Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Современное состояние исследований в области химии, технологии и фармакологии кукурузных рылец 10
1.1 Фитохимический состав кукурузных рылец 10
1.2 Использование кукурузных рылец в медицине и других отраслях 24
1.3 Препараты кукурузных рылец: проблемы номенклатуры, технологии и нормирования качества 30
Заключение по обзору литературы 32
ГЛАВА 2 Материалы, объекты и методики исследований 34
2.1 Материалы и объекты исследований 34
2.2 Методы и методики исследований
2.2.1 Определение числовых показателей качества кукурузных рылец ...36
2.2.2 Исследование полифенольных соединений
2.2.2.1 Хроматографический анализ 36
2.2.2.2 Определение общего количества полифенольных соединений.37
2.2.2.3 Исследование флавоноидов 37
2.2.2.4 Исследование гидроксикоричных кислот 38
2.2.2.5 Исследование дубильных веществ
2.2.4 Исследование сапонинов 39J
2.2.5 Исследование полисахаридов 42
2.2.6 Исследование органических кислот 44
2.2.7 Исследование аминокислотного состава 45
2.2.8 Исследование содержания аскорбиновой кислоты 46
2.2.9 Исследование макро- и микроэлементного состава 47
ГЛАВА 3 Фотохимическое исследование основных групп гидрофильных веществ кукурузных рылец 49
3.1 Определение товароведческих показателей кукурузных рылец 49
3.2 Исследование полифенольных соединений
5 3.2.1 Определение общего количества полифенольных соединений 50
3.2.2 Исследование флавоноидов и гидроксикоричных кислот 51
3.2.2. 1 Анализ-качественного состава.флавоноидов 51
3.2.2.2 Анализ качественного состава гидроксикоричных кислот 54
3.2.2.3 Разработка методики количественного определения флавоноидов и гидроксикоричных кислот 55
3.2.3 Исследование дубильных веществ 66
3.3 Исследование сапонинов 67
3.4 Исследование полисахаридов
3.6 Исследование органических кислот 74
3.7 Исследование аминокислотного состава 77
3.8 Исследование содержания аскорбиновой кислоты 78
3.9 Исследование макро- и микроэлементного состава 79 Выводы по главе 81
ГЛАВА 4 Установление действующих веществ и коррекция норм качества кукурузных рылец 83
4.1 Выявление действующих веществ кукурузных рылец 83
4.2 Совершенствование нормирования качества кукурузных рылец 101
Выводы по главе 106
ГЛАВА 5 Совершенствование технологии и стандартизации жидкого экстракта кукурузныхрылец 107
5.1 Некоторые аспекты получения экстракционных препаратов из лекарственного растительного сырья 107
5.2 Выбор способа подготовки кукурузных рылец и метода получения жидкого экстракта ПО
5.3 Фитохимическое исследование жидкого экстракта кукурузных рылец, полученного вакуум-фильтрационным экстрагированием 122
5.4 Установление показателей и норм качества и срока хранения жидкого экстракта кукурузных рылец, полученного вакуум-фильтрационным экстрагированием 124
Выводы по главе 126
ГЛАВА 6 Разработка технологии и стандартизация водоэкстрагируемого фитокомплекса из шротакукурузных рылец и его гранул 127
6.1 Разработка технологии водоэкстрагируемого фитокомплекса из шрота кукурузных рылец 127
6.2 Исследование, стандартизация и установление сроков хранения водоэкстрагируемого фитокомплекса кукурузных рылец 135
6.3 Разработка гранул водоэкстрагируемого фитокомплекса кукурузных рылец и перспективы их использования
6.3.1 Разработка технологии и состава гранул водорастворимого фитокомплекса из шрота кукурузных рылец 140
6.3.2 Стандартизация гранул водорастворимого фитокомплекса из шрота кукурузных рылец 146
Выводы по главе 150
Общие выводы 152
Список литературы 154
- Использование кукурузных рылец в медицине и других отраслях
- Определение числовых показателей качества кукурузных рылец
- Определение общего количества полифенольных соединений
- Совершенствование нормирования качества кукурузных рылец
Введение к работе
Ученый секретарь диссертационного совета Е.В. Компанцева
Актуальность темы. Наряду с высоким и оправданным интересом исследователей к поиску принципиально новых источников фитопрепаратов заслуживают не меньшего внимания лекарственные растения, уже давно применяемые в медицине, но вместе с тем, имеющие не полностью раскрытый фармакотерапевтический потенциал. Научные сведения о многих из них, в частности, об их фитохимическом составе, фармакологических свойствах были получены десятки лет назад в рамках имевшихся в то время возможностей науки и с тех пор практически не пополнялись. Сложившаяся ситуация по недостаточности и/или неточности знаний о такой категории лекарственного растительного сырья (ЛРС) объясняет ограниченность производимой из него продукции, отражает картину апеллирования и по сей день к устаревшим подходам и методикам оценки его качества, к неэффективным способам переработки. Усугубляет эту проблему довольно часто встречаемый формальный, малообоснованный выбор биологически активных веществ (БАВ) растения, определяющих фармакотерапевтическую ценность ЛРС. Между тем именно они должны являться важнейшим и определяющим ориентиром в разработке целенаправленной технологии фитопрепаратов и норм качества сырья.
