Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Таксономия бактерий рода Klebsiella 11
1.2 Распространение бактерий вида K. oxytoca и факторы их патогенности 16
1.3 Методы выделения и идентификации бактерий вида K. oxytoca 20
1.4 Бактериофаги бактерий рода Klebsiella
2 Материалы и методы исследований 36
3 Результаты собственных исследований 43
3.1 Изучение биологических свойств бактерий вида K. oxytoca 43
3.1.1 Изучение морфологических и тинкториальных свойств K. oxytoca 43
3.1.2 Изучение культуральных свойств K. oxytoca 44
3.1.3 Изучение биохимических свойств K. oxytoca
3.2 Оптимизация схемы выделения и идентификации K. oxytoca 56
3.3 Выделение бактерий K. oxytoca из объектов ветеринарно-санитарного надзора, патологического материала и объектов внешней среды 71
3.4 Методы выделения и изучения биологических свойств бактериофагов K. oxytoca 76
3.4.1 Методы выделения бактериофагов K. oxytoca 76
3.4.2 Изучение основных биологических свойств выделенных фагов K.oxytoca
3.4.2.1 Морфология негативных колоний фагов K. oxytoca 85
3.4.2.2 Определение литической активности фагов K. oxytoca 88
3.4.2.3 Спектр литической активности фагов K. oxytoca 91
3.4.2.4 Специфичность действия исследуемых фагов K. oxytoca 93
3.5 Оптимизация технологических параметров изготовления и контроля индикаторного биопрепарата на основе специфичных бактериофагов K. oxytoca 99
3.5.1 Приготовление рабочих фаголизатов K. oxytoca 99
3.5.2 Испытание биопрепарата на основе бактериофагов K. oxytoca 104
3.6 Подбор оптимальных условий постановки РНФ 109
3.6.1 Определение количественного показателя РНФ 109
3.6.2 Подбор оптимального временного показателя постановки РНФ 112
3.7 Подбор параметров РНФ для индикации бактерий вида K. oxytoca в объектах
ветеринарно-санитарного надзора 115
3.7.1 Исследование с помощью РНФ проб воды, контаминированных бактериями вида K. oxytoca 116
3.7.2 Исследование с помощью РНФ комбикорма, контаминированного бактериями вида K. oxytoca 117
3.7.3 Исследование с помощью РНФ фекалий, контаминированных бактериями вида K. oxytoca 118
3.7.4 Исследование с помощью РНФ фарша, контаминированного бактериями вида K. oxytoca 119
3.7.5 Изучение эффективности сконструированного фагового биопрепарата 121
4 Обсуждение результатов исследований 123
Заключение 129
Практические предложения 130
Перспективы дальнейшей разработки темы 131
Список сокращений и условных обозначений 132
Список литературы
- Распространение бактерий вида K. oxytoca и факторы их патогенности
- Изучение морфологических и тинкториальных свойств K. oxytoca
- Методы выделения и изучения биологических свойств бактериофагов K. oxytoca
- Исследование с помощью РНФ фекалий, контаминированных бактериями вида K. oxytoca
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Бактерии рода Klebsiella - третий по частоте грамотрицательный возбудитель инфекций животных и человека (Киселева Б.С., 1985; Сельникова О.П. с соавт., 1992; Ольховик О.П., 2009; Анганова Е.В., 2012; Онищенко Г.Г., 2002, 2014). Чаще всего негативное проявление осуществляют виды: Klebsiella pneumoniae подвид pneumoniae, Klebsiella pneumoniae подвид rhinoscleromatis и Klebsiella oxytoca. Данные микроорганизмы могут быть причиной метрита и бесплодия у лошадей, мастита у коров, гематогенного остеомиелита, конъюнктивитов, менингитов, сепсисов, острых кишечных инфекций, легочных поражений у животных и человека (Красноголовец В.Н., 1996; Красиков А.П., 1998; Roberts D.E. et al., 2000; Brisse D. et al., 2000; Золотухин С.Н., 2004; Бульканова Е.А., 2004; Андросик Н.Н., 2008).
Широкое распространение клебсиелл в окружающей среде обусловлено выработанной устойчивостью микроорганизма ко многим внешним факторам, в том числе и к антимикробным средствам (Меджидов М.М., 2008). В животноводстве неправильное применение подстилочных материалов в виде торфа или опилок, нарушение условий содержания животного, приводит к контаминации клебсиеллами кормов и воды (Sampimon O.C. et al., 2006). Выделение клебсиелл из различных природных источников, выражает значимость бактерий рода Klebsiella как микроорганизмов-индикаторов санитарного состояния внешней среды (Abbott S.L., 2007; Речкин А.И., 2006, 2007, 2008).
