветеринарных наук: 06.02.02 / Шарыпова Дарья Викторовна;[Место защиты: ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»], 2019.- 123 с.

Содержание к диссертации

Введение

2. Обзор литературы 13

2.1 Историческая справка 13

2.2. Эпизоотология африканской чумы свиней и эпизоотическая ситуация в РФ 15

2.3 Структура вириона 18

2.4 Свойства и функции основных диагностически значимых белков вируса АЧС 19

2.5 Культивирование вируса АЧС 23

2.6 Серологические методы диагностики АЧС 27

2.7 Экспресс-диагностика при АЧС 31

2.8 Заключение по обзору литературы 33

3. Собственные исследования 35

3.1. Материалы 35

3.2 Методы 38

4. Результаты собственных исследований 41

4.1 Изучение репродукционных свойств вируса АЧС изолята «Одинцово 02/14» в первичных культурах клеток. 41

4.2 Адаптация вируса АЧС к перевиваемой культуре клеток и изучение его культурально-биологических свойств. 45

4.2.1 Обоснование подбора изолята для адаптации вируса. 45

4.2.2 Обоснование подбора культуры клеток. Адаптация вируса 47

4.3 Изучение биологических свойств адаптированного штамма вируса 52

4.4 Получение типоспецифической гипериммунной сыворотки крови 55

4.5 Определение сероиммунотиповой принадлежности штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1». 56

4.6 Определение генетической принадлежности штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» при нуклеотидном секвенировании 58

4.7 Получение антигена на основе вируса АЧС штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1». 60

4.8 Использование культурального антигена для постановки иммуноблоттинга. Отработка и оптимизация условий постановки реакции 65

4.8.1 Определение рабочего разведения цитоплазматического растворимого вирусного антигена 65

4.8.2 Подбор режима и условий проведения электрофореза 66

4.8.3 Определение режима электропереноса белков на нитроцеллюлозную мембрану 68

4.8.4 Подбор оптимальных параметров постановки реакции иммуноблоттинга 68

4.9 Отработка условий изготовления иммунострипов 70

4.10 Определение основных валидационных характеристик метода иммуноблоттинга 74

4.11. Комиссионные испытания метода 76

4.12 Использование штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» и полученного на его основе культурального антигена вируса АЧС для серологических тестов 79

4.12.1 Реакция непрямой иммунофлуоресценции 79

4.12.2 Иммунопероксидазный монослойный анализ 82

4.12.3 Реакция агглютинации латекса 85

5. Заключение 96

5.1 Выводы 99

5.2 Практические предложения 100

5.3 Перспективы дальнейшей разработки темы 100

6. Список сокращений 101

7. Список использованной литературы 103

8. Приложения 119

Культивирование вируса АЧС

На данном этапе развития серологической диагностики АЧС разработаны наборы и тест-системы на основе как рекомбинантных белков, так и культурального антигена.

Для получения достаточной концентрации антигена в культуральном препарате вирус должен эффективно репродуцироваться и накапливаться в клеточных культурах.

Многими исследователями установлено, что первичные культуры клеток лейкоцитов свиней (ЛС), костного мозга свиней (КМС), альвеолярных макрофагов свиней (АМС) обладают высокой чувствительностью к вирусу АЧС, размножение вируса в которых сопровождается появлением гемадсорбции и цитопатического действия. В указанных первичных культурах клеток вирус репродуцируется без предварительной адаптации [74, 75, 86, 97, 106, 112, 141], вследствие этого они широко используются для постановки реакции гемадсорбции, применяемой при диагностике, титровании вируса и серотипировании изолятов.

Однако существуют такие изоляты вируса АЧС, которые не обладают гемадсорбирующими свойствами. Так, негемадсорбирующие варианты вируса были выделены в ЮАР от домашних свиней и аргасовых клещей О. moubata, собранных в очагах инфекции. [100, 116, 117] Также несколько штаммов вируса, выделенных в Португалии из легких свиней при хронической пневмонии, не имели гемадсорбирующих свойств и, даже, при пассировании не менее 50 раз в первичной культуре клеток гемадсорбция не восстанавливалась [63].