Изложенное выше в значительной степени касается столбиков с рыльцами кукурузы (кукурузных рылец). Анализ данных по современному состоянию исследований этого ЛРС показал, что имеющиеся сведения о нем недостаточны, неполноценны и противоречивы, особенно в части количественного содержания гидрофильных групп БАВ. Кроме того, он позволил усомниться в целесообразности и объективности отдельных нормируемых показателей качества кукурузных рылец и единственного получаемого из них жидкого экстракта. В частности, малообоснованным для экстракта желчегонного действия представлялся основной нормируемый его качество показатель «кислотность», означающий, по сути, сумму органических и других титруемых щелочью кислот в пересчете на лимонную кислоту. Наряду с этим, было отмечено отсутствие логической и методологической связи в оценке качества кукурузных рылец и жидкого экстракта. Оставался открытым также вопрос о действующих веществах кукурузных рылец и, соответственно, контроле их содержания в сырье и жидком экстракте. Наконец было выявлено, что используемая технология жидкого экстракта позволяет лишь на 40% истощить сырье по сумме экстрагируемых 70% этиловым спиртом веществ, что подчеркивало, с одной стороны, ее крайне низкую эффективность, а с другой – необходимость использовать шрот растительного материала для получения дополнительного продукта на базе недоизвлеченных этанолом и экстрагируемых селективно водой БАВ.
Таким образом, исследование по совершенствованию нормирования качества кукурузных рылец, технологии и стандартизации получаемого из них жидкого экстракта, созданию схемы малоотходной переработки сырья является актуальным для фармацевтической науки.
Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось совершенствование нормирования качества кукурузных рылец, технологии и стандартизации производимого из них жидкого экстракта, а также получение водоэкстрагируемого фитокомплекса из шрота в условиях малоотходной переработки сырья.
Поставленная цель достигалась решением следующих задач:
провести фитохимическое исследование кукурузных рылец для уточнения данных и расширения сведений о содержащихся в них основных групп БАВ;
установить ответственные за желчегонный эффект кукурузных рылец БАВ и, с учетом этого, предложить нормы качества растительного сырья;
разработать более эффективную и ориентированную на действующие группы БАВ технологию жидкого экстракта кукурузных рылец, провести корректировку его стандартизации;
исследовать шрот, остающийся после производства жидкого экстракта кукурузных рылец, на содержание гидрофильных БАВ;
разработать оптимальную технологию и осуществить стандартизацию водоэкстрагируемого фитокомплекса из шрота кукурузных рылец;
предложить схему малоотходной переработки кукурузных рылец с учетом производственных и аппаратурных возможностей фармацевтических фабрик;
разработать состав, технологию и нормы качества гранулированной формы водоэкстрагируемого фитокомплекса кукурузных рылец и показать перспективы его использования.
Научная новизна. Проведены фитохимические исследования кукурузных рылец и впервые установлено, что количество водорастворимых полисахаридов и пектиновых веществ в сырье составляет 5,3% и 1,3% соответственно, а моносахаридный состав их представлен галактозой, глюкозой, арабинозой, ксилозой, галактуроновой и глюкуроновой кислотами. Обнаружено 12 аминокислот, содержащихся в кукурузных рыльцах в свободном (2,12 мг%) и связанном (12,84 мг%) состояниях, в том числе 6 незаменимых: треонин, валин, изолейцин, лейцин, фенилаланин и лизин. Определен ранее неизвестный компонентный состав органических кислот в кукурузных рыльцах и выявлено, что в ряду кислот лимонной, янтарной, щавелевой и яблочной количество последней значительно преобладает над содержанием остальных. Установлено количественное содержание в кукурузных рыльцах гидроксикоричных кислот – 1,6% и уточнено содержание флавоноидов (0,5%) и тритерпеновых сапонинов (2,4%). Изучен минеральный состав этого сырья и показано, что в нем содержится 4,7% макро- (натрий, калий, магний, кальций) и 0,02% микроэлементов (железо, цинк, кобальт, медь, марганец).
Выявлено, что основными действующими веществами кукурузных рылец и получаемого из них жидкого экстракта как желчегонных средств являются флавоноиды и гидроксикоричные кислоты. Для селективной количественной оценки совместно присутствующих в кукурузных рыльцах флавоноидов и гидроксикоричных кислот предложено использовать сочетание дифференциальной и прямой спектрофотометрии по методу Фирордта.
