Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Характеристика ящура и его возбудителя 11
2.2. Технологическая схема производства противоящурной вакцины 14
2.2.1. Инактивация вируса для изготовления вакцин 14
2.2.2. Методы очистки вирусного антигена при изготовлении инактивированных вакцин 15
2.2.3. Способы концентрирования антигена вируса ящура при изготовлении вакцин 17
2.2.4. Адъюванты в противоящурных вакцинах 19
2.3. Сорбированные противоящурные вакцины 27
2.4. Эмульсионные противоящурные вакцины 28
2.5. Иммунный ответ животных на иммунизацию противоящурными вакцинами 30
2.6. Заключение по обзору литературы 31
3. Собственные исследования 34
3.2. Методы 36
4. Результаты собственных исследований 42
4.1. Реактогенность и адъювантные свойства отечественных белых масел 42
4.1.1. Оценка реактогенности масел на белых мышах 42
4.1.2. Определение пирогенности масел на кроликах 44
4.3. Изготовление эмульсионных вакцин 45
4.3.1. Контроль стабильности приготовленных образцов эмульсионных вакцин 46
4.3.2. Оценка реактогенности эмульсионных вакцин на крупном рогатом скоте 51
4.3.3. Определение антигенных свойств опытных образцов эмульсионных вакцин 52
4.4. Определение реактогенности, пирогенности и стабильности эмульсионных вакцин, изготовленных на основе масляных адъювантов 53
4.4.1. Определение реактогенности эмульсионных вакцин на белых мышах 54
4.4.2. Определение пирогенности эмульсионных вакцин на кроликах 55
4.4.3. Исследование стабильности эмульсии экспериментальных образцов вакцин 56
4.4.4. Изучение гуморального иммунитета у КРС, вакцинированного эмульсионными вакцинами с различными адъювантами 58
4.4.5. Влияние способа введения вакцины на формирование гуморального иммунитета у КРС 63
4.4.6. Изучение гуморального иммунитета и реактогенности эмульсионных вакцин с различными адъювантами на лабораторных животных 65
4.5. Эффективность и реактогенность сорбированной и эмульсионной вакцин 67
4.6. Сохраняемость антигена в эмульсионных вакцинах 71
5. Заключение 73
7. Приложения 99
- Характеристика ящура и его возбудителя
- Иммунный ответ животных на иммунизацию противоящурными вакцинами
- Изучение гуморального иммунитета у КРС, вакцинированного эмульсионными вакцинами с различными адъювантами
- Сохраняемость антигена в эмульсионных вакцинах
Характеристика ящура и его возбудителя
Вирус ящура был открыт в 1897 году немецкими учеными Леффлером и Фрошем. Возбудитель ящура - безоболочечнный РНК-содержащий вирус, принадлежит к порядку Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus. Вирион имеет шаровидную форму диаметром 25нм, плотное ядро РНК, окруженное белковой оболочкой из 12 пентамеров (константа седиментации 12S). В настоящее время известно 7 типов и большое количество подтипов возбудителя. Болезнь, поражает парнокопытных и мозоленогих животных [57, 67].
Известно 4 вирусспецифических антигена вируса ящура, которые отличаются друг от друга не только биологическими, но и физико-химическими свойствами:
1) 146S компонент (полные частицы), состоящие из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP1 (ID), VP2 (IB), VP3 (1С), VP4 (1А);
2) 75S частицы («пустые» капсиды), лишенные РНК и включающие в себя 60 копий, состоящих из полипептидов VP0 (1АВ), VP1 (ID), VP3 (1С);
3) 12S частицы (капсомеры), представленные структурными белками VP1 (ID), VP2 (IB), VP3 (1С);
4) 3,8S субъединицы, представленные неструктурным белком VPg [67].
Основным структурным компонентом вируса являются 146S частицы, в составе которых содержится РНК. Они обладают всеми биологическими свойствами: инфекционностью, иммуногенностью, комплементсвязывающей активностью, устойчивостью и т.д. Размеры таких вирионов варьируют в пределах от 20 до ЗОнм, их плавучая плотность составляет 1,43 г/см3 [46, 134].
Второй антиген вируса ящура - это 75S частицы или «пустые» капсиды, т.е. вирионы, которые лишены РНК, но сохраняют иммуногенную и комплементевязывающую активность и не обладают инфекционностью. Третий антиген представлен 12 S частицами, которые также обладают серологическими свойствами при отсутствии инфекционности.