Несмотря на широкое применение первичных культур клеток, их получение является дорогостоящим, сложным и трудоемким технологическим процессом, а их свойства: стабильность, жизнеспособность и чувствительность во многом зависят от свиней-доноров. Эти недостатки затрудняют стандартизацию получаемого вирусного сырья и, тем самым, усложняют получение стандартного культурального антигена, требуемого для серологической диагностики.

Ввиду вышеуказанного, учеными проводились многочисленные исследования по адаптации вируса АЧС к росту в гетерологичных культуральных системах и анализу возможности культивирования в них вируса АЧС [17]. Так, достоверно показано, что клетки крупного и мелкого рогатого скота и птиц не чувствительны к вирусу АЧС.

Для изучения биологических и молекулярно-генетических свойств, получения аттенуированных вариантов вируса, а также достаточных объемов вируссодержащего материала проведено множество опытов по адаптации ряда штаммов вируса АЧС к репродукции в перевиваемых культурах клеток. В 1962 году W. Malmquist адаптировал вирус АЧС штамма Hinde к репродукции в перевиваемой линии клеток почки поросенка. Сначала было проведено 13 последовательных слепых пассажей, при этом никаких деструктивных изменений в этой культуре вирус не вызывал.

Цитопатогенное действие было обнаружено во втором пассаже лишь после длительной инкубации (81 день), в следующем пассаже оно наступило через 45 дней после заражения, а в 18-ом пассаже – через 6 дней. С увеличением количества пассажей необходимое для проявления цитопатогенного действия время инкубации культур сократилось до 72 часов. Адаптированный вирус не утратил гемадсорбирующую способность. После проведения одного пассажа на свинье вирус терял свойство вызывать цитопатогенные изменения в культуре клеток почки свиньи, но после проведения нескольких пассажей на культуре клеток вновь наблюдали деструктивные изменения.

При этом с увеличением количества пассажей у адаптируемого вируса наблюдали снижение патогенности для свиней. Вирус 75-го пассажа и выше не вызывал реакции на введение вируссодержащего препарата [107].

Положительные результаты опытов по адаптации вируса к линии клеток PK – 2a послужили толчком к изучению чувствительности к вирусу АЧС перевиваемых культур клеток, в том числе гетерологичных в видовом отношении [70, 119].

Работы по изучению изменений биологических свойств вируса АЧС в процессе его пассирования в перевиваемых культурах клеток позволили испанским и португальским исследователям в 1962-1963 годах получить аттенуированные штаммы вируса АЧС «1455» и «L», иммунизация которыми в лабораторных условиях защищала свиней от заболевания при контрольном заражении полевым, высоковирулентным изолятом.

Однако, широкое применении в практике полученных аттенуированных вариантов возбудителя в качестве живой аттенуированной вакцины, в условиях высокой плотности чувствительных животных на эндемичной по данному заболеванию территории, привело к реверсии вирулентных свойств возбудителя.

Появление новых вариантов вируса АЧС обусловлено его высокой мутабельностью и рекомбинационной активностью, что при коинфекцировании привело к увеличению неблагополучных пунктов в 3 – 6 раз и повышению процента поствакцинальных осложнений с отдаленной гибелью от 10 до 50% [115].

Благодаря работам по адаптации вируса к репродукции в перевиваемых культурах клеток отечественными учеными во ВНИИВВиМ получены аттенуированные штаммы и гипериммунные специфические сыворотки, использование которых позволило изучить и дифференцировать исследуемые изоляты и штаммы, а также установить серотиповой характер иммунитета к вирусу АЧС [11, 14, 15, 36].

В 2013 году сотрудниками ВНИИВВиМ были проведены исследования по адаптации к репродукции в перевиваемых культурах клеток ПСГК-60, ППК-66б, CV-1 и А4С2/9к. В результате получены адаптированные к репродукции в указанных перевиваемых культурах клеток культуральные варианты вируса АЧС штамма «Ставрополь 01/08», обладающие способностью вызывать гемадсорбцию и являющиеся авирулентными для свиней [28].

В результате исследований, проведенных в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2014 году получен вариант вируса АЧС - изолят «Krasnodar 06/12», адаптированный к репродукции в перевиваемой культуре клеток CV-1. К 52-му последовательному пассажу уровень накопления вируса достигал 7,0 lg ГАдЕ50/см3, при репродукции в клетках CV-1 в течение 5-6 суток. В результате пассирования вируса характер гемадсорбции изменился от плотной (более 40 эритроцитов на клетку) до рыхлой (10-20) [4].