Впервые для получения спиртоводного извлечения в производстве жидкого экстракта применен вакуум-фильтрационный метод экстрагирования сырья и установлена его более высокая (на 40%) эффективность извлечения БАВ по сравнению с применяющимися на фармацевтических фабриках способами реперколяции и ускоренной дробной мацерации.
Показано, что шрот, остающийся после производства жидкого экстракта из кукурузных рылец, содержит значительное количество БАВ гидрофильного характера и может быть источником получения дополнительного продукта. Обоснована целесообразность создания малоотходной схемы переработки кукурузных рылец с последовательным получением жидкого экстракта и водоэкстрагируемого фитокомплекса. Определены способ и условия получения водоэкстрагируемого фитокомплекса из шрота кукурузных рылец: трехкратная ремацерация сырья горячей водой в соотношении 1:10, 1:5 и 1:5 с двухчасовым контактом фаз на каждой ступени экстракции. Выявлена желчегонная и диуретическая активность фитокомплекса, полученного водной экстракцией.
Предложена гранулированная форма для водоэкстрагируемого фитокомплекса из шрота кукурузных рылец и проведены исследования по разработке ее технологии. Установлено, что для достижения необходимых технологических свойств порошка водоэкстрагируемого фитокомплекса оптимальным вспомогательным веществом является лактоза с 30% содержанием ее в гранулируемой смеси.
Практическая значимость результатов исследования. Проведенное исследование показало необходимость изменения существующего подхода при оценке качества кукурузных рылец и продукта их переработки: предложено дополнить нормы качества сырья и жидкого экстракта основными показателями - содержанием флавоноидов и гидроксикоричных кислот, что отражено в проектах ФСП «Кукурузы столбики с рыльцами» и «Экстракт кукурузных рылец жидкий». Разработанная методика количественного определения флавоноидов и гидроксикоричных кислот позволяет, сравнительно с имеющимися, дифференцированно оценивать содержание этих двух групп БАВ в растительном сырье и фитопрепаратах.
Применение вакуум-фильтрационного способа экстрагирования сырья в производстве жидкого экстракта позволило усовершенствовать его технологию и получить целевой продукт с высоким содержанием действующих групп БАВ.
Разработанная схема малоотходной переработки кукурузных рылец повышает рентабельность производства за счет получения двух целевых продуктов – жидкого экстракта и водоэкстрагируемого фитокомплекса из одной загруженной на экстракцию порции сырья. Предложено использовать дополнительно получаемый в рамках малоотходной переработки сырья водоэкстрагируемый фитокомплекс в качестве БАД к пище в форме гранул с мягким желчегонным и диуретическим действием.
Степень внедрения. По результатам исследований разработано два проекта ФСП: «Кукурузы столбики с рыльцами» (акт внедрения ООО «Кубаньлектравы» от 07.12.06 г.; положительное заключение КГУ «Центр по контролю качества и сертификации лекарственных средств Краснодарского края» по экспертизе проекта ФСП от 01.02.07 г.) и «Экстракт кукурузных рылец жидкий» (акт внедрения ЗАО «Роскарфарм» от 26.12.06 г.). Разработанная методика количественного определения флавоноидов и гидроксикоричных кислот в растительном сырье (на примере кукурузных рылец) внедрена в НИР Северо-Кавказской ЗОС РАСХН (акт внедрения от 20.12.06 г.). Методики оценки качества и предложенные технологии фитопрепаратов кукурузных рылец апробированы в отделах контроля качества и производственных цехах ООО «Кубаньлектравы» (акт апробации от 17.11.06 г.), ЗАО «Роскарфарм» (акты апробации от 11.12.06 г. и 19.12.06 г.), ОАО «Краснодарская фармацевтическая фабрика» (акт апробации от 20.09.06 г.). Фрагменты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс фармацевтического факультета ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (акт внедрения от 12.10.06 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
данные по изучению основных групп гидрофильных БАВ кукурузных рылец;
результаты исследования фракций БАВ кукурузных рылец по выявлению веществ, обеспечивающих желчегонное действие сырья и жидкого экстракта;
итоги исследования по усовершенствованию технологии и корректировке норм качества жидкого экстракта кукурузных рылец;
разработанная технология и предложенные нормы качества для водоэкстрагируемого фитокомплекса из шрота кукурузных рылец;
результаты исследования по разработке состава, технологии и стандартизации гранул водоэкстрагируемого фитокомплекса из шрота кукурузных рылец и предложения по его использованию.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на II и IV региональных научно-практических конференциях молодых ученых и студентов юга России «Медицинская наука и здравоохранение» (Анапа, 2004 и 2006 гг.); Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фармацевтической науки и практики» (Запорожье, 2006 г.).
По результатам исследований опубликовано 9 работ.