Выделение и идентификацию бактерий вида K. oxytoca проводят бактериологическим методом с использованием целого ряда дифференциально-диагностических питательных сред и тест-систем, что требует значительных затрат времени. Иcпользование для бактериологической идентификации микроорганизмов многокомпонентных питательных сред не решает проблемы из-за схожести многих ферментативных реакций у различных представителей семейства Enterobacteriaceae (Омарова С.М. с соавт., 2012; Саидова П.С., 2015). Использование в лабораторных исследованиях ПЦР является эффективным (Козыровская Н.А., 1994; Кулуев Б.Р., 2012), но, из-за сложности методик и высокой стоимости необходимого оборудования, является недоступным для большинства исследователей.
Решение проблемы ускорения идентификации и индикации возбудителей
различных инфекций может обеспечить использование фаговых биопрепаратов
(Leclerc H. et al., 2000; Алешкин А.В., 2013; Асланов Б.И., 2015). Работы Е.А.
Булькановой с соавт. (2006) приводят данные о положительных результатах
идентификации и индикации бактерий рода Klebsiella методом
фагодиагностики.
Степень разработанности темы исследования. Попытки по созданию и
применению клебсиеллезных бактериофагов проводились многими
исследователями, как в медицинской, так и в ветеринарной практике. В 2011 году по решению Минздрава РФ в продаже появились биопрепараты
терапевтического назначения: «Бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный» (состоящий из смеси стерильных фильтратов фаголизатов бактерий K. pneumoniae, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis), «Пиобактериофаг» (состоящий из смеси стерильных фильтратов фаголизатов Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Proteus ( P. vulgaris, P. mirabilis), P. aeruginosa, E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca), «Секстафаг» (состоящий из смеси стерильных фильтратов фаголизатов бактерий Staphylococcus, Streptococcus, Proteus (P. vulgaris, P. mirabilis), P. aeruginosa, энтеропатогенных E. coli, K. pneumoniae) (производитель ФГУП «НПО «Микроген»). В 2006 году Е.А. Булькановой с соавт. были разработаны биотехнологические параметры изготовления и контроля биопрепарата на основе бактериофагов К-10 УГСХА и К-81 УГСХА, для ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий вида K. pneumoniae в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды. Все современные исследования сосредоточены на изучении биологических характеристик клебсиеллезных фагов и анализе лишь терапевтической эффективности.
Цель и задачи исследования. Цель диссертационного исследования -усовершенствование схемы индикации и идентификации бактерий вида K. oxytoca с помощью фагового биопрепарата. Поставленная цель решалась следующими задачами:
-
Изучить основные биологические свойства бактерий вида K. oxytoca на примере референс-штамма K. oxytoca ATCC 8724. На основании полученных данных сконструировать дифференциально-диагностическую среду, подобрать систему бактериологических тестов и апробировать ускоренную схему выделения и идентификации бактерий вида K. oxytoca.
-
За счет оптимизации известных схем выделения бактериофагов, получить специфические бактериофаги активные в отношении K. oxytoca.
-
Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу) выделенных бактериофагов.
-
Селекционировать выделенные бактериофаги, отвечающие требованиям, предъявляемым к индикаторным биопрепаратам, и сконструировать специфический индикаторный биопрепарат из активных штаммов бактериофагов.
-
С использованием сконструированного биопрепарата, разработать и апробировать схему ускоренной индикации и идентификации бактерий вида K. oxytoca.
Научная новизна. Впервые предложена комплексная схема выделения и
идентификации бактерий вида K. oxytoca, включающая использование
дифференциально-диагностической среды KL-1 УГСХА, системы
бактериологических тестов и сконструированного фагового биопрепарата. Получены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении бактерий вида K. oxytoca, выделенные из объектов внешней среды. Подобраны оптимальные параметры схемы постановки реакции нарастания титра фага (РНФ) бактерий
вида K. oxytoca, позволяющие проводить ускоренную индикацию искомого микроорганизма в различном материале.
Теоретическая и практическая значимость работы. Сконструирована дифференциально-диагностическая среда KL-1 УГСХА и подобрана система бактериологических тестов, позволяющих выделить и типировать бактерии рода Klebsiella до вида K. oxytoca за 72 часа. Предложены новые штаммы бактериофагов (Kox-9 УГСХА и Kox-11 УГСХА) для конструирования индикаторного биопрепарата.
Разработаны методические рекомендации по выделению и
идентификации бактерий вида K. oxytoca из объектов ветеринарно -
санитарного надзора. Разработаны методические рекомендации по ускоренной
индикации и идентификации бактерий вида K. oxytoca в объектах ветеринарно -
санитарного надзора с применением специфических бактериофагов.
Разработана временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных бактериофагов К. oxytoca: Кox-9 УГСХА и Кox-11 УГСХА.
Материалы диссертационного исследования используются в учебном
процессе при чтении лекций и проведении практических занятий Федерального
государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия
имени П.А. Столыпина» и Федерального государственного бюджетного
образовательного учреждения высшего образования «Ульяновский
государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова».