Результаты изучения биологических свойств адаптированного изолята «Krasnodar 06/12» соответствовали сформированному «градиенту» вирулентных/гемадсорбирующих свойств и «постулированному» Макаровым В.В. с соавторами генетическому контролю экспрессии гемадсорбирующего антигена, то есть, адаптированный изолят при репродукции в культуре ККМС индуцировал появление рыхлой гемадсорбции и не вызывал гибели свиней в течение 30 суток (срок наблюдения) [27].

Обоснование подбора культуры клеток. Адаптация вируса

Для первичного тестирования способности вируса АЧС штамма «8 №2/Одинцово-02/14» к репродукции в перевиваемых культурах клеток, а также подбора оптимальной культуры клеток для адаптации данного штамма использовали клеточную линию СП, не являющейся пермиссивной для вируса АЧС.

Вируссодержащим материалом штамма «8 №2/Одинцово-02/14», накопленным на культуре клеток КМС в титре 5,21 ± 0,36 lg ГАдЕ50/см3, была инокулирована первичная культура клеток СП в соотношении 1:10 (v/v), в которой впоследствии проведено 15 последовательных пассажей. Причем, следует отметить, что эффективная репродукция вируса АЧС в культуре клеток СП регистрировалась с первого пассажа с проявлением феномена гемадсорбции. Результаты экспериментов приведены в таблице 2.

Как видно из результатов, приведенных в таблице 2, в процессе пассирования в культуре клеток СП к 15 пассажу существенно увеличились титры накопления до 7,5-8,0 lg ГАдЕ50/см3, а сроки накопления сократились с 10 до 5-6 суток.

Ввиду того, что штамм «8 №2/Одинцово-02/14» эффективно репродуцировался в культуре клеток СП, дальнейшая работа по адаптации вируса этого штамма к росту в перевиваемых культурах клеток была продолжена с различными линиями клеток, как гомологичными, так и гетерологичными в видовом отношении. Не смотря на положительную динамику адаптации вируса к культуре клеток СП, она является первичной. Для ее изготовления используют внутренние органы свиней, поэтому такая культура клеток не всегда стандартна и может иметь посторонние примеси или быть контаминирована другими вирусами и бактериями, а длительное пассирование в ней вируса не гарантирует чистоты эксперимента. В связи с этим, для дальнейшей работы с перевиваемыми культурами клеток использовали исходный материал.

В перевиваемые культуры клеток А4С2, CV-1, PK-15 и Marc-145 были инокулированы в соотношении 1:10 (v/v) вируссодержащий материал 3 пассажа на культуре клеток КМС штамма «8 №2/Одинцово-02/14» с титром накопления 7,21±0,36 lg ГАдЕ50/см3.

В тех случаях, когда ЦПД не наблюдали, проводили следующий «слепой» пассаж. В дальнейшем время пассирования зависело от сроков появления ЦПД. Наличие жизнеспособного вируса в инокуляте проверяли заражением культуры АМС или ККМС вируссодержащей суспензией предыдущего пассажа также в соотношении 1:10 (v/v).

При адаптации к культурам клеток CV-1 и РК-15 гемадсорбция и умеренные цитопатические изменения наблюдались уже на первом пассаже на 7-14 сутки, в то время как в культурах клеток Marc-145 и A4C2 до проявления ЦПД пришлось провести 7 и 5 слепых пассажей, соответственно.

Также на каждом пятом пассаже проведен анализ уровня накопления вируса с помощью титрования в культуре клеток КМС. Результаты данного анализа приведены в таблице 3.

Полученные данные (таблица 3), свидетельствуют о том, что в результате адаптации вирус АЧС штамма «8 №2/Одинцово-02/14» приобрел способность к репродукции в перевиваемых культурах клеток А4С2, CV-1, PK-15 и Marc-145. Причем, максимальная степень адаптации наблюдалась в культурах клеток А4С2 и CV-1, где титры накопления вируса превышали значения 7,0 lg ГАдЕ50/см3.