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (№ гос. регистрации 0120.0500289).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения; обзора литературы; главы, посвященной объектам и методикам исследований; 4-х глав собственных исследований, выводов, списка литературы, включающего 202 наименования, в т.ч. 39 источников иностранных авторов, приложения. Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, содержит 60 таблиц, 25 рисунков.
В первой главе (обзоре литературы) представлены сведения, отражающие современное состояние исследований в области химии, технологии, фармакологии и медицинского применения кукурузных рылец. Во второй главе охарактеризованы объекты, приведены использованные методы и методики исследования. В третьей главе представлены результаты фитохимического изучения кукурузных рылец в отношении основных групп гидрофильных веществ. Четвертая глава посвящена выявлению действующих веществ кукурузных рылец и корректировке норм их качества. В пятой главе изложены результаты исследований по совершенствованию технологии и стандартизации жидкого экстракта кукурузных рылец. Шестая глава включает исследования по разработке технологии и стандартизации водоэкстрагируемого фитокомплекса из шрота кукурузных рылец и его гранулированной формы, а также предлагаемую схему малоотходной переработки ЛРС.
Выражаем искреннюю благодарность директору ГУП «Институт аллергии и астмы» профессору Р.А. Ханферяну за организацию и помощь в проведении фармакологических и биологических исследований.
Использование кукурузных рылец в медицине и других отраслях
Кукуруза обыкновенная (Zea mays L.) - однолетнее травянистое растение из семейства мятликовых (Роасеае). В дикорастущем; состоянии неизвестно. Впервые введена в культуру на территории Мексики древними майя и ацтеками (около 5200 г. дон.э.), для которых кукуруза была главной пище-войкультурой и поэтому служила предметом поклонения: Предком культурной кукурузы: было сорное растение теосинте мексиканская? (Euchlaena mexi-сапа). Родовое: латинское; название кукурузы: Zea произошло от греческого «zaein» - жить, т.е. давать, каждодневный хлеб. Русское название растения происходит от испанского cucurucho. Члены экспедиции г Колумба ознакоми-. лись с: кукурузой вшервые.же дни; открытия островов.в Карибском море; нов Европу кукуруза,была доставлена только при возвращении:из второго.путешествия в 1492 году. В1Россию кукурузапопалавХЗ/ПІчерез Крьім из азиатских стран; куда ее: завезли португальцы., Ее широко; возделывают на всех континентах как зерновую, силосную и лекарственную культуру. Во всем мире занимает около 132 млн. га: посевных площадей; а ежегодный урожай составляет 450 млш тонн, уступая-лишь урожаю пшеницы (менее .чем на 10%). Основными, районами выращивания, кукурузы являются центральные черноземные районы России, Северный Кавказ, Нижнее Поволжье, южные районы Дальнего Востока [25,79,119; 122].
Высота растения может достигать 4 метров; Стебли прямые, цилиндри ческой формы, иногда бороздчатые, образующие в нижних междоузлиях воз душные корни. Из нескольких образующихся при кущении стеблей; в куль туре обычно оставляется один главный. Листья длинные, ланцетные, по краю реснитчатые, с влагалищем, шириной около 10 см., до полуметра в длину, с язычком или, очень редко, без язычка. ... Цветет в июле-августе. Цветки мужские и женские находятся, в разных соцветиях на одном и том же растении. Мужские цветки образуют верхушечное метельчатое раскидистое соцветие. Женские цветки (столбики с рыльцами кукурузы, кукурузные рыльца) собраны у основания листа угловатым колосом-початком.
По видам кукуруза подразделяется на несколько подвидов, отличающихся цветом и формой плода (зерновки). Химическим признаком, наиболее характерным для отдельных подвидов кукурузы, является наличие в зерне различных форм полисахаридов и качественный состав крахмала. Изменение этих признаков связано с условиями происхождения подвидов кукурузы [3,50,77,114].
Химический состав зерен кукурузы довольно разнообразен. В зерне содержится в среднем 10,3 % белков; 4,9% жиров; 67,5 % углеводов (в том числе крахмала - 56,9 %); 1,2 % клетчатки; минеральные веществаі(]Ма - 14-28, К - 246-387, Са - 99, Mg - 120-127; Р - 218-298, Fe - 4,4-5,0, Си - 0;146, Ni - 0,140 мг%); витамины (В! - 0,38; В2 - 0,14, РР - 2,10 мг%, каротиноиды (зеексантин, лютеин).
Жирное масло, получаемое из зародышей; содержит триглицериды олеиновой кислоты (45 %), линолевой (до 47 %), гликолевой и предельных кислот (до 11 %). В составе предельных кислот кукурузного масла - арахи-новая, капроновая, каприловая и каприновая кислоты, фитостерины; непредельные представлены линолевой, линоленовой, арахидоновой кислотами. Кроме того, кукурузное масло богато также фосфатидами. [23,53,120,139,151].