Методология и методы исследования. Методологическую основу
работы составили анализ литературы по проблеме и традиционные
общепринятые методики исследований (эксперимент). В работе использовали
методы: микробиологические, биотехнологические, с последующей
компьютерной статистической обработкой и научным анализом полученных данных.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Схема ускоренной идентификации бактерий вида K. oxytoca на основе дифференциально-диагностической среды KL-1 УГСХА с системой бактериологических тестов позволяет выделить и идентифицировать бактерии данного вида за 72 часа.
-
Схема выделения бактериофагов K. oxytoca, позволяющая выделить изоляты фагов, активных в отношении данного вида.
-
Биологические свойства селекционированных бактериофагов соответствуют свойствам, предъявляемым к свойствам индикаторного биопрепарата.
-
Схема ускоренной идентификации бактерий вида K. oxytoca на основе дифференциально-диагностической среды KL-1 УГСХА с использованием сконструированного фагового биопрепарата позволяет выделить и идентифицировать бактерии данного вида за 48 часов.
5. Схема ускоренной индикации бактерий вида K. oxytoca позволяет
обнаружить в РНФ штаммы клебсиелл в минимальной концентрации 103 м.к./мл за 22 часа.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
полученных результатов обусловлена значительным объемом
экспериментального материала, полученного за счет правильного подбора и применения методик исследований. Диссертационные исследования проведены при финансовой поддержке «Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» (договор № 1636 ГУ1/2014 от 07.03.2014).
Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих
конференциях: Международный молодежный научный аграрный форум «Наука,
инновации и международное сотрудничество молодых ученых» (17-20 сентября
2014, Ульяновск), Вторая научно-практическая конференция с международным
участием «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в
медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» (22-24 сентября 2014,
Санкт-Петербург), Международная научно-практическая конференция
«Биотехнология: реальность и перспективы» (1-3 декабря 2014, Саратов), Международная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы контроля инфекционных болезней животных» (11-12 декабря 2014, Покров), Международная научно-практическая конференция «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (5-6 февраля 2015, Ульяновск), Международная научно-практическая конференция «Вклад молодых ученых в аграрную науку» (22-23 апреля 2015, Кинель), VII Международная научно-практическая конференция «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения»(4-5февраля 2016, Ульяновск), Международная научно-практическая Интернет-конференция «Современное экологическое состояние природной среды и научно-практические аспекты рационального природопользования» (29 февраля 2016, Астрахань), Третья научно-практическая конференция с международным участием «Бактериофаги. Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» (13-15 октября 2016, Москва), VIII Международная научно-практическая конференция «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (7-8 февраля 2017, Ульяновск).
По теме диссертации опубликовано 23 работы, из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка сокращений и условных обозначений, списка использованной литературы, списка иллюстративного материала, приложений. Материалы диссертации изложены на 165 страницах, включают в себя 43 таблицы и 55 рисунков.
Распространение бактерий вида K. oxytoca и факторы их патогенности
Бактерии, принадлежащие к роду Klebsiella, относят к убиквитарным микроорганизмам. В настоящее время выделяют два основных биотопа бактерий:
1. Бактерии колонизируют слизистую оболочку тонкого кишечника и верхних отделов респираторного тракта у различных животных и человека. Основной возбудитель заболеваний: K. pneumoniae подвид pneumoniae, K. pneumoniae подвид rhinoscleromatis и K. oxytoca (Davis T.J., 1974; Bagley S. et al.,1978; Bodey G.P., 1989; Байрамова А.С., 1991; Ковалева Е.П., 1993; Береснева Е.В., 2003; Борисенкова А.Н., 2003; Евтеева Н.И., 2005, 2007, 2008; Al-Anazi S.M. et al., 2008; Bleich A. et al., 2008; Chang- Ro Lee, 2016).
Бактерии вида K. oxytoca присутствует при заболеваниях у широкого круга млекопитающих (Орешкин А.С., 2000; Аблов А.М., 2014; Вахрушева Т.И., 2017) и насекомых. Так, частой причиной метритов, эндометритов, миометритов, цервицитов, вагинитов половых органов и нарушением, как следствие, оплодотворяемости у лошадей является, наряду с E. coli, клебсиеллы (в том числе K. oxytoca) (Hogenauer C. et al., 2006; Семенцов В.И., 2009; Соболев В.Е., 2012; Смирнова Л.И., 2014; Azevedo C. et al., 2016; Estel K.E. et al., 2016). Самые крупные вспышки метритов отмечены в 1928 году в США и в 1986 году во Франции. Последние сообщения о метритах отмечены в Португалии в 2010 году, Израиль- 2012 год. В России случаев контагиозного метрита лошадей не отмечено (Информационно-аналитический центр, Россельхознадзор).