Культура клеток РК-15 имела очень ограниченную продолжительность жизни in vitro, ввиду этого не представилось возможным сделать достоверный вывод об уровне адаптации и накопления вируса. Уровень адаптации к культуре клеток Marc-145 на 15-ом пассаже был незначительно ниже, чем к культуре клеток CV-1. Однако, во время адаптации приходилось дважды возвращаться к предыдущему пассажу из-за отсутствия репродукции вируса, вследствие чего количество пассажей, проведенных в культуре клеток Marc-145 было значительно меньше, чем в остальных культурах.

При изучении изменений характера наблюдаемой гемадсорбции отмечалось стабильное наличие рыхлой гемадсорбции у адаптированного вируса на различных пассажных уровнях (рисунок 12).

В результате экспериментов в культурах клеток А4С2 и CV-1 наблюдались наилучшие показателями степени адаптации и накопления вируса. А4С2 – гибрид почки эмбриона свиньи и спленоцитов свиньи. При разработке и постановке диагностических тестов, основным компонентом которых является вирусный культуральный антиген, полученный с использованием этой культуры, возможны перекрестные неспецифические реакции. Ввиду вышеуказанного, для дальнейшей работы была отобрана гетерологичная в видовом отношении перевиваемая линия клеток почки зеленой мартышки - CV-1. (Рисунок 13)

На рисунке 13 показаны характерные деструктивные изменения в инфицированной культуре клеток CV-1, наблюдаемые на четвертые сутки после инфицирования.

При изучении локализации вирусного антигена (штамм «8 №2/Одинцово-02/14») методом РПИФ в инфицированных вирусом АЧС клетках CV-1 получены четкие сигналы иммунофлюоресценции при использовании ФИТЦ-конъюгата моноклональных антител к p72 (пр-ль «INGENASA», Испания). В исследуемых образцах наблюдалось характерное флуоресценцентное окрашивание, которое ограничивалось четко очерченными областями цитоплазмы, соответствующими локализации «вирусных фабрик» [72] (рисунок 14).

Полученный адаптированный к росту в перевиваемой культуре клеток CV-1 штамм вируса АЧС «8 №2 Одинцово 02/14» (вируссодержащий материал 25 пассажа) депонирован в Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под авторским наименованием «Штамм вируса АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1 (Д)».

Поскольку получение адаптированных к репродукции в перевиваемых культурах клеток штаммов вируса АЧС имеет особую важность и широкое применение для изучения биологических и молекулярно-генетических свойств, а также обеспечивает получение больших объемов вируссодержащего материала и типоспецифических сывороток крови, необходимых для диагностических исследований, многими учеными проводятся работы по получению таких штаммов [4, 12, 19, 28].

В своих работах Варенцова А.А. и Прудникова Е.Ю. подробно описали результаты адаптации вируса АЧС к различным перевиваемым линиям клеток. В их исследованиях показано, что вирус АЧС приобретал способность к репродукции в непермиссивных культурах клеток, с увеличением пассажа титры накопления увеличивались до 6,0-7,0 lg ГАдЕ50/см3 с сокращением сроков накопления до 5-6 суток и наличием рыхлой гемадсорбции. Приведенные авторами результаты аналогичны результатам, полученным в нашей работе.

Получение антигена на основе вируса АЧС штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1».

Полученный адаптированный к репродукции в перевиваемой культуре клеток CV-1 вирус АЧС штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» вызывал характерное ЦПД и титр его накопления на 6-7 сутки превышал значение 7,0 lg ГАдЕ50/см3. Ввиду этого, на следующем этапе работ, провели изучение возможности использования вируса штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» для приготовления специфического культурального антигена.

С целью получения наиболее стандартного и технологичного в получении вирусного антигена в достаточных препаративных количествах провели сравнение антигенов вируса, полученных при равных условиях (количество культурального вируссодержащего материала, метод очистки и др.) с использованием различных технологий приготовления.

Метод №1: получение культурального антигена c обработкой фреоном В культуру клеток CV-1 инокулировали вирус АЧС штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» в дозе 10-3 ГАдЕ50/см3 на клетку.

После появления 40% ЦПД сливали культуральную жидкость и замораживали матрасы с оставшимся монослоем клеток при минус 70С. Затем монослой размораживали, снимали со стенок культурального матраса механическим способом и обмывали поверхность 5 см3 бидистиллированной воды (для более полного разрушения клеток) и осветляли посредством центрифугирования в течение 30 минут при 3000 об/мин.