Лекарственным сырьем кукурузы обыкновенной являются столбики с рыльцами кукурузы (Styli cum stigmatis Zeae maydis; corn silk), которые чаще называют «кукурузные рыльца». Они представляют собой мягкие шелковистые нити (столбики), собранные пучками или частично перепутанные, на верхушке которых находятся двухлопастные рыльца". Столбики несколько искривленные, плоские, шириной 0,1-0,15 мм, длиной 0,5-20 см, рыльца ко роткие, длиной 0,4-3 мм. Часто встречаются столбики без рылец. Цвет коричневый, коричнево - красный, светло - желтый. Запах слабый, своеобразный. Вкус с ощущением слизистости. Собирают кукурузные рыльца в фазу молочной спелости плодов на участках, предназначенных для силосования или сбора незрелых початков. Пучки столбиков, свисающих с верхушки початка, обрывают руками или срезают ножом, после чего удаляют почерневшие части столбиков и быстро доставляют к месту сушки. Сушат под навесами, на чердаках или в сушилке при 40 С, разложив их слоем 1-2 см. высушенное сырье очень ломкое, поэтому перед упаковкой его оставляют в помещении на 1 - 2 дня для самоувлажнения, после чего упаковывают в мешки или тюки. Выход сухого сырья составляет 20-25% от свежесобранной массы. Хранят в сухом, хорошо проветриваемом помещении, учитывая высокую гигроскопичность сырья. Срок хранения 3 года [43,78].
Фитохимический состав кукурузных рылец представлен разнообразными группами биологически активных веществ. В рыльцах кукурузы обнаружены флавоноиды, гидроксикоричные кислоты, антоцианы, флобафены (апифорол, лютеофорол), сапонины (до 3,2%), значительное количество витамина К (до 1600 биологических единиц в 1 г.), витамины Вь В2, Е, С, Р, РР, хлорофилл (0,22%), жирное масло (до 2,5%), эфирное масло (до 0,12%), аскорбиновая (13,55 мг%), никотиновая и пантотеновая кислоты, макро- и микроэлементы (алюминий, кальций, хром, кобальт, железо, марганец, медь, магний, калий, натрий, селен, кремний, фосфор), органические кислоты (в пересчете на лимонную 2,8%), горькие гликозидные вещества, криптоксантин, инозит, полисахариды, фитостерины, фитогемагглютинины, алантоин, алкалоиды (0,05%). [2,4,5,35,77,102,106, 155,187].
Определение числовых показателей качества кукурузных рылец
Дл изучения качественного состава флавоноидов 5,0 г измельченных до 1 мм кукурузных рылец экстрагировали 70% спиртом этиловым до полного истощения сырья. Объединенные извлечения упаривали под вакуумом до водного остатка, охлаждали, фильтровали (отделяли хлорофилл и смолистые вещества), фильтраты подвергали последовательной жидкостной экстракции органическими растворителями: хлороформом, этилацетатом, бутанолом (рисунок 1). Водные остатки спирто-водных извлечений переносили в делительную воронку и взбалтывали с равными объемами хлороформа. После разделения слоев органический растворитель отделяли. Указанную процеду ру проводили 7-8 раз. Хлороформные извлечения объединяли. Далее водные остатки после экстракции хлороформом нагревали на водяной бане для удаления хлороформа, охлаждали и обрабатывали этилацетатом. После экстракции этилацетатом водные остатки нагревали на водяной бане для удаления органического растворителя и обрабатывали бутанолом. Хлороформное, этилацетатное и бутанольное извлечения упаривали в вакууме до смолооб-разного остатка и использовали для проведения качественных реакций и хроматографического анализа.
Присутствие флавоноидов в спиртовом извлечении из кукурузных рылец и водном из их шрота подтверждали качественными реакциями с использованием хромогенных и осадительных реактивов, приведенными в главе 2.
Качественный состав флавоноидов изучали методом тонкослойной хроматографии, исследуя этилацетатную и бутанольную фракции спиртового извлечения из кукурузных рылец. Учитывали собственную окраску флаво-ноидов, их способность флуоресцировать в УФ-свете, а также образовывать окрашенные комплексы с хромогенными реактивами: раствором аммимака, 2% спиртовым раствором алюминия хлорида, 1% спиртовым раствором хлорида железа (III) и др.
Этилацетатная фракция содержала наибольшее количество флавонои-дов, разделение которых было достигнуто в системе н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5), в результате чего удалось выявить несколько пятен, отнесенных к флавоноидам. Полученные результаты приведены в таблице 8.