Бактерии вида K. oxytoca часто связывают с маститами у коров (Сидоренко С.В., 2004; Pitkala A. et al., 2004; Mdegela R.H. et al., 2009; Milka P. et al., 2014; Osman K. et al., 2014) и с различными заболеваниями тяжелого течения у лошадей, собак, обезьян, морских свинок и птиц (кур, гусей, уток) (Racklyef D.J. et al., 2000; Roberts et al., 2000). Сообщения о заболеваниях у лемуров с фатальным исходом в 1989 году были во Французской Гвинее (Nemet Z. et al., 2011). В России на неблагополучных по клебсиеллезу птицефабриках возбудитель выделяется от всех возрастных групп бройлеров, из инкубационных яиц и эмбрионов. Частота выделения зависит от возраста птицы. Из замерших эмбрионов клебсиелл изолируют от 20,8% до 50,0% случаев, от цыплят 130 -дневного возраста - 16,6% — 50%, цыплят старше 40 дней и взрослой птице -11,2% - 55,5% (Ольховик О.П., 2009). С июня по октябрь 2015 года в Ставрополе отмечены случаи возникновения вспышек заболевания клебсиеллезом в хозяйствах по разведению кроликов, свиней и КРС (телята).
Высказываются предположения, что переносчиками и источниками бактерии в больницах и госпиталях являются тараканы (Dillon et al., 2002).
У человека бактерии вида K. oxytoca могут входить в состав нормальной микрофлоры кишечника, носоглотки и кожных покровов (Smith S.A. et al., 2009; Леванова Л.А., 2016). Взаимодействие бактерий вида K. oxytoca и человека отмечается в диапазоне от бессимптомного носительства (нахождение в кишечнике человека в норме) до тяжелых форм заболевания, в частности это касается внутрибольничных инфекций (Frindlander C., 1982; Westbroock G.L., 2000; Pisharath et al., 2005; Yeruham I. et al., 2006; Zollner- Schwetz I. et al., 2008; Joainig M.M. et al., 2010; Б.Р., 2013; Хамидова Т.М., 2015; Тусматов Ш.М., 2016). Долгое время бактерии данного вида расценивали как возбудителей у человека лишь респираторных инфекций, однако позднее была установлена их способность вызывать бактериемии, инфекции нагноительного характера у рожениц и новорожденных, воспалительные поражения мозговых оболочек, суставов, мочеполовой системы, кишечника (Nakahama C., 2003; Gupta A. et al., 2003).
2. Окружающая среда. Бактерии выделяют из смывов с различных предметов, проб воды (Seidler R.J. et al., 1977; Павлова И.Б., 2007), почвы, с древесины и растений (включая сельскохозяйственного назначения) (Grimont F.et.al., 1981; Orskov, 1984; Brown C., 1973; Seidler R.J., 1975; Boehme S. et al., 2004; Аклан Н.Ш.М., 2006). Диапазон объектов, с которых выделяли бактерии данного вида, достаточно широк (Хаммади А.А.Р.Д, 2013): промышленные сточные воды, продукты растениеводства (Brown C., Seidler R.J., 1973), пища с высоким содержанием сахаров (Duncan, Razzell, 1972; Mundt et al., 1978), замороженные концентраты фруктовых соков (Fuentes et al., 1985), растения и деревья (Brown C., Seidler R.J., 1973).
Бактерии вида K. oxytoca выделяют из корней растений. Установлено, что бактерии могут фиксировать азот, в связи с чем классифицируются как ассоциативный фиксатор азота или диазотроф. В качестве примеров выделения данного вида из таких источников отметим: корни риса, почва с сельскохозяйственных угодий (в том числе пастбищ), гниющая древесина (Seidler R.J. et al., 1981), корни кукурузы, корни ячменя и других злаковых.
Важная роль бактерий рода Klebsiella в начале нозокомиальных инфекций, эпидемиология и факторы патогенности были рассмотрены в 1998 году Podschun и Ullman (1990, 1992, 2001).