Клетки, находящиеся в осадке ресуспендировали в 12 см3 дистиллированной воды. Вирус подвергали инактивации путем добавления 1% раствора теотропина («А-24») в соотношении 1:100, при экспозиции 12 часов и температуре 4С. Далее обрабатывали ультразвуком в течение 1 минуты шестикратно при частоте звуковой волны 20 кГц с перерывами 20 секунд для охлаждения.

Затем, с целью липолиза внутриклеточных комплексов, добавляли 1,1,2-трифтортрихлорэтан (фреон-113) в соотношении 1:1, центрифугировали при 6000 g в течение 20 минут и отбирали водную фазу, содержащую антиген.

Метод №2: получение вирионного антигена

В культуру клеток CV-1 инокулировали вирус АЧС штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» в дозе 0,1 ГАдЕ50/см3 на клетку.

Вируссодержащую суспензию штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» трехкратно замораживали-оттаивали, затем осветляли центрифугированием при 1560 g в течение 1 часа. Отбирали надосадочную жидкость, добавляли ПЭГ-6000 (до концентрации 4%) и NaCl (до концентрации 3%), перемешивали, выдержали 18 часов. Затем преципитат осаждали центрифугированием в течение 1 часа при 1560 g. Надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспендировали в 4 мл физиологического раствора. Вируссодержащую суспензию наслаивали на 25%-35%-50% градиент сахарозы и подвергали ультрацентрифугированию при 25000 об/мин (116000g) в течение 5 часов. На границе между слоями сахарозы 25% и 35% сформировалась опалесцирующая полоса вируса АЧС, которую полностью отбирали в объме 2,5 см3.

Полученный вируссодержащий материал ресуспендировали в ФБР и центрифугировали на высокоскоростной центрифуге при 25000 об/мин (116000g) в течение 1 часа. Полученный осадок ресуспендировали в 400 мкл ФБР и переносили в пробирки типа «Eppendorf».

Затем, с целью разрушения капсида вируса к 400 мкл препарата очищенного вируса добавляли равное количество 0,5% раствора NР-40 в ФБР с добавлением 0,5М NaCl. Смесь инкубировали в течение 1 часа при 37С при постоянном перемешивании. Далее пробу диализовали в течение 16 часов при температуре +4С против ЗФР с трехкратной сменой раствора. Размер пор диализного мешка составлял 14 кДа.

Метод №3: получение растворимого культурального цитоплазматического антигена с использованием сахарозы

В культуру клеток CV-1 инокулировали вирус АЧС штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» в дозе 0,1 ГАдЕ50/см3 на клетку.

После появления 40-50% ЦПД монослой снимали механическим способом, клетки осаждали центрифугированием при 650 g в течение 5 минут. После этого удаляли супернатант, клетки, находящиеся в осадке, промывали 0,34М раствором сахарозы. Затем, полученную суспензию центрифугировали при 1000g в течение 5 минут с целью осаждения клеток.

Образовавшийся после центрифугирования супернатант сливали, осадок ресуспендировали в 0,067М растворе сахарозы. Инкубировали на льду 10 минут (из которых 5 минут на льду на шейкере).

Далее добавляли детергент NP40 до конечной концентрации 1% и оставляли на 10 минут на льду (из них 5 минут на льду на шейкере) для полного разрушения клеток.

Затем добавляли 1/7 объема 64% сахарозы и центрифугировали при 1200 g 10 минут для того, чтобы осадить ядро клеток. Собирали супернатант и добавляли 1/19 часть от общего объема TEN-buffer и 1/10 часть от объема 5М NaCl. TEN-buffer готовили путем смешивания TrisHCl 1M, EDTA 0,2M, -меркаптоэтанола и дистиллированной воды.

Смесь инкубировали на льду в течение 15 минут, затем наслаивали на поверхность 20% сахарозы и подвергали ультрацентрифугированию при 100000 g в течение 1 часа при температуре +4С.

Отбирали полосу непосредственно на поверхности сахарозы и в получившийся объем добавляли Thimerosal до финальной концентрации 0,1%. Изготовленные вышеуказанными методами образцы антигенов исследованы в ИФА. Полученными антигенами в разведениях на КББ сенсибилизировали плашки при 4С в течение 12 часов и определяли его рабочее разведение в непрямом ТФ ИФА с референс-сывороткой к вирусу АЧС IV серотипа (пр-ль CISA INIA, Испания) в рабочем разведении (1:80). Результаты титрования приведены в таблице 6.