На основании полученных результатов хроматографического анализа и сравнения с достоверными образцами флавоноидных веществ, а также литературными данными были сделаны выводы: вещество 1 является ориентином (5,7,3 ,4 -тетраокси8-С-глюкозид); вещество 2 представляет собой витексин (5,7,4 -триокси8-С-глюкозид); - вещество 3 может быть идентифицировано как изовитексин (5,7,4 триоксиб-С-глюкозид); - вещество 4 является лютеолином (5,7,3 ,4 -тетраоксифлавон). Таким образом, подтверждаются литературные данные о преоблада нии в составе кукурузных рылец С-гликозидов - производных апигенина и лютеолина. 3.2.2.2 Анализ качественного состава гидроксикоричных кислот Качественный анализ проводили методами бумажной и тонкослойной хроматографии (раздел 2.2.2.3).
Результаты хроматографического анализа представлены в таблице 9. Таблица 9 - Бумажная хроматография гидроксикоричных кислот куку рузных рылец в системе 2% уксусная кислота № пятна Rf Окраска пятен при обработке УФ-свет NH3 КОН реактив Гепфнера FeCI3 Идентификация 1 0,37 голубая флуор. светло-голубая красно-коричн. красно-коричн. серо-зеленая Кофейная 2 0,54 светло-голубая голубая коричн. коричн. серо-зеленая Феруловая 3 0,64 голубая зелено-голубая красная желто-коричн. зеленая Хлорогеновая Сокращения: коричн. - коричневая. Исследования методом тонкослойной хроматографии привели к обнаружению тех же соединений. Результаты представлены в таблице 10. Таблица 10 - Тонкослойная хроматография гидроксикоричных кислот кукурузных рылец в системе бензол-метанол (8:2) № пятна Rf Окраска пятен при обработке УФ-свет NH3 КОН H2S04 (конц.) Идентификация 1 0,48 голубая флуор. голубая флуор. красно-корич. серо-фиол. Кофейная 2 0,56 голубая зелено-голубая красная серо-фиол. Хлорогеновая 3 0,62 голубая голубая коричн. фиол. Феруловая Сокращения: коричн. - коричневая; фиол. - фиолетовая. Таким образом, полученные результаты хроматографических исследований позволяют сделать вывод о наличии в кукурузных рыльцах кофейной, хлорогеновой, феруловой кислот, что согласуется с данными научной литературы. 3.2.2.3 Разработка методики количественного определения флавоноидов и гидроксикоричных кислот
Целью разработки методики являлось раздельное количественное определение в одном анализе флавоноидов и гидроксикоричных кислот, совместно присутствующих в кукурузных рыльцах.
Необходимость в разработке такой методики обосновывалась тем, что традиционно используемое прямое спектрофотометрирование растворов готовых фитосредств или извлечений из растительного сырья при 325-330-нм для количественной оценки группы фенолкарбоновых кислот, в том числе гидроксикоричных, не отражает на самом деле истинное содержание данной группы соединений в силу наличия поглощения при этих длинах волн у других фенольных соединений, прежде всего, флавоноидов. Имеет силу такой же вывод и в отношении определения флавоноидов, если не учесть мешающее их количественной оценке наличие в испытуемом растворе гидроксикоричных кислот. Предлагаемая методика позволяет дифференцированно оценить количественное содержание совместно-присутствующих флавоноидов и гидроксикоричных кислот в столбиках с рыльцами кукурузы.
Для селективного анализа содержания флавоноидов использовали известную методику спектрофотометрического определения с использованием комплексообразующего с ними реагента - хлорида алюминия в подкисленной среде. Для исключения влияния на результаты анализа сопутствующих биологически активных веществ, оптически активных в области максимума поглощения комплекса хлорида алюминия с суммой флавоноидов, применялась методика дифференциальной спектрофотометрии: раствор сравнения содержал те же компоненты, что и испытуемый, за исключением хлорида алюминия [20,21,83].
Согласно литературным данным и данным собственных хроматографи-ческих исследований среди флавоноидов кукурузных рылец преобладают гликофлавоновые производные, в частности, лютеолина. В этой связи коли чественное содержание суммы флавоноидов определяли в пересчете на лю-теолин, на который, к тому же, имеется стандарт качества как на ГСО.
В подтверждение справедливости выбора стандартного вещества экспериментально было установлено, что максимум поглощения комплекса алюминия хлорида с флавоноидами кукурузных рылец находится в области длин волн 395-400 нм, то есть близко к спектральным характеристикам лютеолина в тех же условиях (рисунок 2). спирто-водное извлечение из кукурузных рылец стандартный образец лютеолина 300 350 400 450 длина волны, нм 500 Рисунок 2 - Дифференциальные спектры поглощения спирто-водного извлечения из кукурузных рылец и ГСО лютеолина с алюминия хлоридом в кислой среде Количество гидроксикоричных кислот устанавливали прямым спек-трофотометрированием испытуемого раствора (рисунок 3) в пересчете на хлорогеновую кислоту при длине волны 325 нм, используя принцип аддитивности и значение оптической плотности флавоноидов (найденное через удельный показатель поглощения лютеолина и установленную на первом этапе их концентрацию) [51].