К основным факторам патогенности K. oxytoca относят (Маслова Э.И., 1980; Газиев Г.М., 1988; Arakawa Y.M. et al., 1989; Бондаренко В.М., 1998, 2000; Yigit Y. et al., 2000; Бушуева Е.Н., 2002; Усаева Я.С., 2007; Борисовец Д.С., 2009; Alison D. et al., 2014) (рисунок 2): - наличие капсулы (определяют резистентность клебсиелл к поглощению фагоцитами и комплемент-зависимому цитолизу, а также действию различных антибактериальных субстанций); - наличие слизи (ее продуцируют мукоидные штаммы, но не из капсульного слоя; состав слизистого слоя остается неизвестным, его потеря приводит к значительному снижению вирулентности. Образование слизи кодируют плазмидные гены, потеря которых приводит к исчезновению вирулентных свойств); - структура адгезии и колонизации (образование экзополимеров, биопленочных сообществ) (Носова Е.С., 2008); - железосвязывающие системы (сидерофорная система) (обеспечивают способность вызывать бактериемии, септицемии, поражения различных паренхиматозных органов) (Алексахина Н.Н., 2002); - наличие эндо -/экзотоксинов (у K. oxytoca выделяют энтеротоксины LT (их активность реализуется через активацию гуанилат циклазной системы с последующим выходом из клеток ионов и макромолекул) и ST (их образование кодируют хромосомные гены, они проявляют цитотоксичность в отношении клеток различных типов, вызывая приток жидкости в подслизистую оболочку кишечника); клебсиеллы продуцируют широкий спектр экзоферментов, проявляющих цитотоксическую активность в отношении различных клеток за счет разрушения РНК, ДНК, гиалуроновой и нейраминовой кислоты);
Изучение морфологических и тинкториальных свойств K. oxytoca
Бактериофаг выделен из пробы воды (стационар УГСХА, Чердаклинский р-он, Ульяновская обл.) в 2016 году. Индикаторная культура K. oxytoca 51/3. Титр фага (3,0+0,1)107 фаговых корпускул в 1 миллилитре, титр по Аппельману 10-5. Размер негативных колоний 1,0-1,5 мм.
Питательные среды. Для изучения культуральных и биохимических свойств K.oxytoca были использованы следующие питательные среды: Эндо (ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск), Плоскирева (ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск), Левина (ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск), Chromogenic Urine Agar II (Biolife Italiana Srl., Италия), CLED Agar (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия), LB (Miller) agar (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия), Tryptone Soya Agar (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия), Hektoen Enteric Agar (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия), Симмонса (ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск), Клиглера (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия), Гисса (с сахарами) (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), Кристенсена (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия), Хью-Лейфсона (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия), среда № 7 (для выявления восстановления нитратов в нитриты) (ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск), среда для определения индола и орнитиндекарбоксилазы (ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск), мясопептонный агар (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), мясопептонный бульон (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), Кларка (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия).
Для изучения антибиотикочувствительности использовали диски с антибиотиками (ЗАО «НИЦФ», г. Санкт-Петербург).
Для изучения тинкториальных свойств использовали набор реагентов для окраски микроорганизма по методу Грама «Микро-ГРАМ-НИЦФ» (ООО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии», г. Санкт-Петербург). Реактивы: трихлорметан ТУ 6-09-4263-76 (СКТБ «Технолог»), -нафтол 5% -ый спиртовой раствор, 40%-ый раствор гидрооксида калия, пептон (ЗАО «ЛенРеактив», г. Санкт-Петербург), лактоза (ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск), сульфат магния (ООО «Олеум», г. Ульяновск), сульфат калия (ООО «Олеум», г. Ульяновск), карбонат кальция (ООО «Олеум», г. Ульяновск), гидрофосфат калия (ООО «Олеум», г. Ульяновск), дигидрофосфат калия (ООО «Олеум», г. Ульяновск), хлорид натрия (ООО «Олеум», г. Ульяновск), фуксин основной (ЗАО «ЛенРеактив», г. Санкт-Петербург), пурпурный (ЗАО «ЛенРеактив», г. Санкт-Петербург), кристалический фиолетовый (ЗАО «ЛенРеактив», г. Санкт-Петербург), конго красный (ЗАО «ЛенРеактив», г. Санкт-Петербург), метиловый оранжевый (ЗАО «ЛенРеактив», г. Санкт-Петербург), бромтимоловый синий (ЗАО «ЛенРеактив», г. Санкт-Петербург), бриллиантовый зеленый (ЗАО «ЛенРеактив», г. Санкт-Петербург), желатин (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия).
Оборудование: холодильники бытовые, термостат ТС-80М-2, автоклав ГК-100-3, шкаф сушильно-стерилизационный ШСС-80п УХЛ 42, термометр ртутный, микроскоп МБИ-3, лупа монокулярная MG7173, центрифуги лабораторные ОПн-8УХЛ4,2 и ЦЛС-3, весы лабораторные электронные («Digital Pocket Scale»), водяная баня, бактерицидная лампа («Philips»), бактериологическая лабораторная посуда (штативы, бактериологические петли, спиртовая горелка, цилиндры мерные, флаконы, чашки Петри, пробирки, пипетки градуированные, колбы, стекла предметные и покровные, фарфоровая ступка с пестиком).