Из результатов, представленных в таблице 6, видно, что наивысшее значение разведения антигена, использованного в ИФА, показал антиген, полученный вышеописанным методом №3.

Следовательно, рабочее разведение, полученное для данного антигена, оказалось аналогично референс-антигену и составило 1:800. Материал, полученный двумя другими методами, показал более низкую антигенную активность (до разведения 1:400) в ИФА.

Таким образом, для дальнейших исследований был выбран антиген, полученный методом №3 с использованием сахарозы. Данный метод позволяет получить антиген в наибольшей концентрации, также он является достаточно технологичным, процедура его получения занимает не более 5-6 часов. Кроме того, аналогичный метод получения антигена практикуют зарубежные исследователи [43], которые подтвердили эффективность применения данного антигенного препарата при создании и постановке серологических тестов. Для получения цитоплазматического вирусного антигена они используют культуру клеток MS и адаптированный к ней штамм вируса АЧС [45]. В нашей работе антиген получен при использовании линии клеток CV-1 и адаптированного к ней вируса АЧС штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1». В результате сравнительного анализа двух перечисленных образцов антигена получили аналогичные результаты.

Реакция агглютинации латекса

При конструировании диагностических тест-систем на основе реакции латекс-агглютинации (РЛА) с использованием полимерных микросфер с иммобилизованными на их поверхности биолигандами важным пунктом является подбор эмпирическим путем оптимальных параметров процесса сенсибилизации поверхности полимерных микросфер.

В ходе проведенных экспериментов были изучены следующие показатели, влияющие на взаимодействие антигена с частицами латекса: рН среды, величина ионной силы растворов, температура, при которой проводят иммобилизацию биолигандов, концентрация специфических антигенов, условия активации функциональных групп на поверхности полимерных микросфер, использование молекул «спейсера» - мостика (в частности глютарового альдегида) для доступности активных центров и сохранения реакционной способности специфических биолигандов после иммобилизации.

При постановке реакции агглютинации латекса результаты оценивали визуально в крестах. «++++» - крупнозернистая агглютинация на фоне прозрачной жидкости; «+++» мелкозернистая агглютинация на полупрозрачном фоне; «++» - мелкозернистая агглютинация на мутном фоне; «+» - слабозаметная агглютинация на мутном фоне; «-» - отсутствие агглютинации, фон равномерно мутный. Положительным результатом считали агглютинацию на 2-4 креста. Сомнительным считали результат, при котором агглютинация оценивалась на 1 крест. Отрицательным был результат, который характеризовался отсутствием агглютинации. РЛА учитывали, если с положительным контрольным препаратом наблюдалась агглютинация на 3-4 креста, а с отрицательным контрольным препаратом и с ГСБР отсутствовала. Результаты реакции на круглодонных микропланшетах оценивали визуально, по форме осаждения латексных частиц на дно лунки: отрицательной считается реакция, в результате которой частицы латекса оседают на дно лунки в форме «пуговки» с ровными краями, а положительной – в форме «перевернутого зонтика».

С целью установления возможности разработки метода для выявления антител к вирусу АЧС в реакции агглютинации латекса в качестве антигена использовали рекомбинантный белок p30 вируса АЧС, который хорошо зарекомендовал себя в других серологических методах диагностики.

Для конструирования антительного латексного диагностикума на основе рекомбинантного белка р30 вируса АЧС использовали 5-10% (вес/объем) суспензию мономерного полистирольного латекса с диаметром микросфер 0,9-1,1 мкм без функциональных групп. Для сохранения нативной конформации и иммунной активности биолиганда его связывание с поверхностью микросфер проводили через «спейсер». В данной работе использовали как глютаровый альдегид, выполняющий ключевую роль мостика для ковалентного соединения частиц латекса и целевого белка.

Оптимальные параметры РЛА определяли шахматным титрованием различных концентраций рекомбинантного белка р30 в диапазоне от 500 мкг/мл до 10 мкг/мл для сенсибилизации 2,5% частиц латекса и двукратных разведений проб стандартной положительной к вирусу АЧС сыворотки крови и отрицательного контроля.