Определение общего количества полифенольных соединений
По большому счету подобные «претензии» к нормированию качества могут быть предъявлены к большинству ЛРС и фитопрепаратов, разрешенных к применению еще в прошлом веке [98].
Явным же примером малообоснованной стандартизации производящего сырья и продукта на его основе является нормирование качества кукурузных рылец и их жидкого экстракта. Для изменения сложившейся ситуации нами была поставлена задача установления действующих веществ кукурузных рылец и последующего ориентирования нормирования качества данного ЛРС и продуктов из него на содержание групп БАВ, ответственных за специфическую фармакотерапевтическую активность.
С этой целью использовался методологический принцип, представленный на рисунке 11, основанный на экстрагировании растительного сырья различными по полярности растворителями и получении, соответственно, фракций различного состава; количественном анализе компонентного состава полученных фракций; изучении их фармакологической активности и корреляционном анализе уровня содержания БАВ и результатов фармакологических исследований [133].
Преимущества данного подхода выявления действующих веществ заключается как минимум в двух аспектах: максимальное сохранение нативных, в том числе фармакологических, свойств БАВ при фракционировании; простота технологии и менее затратные расходы при получении фракций в отличие от выделения индивидуальных или даже отдельных групп БАВ.
Фракционирование БАВ кукурузных рылец было проведено последовательной экстракцией сырья 70% спиртом этиловым и водой очищенной. Целесообразность последовательности использования и возможность привлечения в данном исследовании этих двух экстрагентов, помимо отличия в физико-химических свойствах, обуславливалась их применением в производстве жидкого экстракта и возможным - в предполагаемой схеме малоотходной переработки. і Растительное сырье
Теоретический прогноз на специфичность и уровень фармакологического действия, исходя из установленного состава БАВ фракций, анализа и сравнения отличий их представительства во фракциях и общепризнанных, свойственных по данным научной литературы видам биоактивности выявленных природных веществ Выявление групп БАВ, ответственных за определенный вид фармакологической активности
Фракции получали концентрированием под вакуумом и последующим высушиванием соответствующих извлечений. Представлялось также целесообразным исследование активности комбинированной фракции (КФ), состоящей из смеси спиртовой и водной (2:1) и являвшейся своего рода аналогом суммарного водного извлечения из кукурузных рылец аптечного изготовления, поскольку включала в себя весь групповой спектр БАВ в адекватных нативным соотношениях (таблица 31).
Далее изучалось количественное содержание основных групп БАВ в полученных фракциях по методикам, приведенным в главе 2. Результаты фотохимического изучения выделенных фракций представлены в таблице 31. Таблица 31 - Количественное содержание основных групп БАВ в полученных фракциях кукурузных рылец
Группа БАВ Содержание БАВ в % во фракциях СФ ВФ КФ Флавоноиды 1,34±0,03 0,43±0,01 1,07±0,02 Гидроксикоричные кислоты 3,81±0,08 1,10±0,02 2,94±0,06 Дубильные вещества 1,40±0,02 2,14±0,04 1,61±0,03 Сапонины 4,92±0,11 1,57±0,04 3,85±0,09 Водорастворимые полисахариды - 58,8±1,76 19,6±0,59 Органические кислоты 3,76±0,08 2,46±0,05 3,29±0,07 При фитохимическом исследовании бьшо обнаружено, что состав спиртовой (СФ) и водной фракций (ВФ) представлен практически всеми анализируемыми группами БАВ кроме полисахаридов (таблица 31). Однако за исключением дубильных веществ, их количественное содержание, особенно флавоноидов и гидроксикоричных кислот, значительно преобладало в спиртовой фракции. Состав КФ по представительству групп БАВ был близок ВФ, но с ощутимо большим содержанием флавоноидов и гидроксикоричных кислот наряду с несколько меньшим их уровнем по сравнению с СФ.
Фармакологические исследования были проведены при консультировании специалистами ГУЛ «Институт аллергии и астмы» и включали в себя изучение воздействия фракций кукурузных рылец на желчегонную активность, мочевыде-лительную функцию почек и свертываемость крови, то есть на те виды активности, которые официально декларируются для этого сырья при использовании в форме жидкого экстракта и отвара. При интерпретации результатов фармакологических исследований рассматривались следующие варианты: 1. Спиртовая фракция значительно превосходит по действию водную - действующие вещества преимущественно сосредоточены (или исключительно представлены) в этой фракции. 2. Спиртовая и водная фракции проявляют примерно одинаковый по силе фармакоэффект - действующие вещества находятся в одинаковых количествах в обоих фракциях (с учетом дозировок). 3. Комбинированная фракция имеет примерно равное по силе действие с одной из фракций - значит вторая является ненужным «довеском» и не содержит (или содержит мало) действующих веществ. Эксперименты были поставлены на крысах-самцах линии Вистар. Животные методом случайной выборки были разделены на 5 групп по 6 особей в каждой.