Изучение биологических свойств референс-штамма K. oxytoca АТСС 8724 проводили согласно методике А.С. Лабинской (1978), Ф. Герхарда (1984), Е.А. Булькановой (2006), также в дополнении использовали тесты, изложенные в определителе бактерий «Bergey s Manual of Systematic Bacteriology» (2005). Приготовление и стерилизация питательных сред, а также окраска мазков, приготовление разведений и суспензий, посев на питательные среды проводили согласно нормативным документам. Контроль сконструированной питательной среды проводили согласно МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред». Подготовительные этапы по выделению и идентификации бактерий рода Klebsiella проводили в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утвержденными Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ (1999). Основной материал, используемый для выделения бактерий и бактериофагов: пробы воды, фекалии больных и здоровых животных (КРС, свиньи, лошади, домашняя птица (курицы, гуси, утки)), пробы комбикорма, патологический материл от погибших животных, испражнения и выделения больных людей (отделяемое ран, моча, кровь, рвотные массы), пищевые продукты, пробы почвы. Отбор проб для бактериологического исследования осуществляли в соответствии с имеющимися нормами и правилами, в определенном объеме, строго соблюдая условия стерильности.
Выделение фагов проводили с помощью методов, предложенных Д.М. Гольдфарбом (1961), С. Лурия, Д. Дарнелл (1970), С.Н. Золотухиным (2006), Н.Н. Карамышевой (2012), Е.А. Ляшенко (2008, 2013).
Биологические свойства выделенных бактериофагов изучали методами предложенными С.Н. Золотухиным (2006), Е.А. Булькановой (2006). Морфологию негативных колоний фагов изучали на плотных средах при посеве методом Грациа (по Булькановой Е.А., 2006; Журавской Н.П., 2013, Феоктистовой Н.А., 2013). Литическую активность фагов определяли методами Аппельмана и Грациа (по Ревенко И.П., 1978). Специфичность фагов определяли методами Отто («стекающая капля»), методом Фишера (по Р. Шах Махмуд с соавт., 2013), методом Фюрта. Селекцию бактериофагов проводили по методикам С.Н. Золотухина (2006), Е.А. Ляшенко (2013).
Постановку и оценку результатов реакции нарастания титра фага для индикации бактерий вида K. oxytoca в объектах внешней среды проводили согласно методикам В.Д. Тимакова, Д.М. Гольдфарба (1962), В.Я. Ганюшкина (1988), С.Н. Золотухина (2006), Е.А. Булькановой (2006).
Методы выделения и изучения биологических свойств бактериофагов K. oxytoca
Следующим этапом наших исследований стало выделение фагов, активных в отношении бактерий K. oxytoca.
При проведении исследований использовали наиболее применяемые в научной практике методики, с нашими дополнениями для изучаемого микроорганизма:
1. Метод выделения бактериофагов без воздействия на них индуцирующего фактора по С. Лурия, Д. Дарнеллу. В колбу с мясопептонным бульоном добавляли 1,0 мл суточной бульонной культуры всех имеющихся у нас штаммов бактерий K.oxytoca и инкубировали при 37 С 24 часа. Затем смесь бактерий центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут. Полученный центрифугат прогревали на водяной бане при 60 С 30 минут. Надосадочную жидкость исследовали на присутствие фага методом агаровых слоев по Грациа. Учет результатов проводили через 18 часов. В результате проведенных исследований было установлено, что изучаемые штаммы бактерий не проявили лизогенных свойств (рисунок 38).
2. Выделение фагов из бактериальных культур с использованием индуцирующего фактора. Во второй серии опытов на исследуемые культуры воздействовали ультрафиолетовым и рентгеновским облучениями, являющимися индуцирующим фактором. Для выделения бактериофагов методом индукции необходимо было подобрать оптимальные параметры воздействия на бактериальную клетку индуцирующих факторов. При этом учитывали степень влияния используемого агента- при инактивации бактериальных клеток, индуцирующий агент не должен оказывать угнетающего воздействия на бактериофаг.
Воздействие ультрафиолетовыми лучами. На подсушенный газон суточный культуры в течение 1, 3, 5, 10 минут воздействовали ультрафиолетовыми лучами. Источник облучения лампа фирмы «Philips» с длинной волны 250 нм. Расстояние до объектов облучения- 0,35 м. Затем с облученных чашек делали смыв культуры стерильным физиологическим раствором, полученную суспензию фильтровали и полученный фильтрат исследовали на наличие бактериофага методом агаровых слоев по Грациа. Учет результатов проводили спустя 18 часов инкубирования в термостате при температуре 37 С.
Отмечали образование сплошного бактериального газона с зонами лизиса (положительный результат) и без них (отрицательный результат) (таблица 18). Таблица 18 - Выделение бактериофагов K. oxytoca под воздействием УФ-лучей
В наших опытах не все штаммы K. oxytoca проявили лизогенные свойства. В результате проведенных исследований было выделено 2 штамма бактериофагов Кох-1 УГСХА, Кох-2 УГСХА, лизирующих штаммы K. oxytoca 1 и K. oxytoca 3. Остальные 3 штамма предполагаемых фагов в ходе пассирования теряли свою активность в отношении индикаторной культуры.