Наибольшую чувствительность РЛА - 1:2560-1:5120 удалось получить при спонтанной адсорбции рекомбинантного белка р30 на поверхности полистирольных микросфер при концентрации антигена 150 мкг/мл в 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 (разведение 1:4) и 30 мкг/мл после обработки частиц латекса 0,05% раствором глютарового альдегида на 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 (разведение 1:16). Эти разведения рекомбинантного белка р30 обеспечивали концентрацию антигена, достаточную для сенсибилизации частиц латекса, которая не препятствовала реакции.

Для постановки реакции агглютинации латекса в лунки планшета для иммунологических реакций с U-образным дном вносили 0,025 см3 испытуемой сыворотки и 0,025 см3 нагруженных частиц латекса. Время появления результатов реакции 5-15 мин, для получения окончательного результата требуется выдержать 30-60 мин. Наблюдаемая агглютинация частиц латекса хорошо определялась невооруженным глазом на темном фоне или под малым увеличением микроскопа (рисунок 26).

Проведенные исследования показали, что связывание с поверхностью микросфер через «спейсер» (глютаровый альдегид) оказалось сильнее и стабильнее, чем традиционная спонтанная адсорбция латексных частиц биолигандом, а использование глютарового альдегида обеспечило лучшую адсорбцию антигена на частицах латекса, без увеличения неспецифического связывания антител и сорбированного на латексе рекомбинантного антигена. Таким образом, рекомбинантный белок р30 подтвердил свою высокую диагностическую значимость и при постановке РЛА. Ранее Казаковой А.А. показано, что использование рекомбинантного р30 и смеси его с рекомбинантным р72 позволяет повысить чувствительность и специфичность метода непрямого ТФ ИФА [13]. Аналогичные результаты приведены в работе Жукова И.Ю., в которой было продемонстрировано эффективное использование данного белка в комплексе с двумя мажорными протеинами (р72 и р50) для разработки тест-системы ИФА. Применение этих белков в качестве тест-антигена позволяло выявлять антитела к вирусу АЧС уже на 7-12 сутки после заражения [10].

Дубровской О.А. описано применение p30 для изготовления набора ИБ, в ходе испытаний которого в пробах сывороток крови домашних свиней и диких кабанов антитела к р30 выявляли, начиная с 7-10 дней после заражения [9].

Однако, в связи с тем, что выявление специфических антител к вирусу АЧС у животных является однозначным признаком инфицирования, важно применять максимально эффективные способы детекции антител. Для создания таких диагностических тест-систем, наиболее подходящим в этом отношении элементом является многокомпонентный антиген, использование которого позволяет выявлять различные антитела в сыворотках крови, отобранных от больных и подозреваемых в инфицировании животных, как на ранних стадиях заболевания (к pК205R и р30), так и при хроническом (к р35) и субклиническом течении болезни (к pК205R, р72, p54 и др.).

Поэтому, при известных преимуществах использования рекомбинантных белков в диагностических целях (в данном случае rр30), целесообразно использовать как можно больший спектр вирусных антигенов, что позволит увеличить чувствительность метода для различных форм течения болезни.

Вследствие этого, на следующем этапе работы был изготовлен диагностикум с использованием 5-10% (вес/объем) суспензии мономерного полистирольного латекса (диаметр микросфер 0,9-1,1 мкм, без функциональных групп) и культурального антигена, полученного на основе использования штамма вируса АЧС «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1».

В ходе экспериментов определяли чувствительность и специфичность полимерного латексного диагностикума в двух вариантах: на стекле – серологический скрининг (качественный тест) и титрование сывороток на иммунологическом микропланшете (количественный тест). Также изучали условия, предотвращающие десорбцию специфических биолигандов и стабилизации полимерного латексного диагностикума.

При подборе условий иммобилизации антигенов вируса АЧС на латексных частицах были использованы различные температурные режимы и время инкубации. Установлено, что для сорбции полистирольного латекса очищенным культуральным антигеном в 0,05% растворе глютарового альдегида на 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4, а также рекомбинантным белком р30 в концентрации 30 нг/мкл в 0,05% растворе глютарового альдегида на 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 оптимальной является температура +37оС в течение 6 часов (таблица 12).