Четвертый - 3,8S субъединицы, продукт неструктурный первичной трансляции не отличающийся по своим свойствам от вирусспецифической РНК-полимеразы, не обладает иммуногенной активностью. Он является не капсидным полипептидом VPs и в комбинации с белками клетки хозяина образует 2 полимеразы, способствующие синтезу вирусной и двухцепочечной РНК [124].
В состав вируса входят четыре структурных белка VPi, VP2, VP3, VP4, они являются элементами субъединиц белковой оболочки. Структурные белки вируса различаются по молекулярной массе и по своим функциональным свойствам. В иммунологическом плане наиболее важен белок VPi, который несет антигенные детерминанты, ответственные за адсорбцию на клетке и выработку вируснейтрализующих антител [67].
Установлено, что иммуногенность вакцин находится в прямой зависимости не только от количества 146S частиц, но и от состояния полипептида VPi [46, 64].
Структурный белок VPi находится на поверхности вириона и любые воздействия физической, химической и ферментной природы сказываются на его состоянии, а от его целостности зависит иммуногенность противоящурных вакцин.
Неструктурные белки характеризуются высокой степенью консервативности для всех серотипов вируса ящура. Использование неструктурных белков в ИФА в качестве антигенов дает возможность оценить уровень антител к этим белкам у переболевших и вакцинированных животных и дифференцировать их. Лучше подходят для такой цели тест-системы на основе белков, входящих в полипротеин ЗАВС [87].
В настоящее время эпизоотическая ситуация по ящуру в мире продолжает оставаться довольно напряженной, что обуславливает высокий риск заноса его возбудителя в Россию, особенно в регионы, граничащие со стационарно неблагополучными странами (Китаем, Монголией, Северной Кореей и др.). В связи с этим необходимо дальнейшее совершенствование методов борьбы и средств специфической профилактики, глубокое изучение свойств вновь выделенных изолятов вируса, определение их эпизоотической опасности, чтобы в случае заноса возбудителя обеспечить надежную защиту животноводства от этой опасной инфекции [71].
В настоящее время одним из основных методов профилактики ящура в РФ является систематическая иммунизация сельскохозяйственных животных инактивированными моно- и поливалентными вакцинами в зонах повышенного риска возникновения и распространения вируса ящура [26, 27].
Иммунный ответ животных на иммунизацию противоящурными вакцинами
Систематическая иммунизация естественно-восприимчивых животных является наиболее доступным и экономически эффективным средством предотвращения, распространения и борьбы с ящуром [74, 101].
Формирование иммунного ответа при искусственной иммунизации во многом зависит от филогенетических особенностей и физиологического состояния организма животного (конституция, тип и состояние нервной деятельности, гормональная система, возраст и т.д.), а также от факторов внешней среды, влияющих на состояние организма (социальные и климатические условия, питание, витаминная обеспеченность и т.д.). Также существенное значение имеет качество вакцинного препарата и способ его применения (доза, кратность вакцинации, интервалы между прививками, метод аппликации антигена, целостность антигена в препарате, раздельное или совместное применение вакцин согласно схеме иммунизации и т.д.) [18].
Скорость выработки антител и продолжительность иммунитета зависит от количества иммуногенных компонентов в препарате [15, 25, 58, 141].
Установлено, что применение поливалентных вакцин создаёт напряжённый иммунитет у животных, а также позволяет расширить антигенный спектр действия [38, 80]. Так, проведены испытания четырёхвалентной противоящурной вакцины и исследована ее иммуногенная активность для КРС. Изучение поствакцинального иммунитета свидетельствовало об образовании специфических антител против всех четырёх типов вируса [152].
Вируснейтрализующие антитела являются одним из основных показателей иммунитета, развивающегося в результате вакцинации, по их наличию определяют иммунный статус животных [29, 34, 41, 125].
У привитых животных выработка вируснейтрализующих антител происходит к 7-14 суткам после вакцинации, достигает максимума через 3-4 недели и длится 3-9 месяцев [56, 107]. КРС, МРС и свиней обычно ревакцинируют 2 раза в год через каждые 6 месяцев. Уже к 7 суткам в сыворотке крови выявляют ВНА, титр которых достигает максимума на 3-5 неделю, и затем их концентрация постепенно снижается. При систематической вакцинации взрослого поголовья инактивированными моновалентными вакцинами против ящура уровень антител остается стабильным на протяжении 6 месяцев и составляет не менее 4,5 log2. В последующие 3 месяца происходит медленное снижение ВНА до 3,5-3,7 log2 [58].
В ряде исследований показано, что колостральные антитела содержащиеся в крови молодых животных подавляют иммунную реакцию в различной степени, в зависимости от титров ВНА и количества антигена в вакцине [20, 36, 102, 123, 137, 139]. В то же время телята и поросята в недельном возрасте, не получавшие с молозивом колостральных антител, при вакцинации могут индуцировать такой же иммунный ответ, как и взрослые животные [84, 88, 98, 167].
Изучение гуморального иммунитета у КРС, вакцинированного эмульсионными вакцинами с различными адъювантами
Образцами эмульсионных вакцин №1 тип эмульсии «вода-масло-вода» и №2 тип эмульсии «вода-масло» изготовленными по п.4.4., вакцинировали по 4 головы КРС подкожно в дозе 2 см3.
Гуморальный иммунитет исследовали через 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 суток после вакцинации. Уровень ВНА определяли в реакции нейтрализации с гомологичным вирусом и выражали в log2 ТЦД50/см3. Результаты исследований отражены в таблицах 11 и 12.
Анализ данных таблиц 11 и 12 показал, что на 7-е сутки после вакцинации (СПВ) титр антител у бычков составлял 4,0 - 4,44 и 3,62 - 4,25 log2 соответственно по всем 4 штаммам.
Титры ВНА у животных, вакцинированных эмульсионным препаратом №1 с типом эмульсии «вода-масло-вода», возрастали до 63 СПВ, в то же время у животных, привитых эмульсионной вакциной №2 с типом эмульсии «вода-масло», максимальный уровень ВНА обнаружили на 42 СПВ.
По истечению 70 суток (срок наблюдения) у животных, привитых вакциной №1, титр ВНА увеличился в 4,4 раза по сравнению с первым измерением, и составил 5,94-6,81 log2. Вакцина №2 в течение аналогичного срока наблюдения стимулировала 9 кратное увеличение титров ВНА, которые достигли уровня 6,56-7,44 log2. Вакцина, изготовленная на адъюванте ISA-61-тип эмульсии «вода-масло», с 21 СПВ стимулировала более интенсивное антителообразование.
Согласно рекомендации МЭБ эффективность вакцин проверяют непосредственно на вакцинированных животных путем оценки их устойчивости к контрольному заражению живым вирусом.
Через 70 СПВ обе группы животных заразили интрадермолингвально смесью афтозных вирусов А №2155/Забайкальский/2013, А №2166/Краснодарский/2013, О №2047/Саудовская Аравия и Азия-1 №1946/Шамир 3/89 в количестве 104 ИД50/0,2 см3 каждого штамма. Результаты контрольного заражения представлены в таблице 13. Таблица 13 - Иммуногенная активность эмульсионных вакцин с типом эмульсии в/м и в/м/в на КРС
Анализ данных таблицы 13 показал, что в группе животных, иммунизированных вакциной №1, заболела с генерализацией процесса одна особь из четырех. Исследованиями вторичных афт в РСК был установлен вирус ящура типа О/Саудовская Аравия. Все четыре особи, вакцинированные препаратом №2, были защищены от генерализованной формы ящура.
Сохраняемость антигена в эмульсионных вакцинах
Иммуногенность вакцин, в первую очередь, зависит от количества вирусспецифического антигена в прививной дозе и во вторую очередь - от стимулирующих свойств адъюванта.
Три серии эмульсионных вакцин, изготовленных по п. 4.4.5, хранили при температуре 2-8С в течение 18 месяцев. На 6, 12, 18 месяц хранения эмульсии разрушали и исследовали сохранность вирусспецифического антигена, измеряя его количество. Результаты исследований представлены в таблице 19.
Результаты исследований, представленные в таблице 19, показали, что концентрация иммуногенных компонентов в процессе хранения уменьшилась для вакцины с адъювантом ISA-206 на 22,3%, с адъювантом ISA-61 на 10% и с адъювантом БМ 1.4.139 на 24,5% за 18 месяцев хранения при температуре 2-8С.