Воздействие рентгеновскими лучами (рисунок 39). Для получения накопительной культуры K. oxytoca делали пересев на МПБ 4-х суточной культуры в количестве 1,0 мл. Полученная таким образом культура в пробирках была подвергнута рентгеновскому облучению при анодном напряжении (при всех исследованиях) - 63 киловольт, силе - 250 миллиампер, время экспозиции зависело от поставленной задачи. Доза рентгеновского облучения, 2,0 мЗв
Схема индукции профага бактерий K. oxytoca рентгеновским облучением Стоит отметить, что в наших предыдущих исследованиях связанных с индукций ультрафиолетовыми лучами, воздействию подвергались открытые чашки Петри с газоном культур. Разница в средствах и методе воздействия связана с тем, что рентгеновское облучение является более мощным по сравнению с ультрафиолетовым облучением.
И если для последнего необходим непосредственный контакт с бактериальным газоном, то при индукции фага рентгеновским облучением достаточно облучить пробирку или чашку без прямого доступа к среде с культурой. В наших исследованиях облучению подвергалась жидкая среда МПБ с культурой K. oxytoca.
В работе использовалось три режима. - первая серия опытов: I период облучения, длительность периода- 1,6 сек., доза облучения - 2,0 миллизиверта. - вторая серия опытов: II периода, каждый период по 1,6 сек., общая доза облучения- 4,0 миллизиверта. - третья серия опытов: III периода, период по 1,6 сек. с перерывом в 1 мин, общая доза облучения- 6,0 миллизиверта. После облучения в трех режимах, пробирки термостатировали при 37 С в течение 24-х часов. Через сутки предполагаемый фаголизат высевали на мясопептонный агар сплошным газоном. Для этого, накануне опыта 1,5 %-ый МПА разливали в чашки Петри по 20 мл и хорошо подсушивали, чтобы капли конденсата не исказили результатов исследования. Засеянные таким образом чашки культивировали при 37 С.
Через 4, 8, 12, 16, 20 часов наблюдали за результатом. В качестве контроля были посевы бактерий сплошным газоном на МПА. О наличие фага свидетельствует образование негативных колоний. Появление негативных колоний отмечали через 20 часов инкубирования
Исследование с помощью РНФ фекалий, контаминированных бактериями вида K. oxytoca
Бактерии рода Klebsiella относятся к ассоциированным с окружающей средой возбудителям. Наиболее часто негативное проявление осуществляют виды K. pneumoniae подвид pneumoniae, K. pneumoniae подвид rhinoscleromatis и K. oxytoca: метрит и бесплодие у лошадей, маститы у коров, гематогенный остеомиелит, конъюнктивиты, менингиты, сепсисы, острые кишечные инфекции, легочные поражения у животных и человека (Красноголовец В.Н., 1996; Красиков А.П., 1998; Roberts D.E. et al., 2000; Brisse D., et al., 2000; Золотухин С.Н., 2004; Бульканова Е.А., 2004: Андросик Н.Н., 2008).
Для разработки мер борьбы и профилактики заболеваний животных вызываемых бактериями вида K. oxytoca или протекающих с их участием, остаются актуальными вопросы идентификации и индикации данного микроорганизма в разных субстратах. Быстрая идентификация бактерий вида K. oxytoca затруднена. Это связано с тем, что штаммы K. oxytoca хорошо растут на всех питательных средах, предназначенных для культивирования энтеробактерий, и почти всегда вырастают в смешанных культурах. Поэтому в бактериологических исследованиях возникают определенные трудности при идентификации бактерий вида K. oxytoca. Недостаток имеющихся в практике схем выделения бактерий вида K. oxytoca (Киселева Б.С., 1985, Покровский В.И., Поздеев О.К., 1999) заключается в трудоемкости и необходимости использования большого набора исследуемых тестов, низкой эффективности дифференциально-диагностических сред, используемых в практике (Омарова С.М. с соавт., 2012; Саидова П.С., 2015).
Для снижения трудоемкости идентификации бактерий вида K. oxytoca, нами была сконструированна дифференциально-диагностическая среда KL-1 УГСХА для одноэтапного выделения бактерий рода Klebsiella, подобрана система бактериологических тестов (тест на определение способности продуцировать сероводород, тест на определение способности образовывать индол, тест на определение способности образовывать уреазу, тест на ферментацию углеводов, наличие подвижности при оптимальных условиях культивирования) для внутриродовой идентификации бактерий.
Предлагаемая комплексная схема выделения и идентификации бактерий позволяет дифференцировать бактерии вида K. oxytoca от гетерогенных родов и видов (Citrobacter, Escherichia, Proteus, Yersinia, Enterobacter, Serratia, Hafnia) за 72 часа. Таким образом, достигается снижение расхода питательных сред, реактивов и сроков исследования.