Совершенствование нормирования качества кукурузных рылец
В настоящее время известны самые разнообразные методы экстрагирования ЛРС, из которых наиболее часто применяемыми на практике являются перколяция, реперколяция и ускоренная дробная мацерация.
Перколяция - динамический периодический способ извлечения с непрерывной сменой экстрагента. Измельченное сырье, уложенное в перколя-тор, заливают экстрагентом «до зеркала», настаивают непродолжительное время и затем медленно перколируют со скоростью слива вытяжки от 1А до 1/8 части рабочего объема перколятора в час, заливая сверху с такой же скоростью чистый экстрагент. Процесс продолжают до достижения необходимой полноты извлечения.
При получении жидких экстрактов данным методом сначала собирают 85 объемных частей (по отношению к сырью) первичной (концентрированной) вытяжки, а далее процесс экстракции проводят до истощения сырья, получая 500-600 объемных частей разбавленной вытяжки, которую далее концентрируют до 7-8 объемных частей, смешивают с первичной вытяжкой и добавляют экстрагент до 100 объемных частей. Полученную смесь отстаивают, стандартизуют, фильтруют. Недостатком метода является наличие температурного воздействия на вытяжку и связанный с этим риск потери летучих компонентов, разрушения термолабильных веществ, а также большой расход теплоагента.
Реперколяция - повторная перколяция с проведением процесса экстрагирования в батарее экстракторов. Суть метода заключается в перколировании сырья в последующем экстракторе вытяжкой из предыдущего. Известно несколько вариантов реперколяции: с незаконченным циклом; законченным циклом и упариванием части слабого извлечения; с делением сырья на неравные части и др. Реперколяция позволяет получить нативный комплекс веществ в концентрированном состоянии, но в большинстве случаев отличается продолжительностью и металлоемкостью производства.
Для получения вытяжки методом ускоренной дробной мацерации используют батарею из трех перколяторов. Экстрагирование в данном случае осуществляют по принципу противотока, то есть чистый экстрагент всегда подают на истощенное сырье (в «хвостовой» перколятор), а вытяжку, которая насыщается действующими веществами, проходя через три экстрактора, собирают из «головного» перколятора. Недостатком процесса является низкая эффективность извлечения БАВ во всех перколяторах, кроме «хвостового», так как сырье в них обрабатывается нечистым экстрагентом и движущая сила процесса довольно мала [98,108].
В производстве жидких экстрактов полученную растительную вытяжку с целью предотвращения образования осадка при хранении подвергают очистке путем отстаивания при пониженной температуре (не выше 10 С) в течение 2 суток и более [43]. В ряде случаев извлечения освобождают от балластных веществ осаждением с помощью органических растворителей (этанола, метанола, ацетона), разрушающих гидратную оболочку белковых молекул, или кипячением. Для удаления смолообразных веществ к извлечению добавляют адсорбенты (активированный уголь, тальк и др.) [91].
После отстаивания извлечения отделяют от осадка методом декантации и подвергают фильтрации с использованием фильтрпрессов, нутч-фильтров, друк-фильтров, а в случае тонкодисперсных осадков применяют центробежные сепараторы (центрифуги) [149].
Как было сказано в главе 1, классические способы экстрагирования (реперколяция, ускоренная дробная мацерация) применительно к кукурузным рыльцам не всегда гарантируют получение качественного жидкого экстракта, по-видимому, из-за уникальности морфологической структуры данного сырья. На наш взгляд, для повышения эффективности экстрагирования кукурузных рылец необходимо выбрать отличный от общепринятых способ подготовки сырья, который бы обеспечивал максимальное вскрытие растительных клеток и образование развитой поверхности экстрагирования. Добиться этого позволяет предварительное двух-трехкратное вальцевание с последующей классификацией по величине частиц. В процессе вальцевания сырья наблюдается образование «лепестка», в котором вследствие раздавливания разрушены растительные клетки, а за счет дополнительного истирания (по причине разной скорости вращения валков) значительно увеличивается удельная поверхность ЛРС. В дальнейшем, при экстрагировании такого сырья извлечение БАВ будет обеспечиваться не столько за счет внутреннего массопереноса, а посредством растворения и вымывания их из разрушенных клеток [108].
В связи с вышеизложенным представилось целесообразным сравнить различные способы подготовки кукурузных рылец к экстракции. С этой целью кукурузные рыльца делили на две части. Первую порцию сырья измельчали изрезыванием с получением частиц фармакопейной степени измельчения (5-7 мм); вторую - раздавливанием с одновременным истиранием путем трехкратного пропускания через двухвалковый измельчитель (максимальный размер частиц составлял не более 1 мм). Для кукурузных рылец, измельченные различными способами, находили ряд технологических показателей: степень измельчения и дисперсность; фракционный состав и средний размер частиц; удельную, объемную и насыпную массы; порозность и пористость;