Изучением бактериофагов рода Klebsiella занимались разные научные школы, как в нашей стране, так и зарубежом (Young R. et al., 1995; Lusiak Szelachowska M. et al., 2006; Бойцов А.Г., 2006; Акимкин В.Г., 2010; Shapiro O.H. et al., 2010; Samson J.E, et al., 2013; Young R. et al., 2014). В этот период особое значение придавалось разработке методов и схем фагоиндикации. Все последующие исследования были сосредоточены на биологических характеристиках клебсиеллезных фагов и изучении их терапевтической эффективности в животных моделях (Mdegela R.H. et al., 2009; Verma et al., 2009; Hoyles L. et al; Majkowska-Skrobek G. et al., 2016). Около 90% всех проведенных исследований связаны со штаммами бактерий вида K. pneumoniae, и лишь 3-5%-K. oxytoca. Поэтому, возникает необходимость в разработке эффективных и менее трудоемких методов индикации и идентификации бактерий вида K. oxytoca.
Для достижения поставленной цели из объектов внешней среды нами было выделено 11 бактериофагов. Данный метод выделения был наиболее эффективным при работе с изучаемым микроорганизмом. Для определения возможности использования выделенных бактериофагов для идентификации и индикации бактерий вида K. oxytoca были изучены основные биологические свойства фагов: 1) морфология негативных колоний; 2) специфичность действия; 3) литическая активность; 4) спектр лизиса; 5) температурная устойчивость; 6) чувствительность к хлороформу.
Изученные бактериофаги образовывали 4 типа негативных колоний. Литическая активность выделенных бактериофагов варьировала: по методу Аппельмана от 10-5 до 10-9, по методу Грация от (1,0+0,1)107 до (4,0+0,1)108 . Спектр литической активности изучаемых фагов находился в пределах от 4,2 до 75,0 %. Для дальнейших исследований отметили бактериофаги с наибольшим диапазоном литического действия. Совместный спектр литического действия у штаммов бактериофагов Кох-9 УГСХА и Кох-11 УГСХА – 79,2%.
Отобранные бактериофаги исследовали на специфичность. Анализ полученных результатов позволяет заключить об отсутствии литической активности фагов Кох-9 УГСХА и Кох-11 УГСХА в отношении гетерологичных культур и выраженной специфичности по отношению к бактериям вида K. oxytoca.
Бактериофаги Кох-9 УГСХА и Кох-11 УГСХА являются термостабильными и их инактивация начинается при прогревания до 69 – 71 С для фага Кох-9 УГСХА, до 79 – 81 С - фага Кох-11 УГСХА. Изучаемые бактериофаги проявили одинаковую чувствительность к воздействию хлороформа и являются устойчивыми к обработке 10%-ым раствором хлороформа в течение 20 минут. Воздействие хлороформом от 25 до 40 минут приводило к полной инактивации изучаемых фагов.
Проведенные исследования позволили определить параметры изготовления смеси индикаторных бактериофагов Кох-9 УГСХА и Кох-11 УГСХА: спектр активности данных бактериофагов равен 79,2 %, они обладают высокой литической активностью по методу Аппельмана не ниже 10-9, по Грациа (3,0+0,1)х108 (Кох-9 УГСХА) и (4,0+0,1)х108 (Кох-11 УГСХА), а также высокой температурной устойчивостью в среднем до 66-68 С. Нами была изучена возможность использования индикаторных бактериофагов Кох-9 УГСХА и Кох-11 УГСХА для идентификации и индикации бактерий рода K. oxytoca. Существующие методы идентификации бактерий рода K. oxytoca основаны на определении биохимических свойств выделенной культуры. Предложена схема ускоренной идентификации с помощью индикаторных фагов Кох-9 УГСХА и Кох-11 УГСХА. Чувствительность культуры к указанным индикаторным фагам служит основанием для дифференциации исследуемой культуры как вид K. oxytoca. Срок исследования при этом сокращается с 3-5 суток до 2 суток, при меньшем расходе сред и лабораторной посуды.
О высокой чувствительности реакции нарастания титра фага для индикации возбудителей во внешней среды сообщают многие исследователи (Золотухин С.Н. с соавт., 2004; Бульканова Е.А., 2004) Для увеличения скорости индикации бактерий вида K. oxytoca в различных объектах внешней среды подобрали оптимальные условия постановки РНФ.
В первую очередь для постановки РНФ установили показатели нарастания титра фагов, имеющие диагностическое значение. По данным разных исследователей РНФ считают положительной при уровне нарастания титра от 2 до 10 раз. В своих исследованиях мы оценивали РНФ как положительную в случае, если увеличение титра фагов произошло в 5 и более раз. Выбранный критерий гарантировал достоверность результатов, поскольку он позволял исключить технические погрешности при титровании, при которых возможно выявление невысокой степени увеличение количества фага. Достоверность реакции нарастания титра фага определяли путем выделения бактерий вида K. oxytoca бактериологическим методом исследования и специфичностью РНФ с контрольными пробами.
Определив количество фага, имеющее диагностическое значение, мы приступили к подбору режима РНФ. Для решения указанной задачи, провели эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. Оптимальное время экспозиции выбирали из следующих параметров: