Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Аналитический обзор 7
1.1 Особенности строения лактоферрина 7
1.2 Физико-химические и биологические свойства лактоферрина 10
1.3 Анализ способов получения и применения лактоферрина 24
1.4 Системы доставки лактоферрина в организм. LBL технология микрокапсулирования 35
1.5 Заключение по обзору литературы 43
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 45
2.1 Организация выполнения работы 45
2.2 Материалы 47
2.3 Методы исследования 49
ГЛАВА 3 Экспериментальная часть
3.1 Характеристика препарата, выбор метода и оптимизация 58 параметров очистки
3.2 Оптимизация параметров лиофилизации препарата 68
3.3 Изучение свойств лактоферрина
3.4 Разработка системы доставки лактоферрина 84
3.5 Технология и комплексная оценка качества инкапсулированного лактоферрина 112
Выводы и результаты 117
Список использованных источников 118
- Анализ способов получения и применения лактоферрина
- Заключение по обзору литературы
- Методы исследования
- Изучение свойств лактоферрина
Введение к работе
Актуальность работы.
Лактоферрин - полифункциональный белок из семейства трансферринов, представленный преимущественно в молоке человека и других млекопитающих. Лактоферрин обладает антибактериальными, антивирусными, антиканцерными, антигрибковыми, противопаразитическими, антиоксидантными свойствами. На основе многих его биологических функций исследователи рассмотрели разнообразные возможности применения его в здравоохранении, при профилактике и лечении инфекционных и воспалительных заболеваний.
Мировая потребность в лактоферрине сегодня значительно превышает предложение. К тому же,лактоферрин продолжает оставаться в ряду дорогостоящих белков вследствие большого интереса исследователей к уникальным свойствам этого лекарственного белка и имеющихся трудностей выделения его в чистом виде. Поэтому вопрос об удешевлении и увеличении его производства стоит очень остро.
Одними из важных рецепторов лактоферрина являются его рецепторы на слизистой кишечника и GALT- связанных клетках. Однако, лактоферрин подвержен пептической деградации в желудочно-кишечном тракте, снижающий его биоактивность, и не легко получает доступ к целевым сайтам кишечника из-за высокой вязкости слизистого слоя. Поэтому при пероральном введении лак-тоферрина его защита от действия ферментов желудочно-кишечного тракта является важной задачей. В связи с этим, требуются соответствующие системы доставки лактоферрина с возможностью преодоления этих препятствий.
Степень разработанности.
Научной базой представленного исследования явились фундаментальные работы отечественных ученых (И.А. Рогова, Г.С. Комоловой, Н.А. Тихомировой, А.М. Шалыгиной, З.С. Зобковой, А.В. Мишиной), занимающихся получением лактоферрина из молочного сырья, исследованием его свойств, а также разработкой продуктов, обогащенныхлактоферрином.
В настоящее время разработаны специальные системы доставки лакто-феррина:липосомы (Trif,M. et al 2001; Ishikado, A et al 2005; Ogue,S et al 2006), ПЭГ-конъюгаты (Nojima,Y et al 2008; Bailon,P. et al 2009; Foster, GR. 2003), энтеральной формулировки (Takeuchi et al 2006), микрочастицы (Onishi et al 2007), полиэлектролитные комплексы (Qing-Xi Wu и др. 2009, Onishi et al 2010, Koyama, K et al 2009).Однако, многие используемые методы микрокапсулиро-вания не лишены недостатков, среди которых использование органических растворителей и жестких условий капсулирования, что в случае лактоферрина может привести к значительной потере активности. Поэтому разработка средств доставки лактоферрина в целях увеличения его биодоступности является актуальной.
Отдельные этапы работы выполнены в рамках: РФФИ по теме "Клонирование и экспрессия гена лактоферрина в клетках E. coli" (соглашение №12-08-90916/12), ФЦП «Изучение противоопухолевой активности рекомбинантного
лактоферрина» (Соглашение № 14.В37.21.1232), стипендии Президента РФ для обучения за рубежом 2013/2014 гг (приказ № 585 от 18.07.2013 г. Минобрнауки России);стипендии Президента РФ на 2013-2015 гг. приказ Минобрнауки РФ от 28 февраля 2013 года № 136; стипендии ARAP на 2015-2016 гг. (A*STAR, Сингапур), SG-NZ Foods for Health Grant (Проект №1414024010, Сингапур).
Цельдиссертационнойработы. Целью работы является разработка способа получения инкапсулированного лактоферрина.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
выбрать методы и оптимизировать параметры очистки лактоферрина;
оптимизировать параметры лиофильной сушки лактоферрина;
изучить состав и свойства полученного лактоферрина;
разработать систему доставки лактоферрина в тонкий кишечник и исследовать ее эффективность.
Методология и методы исследования.
Методологической составляющей диссертационного исследования стали труды отечественных и зарубежных ученых (Остерман Л.С., 2002; Маниатис, 1984; Vennison, 2009; MitsuoUmetsuet al 2006; Kouhei Tsumoto 2010;Cухоруков Г.Б, 2009; Попов В.Н., 2009 и др.).
В диссертационной работе использованы новейшие биологические, химические, биохимические, иммунологические методы исследования, а также методы компьютерных информационных технологий с применением последних достижений науки и техники.
Для анализа состава и свойств лактоферрина: микроскопические цитологические, спектрофотометрические, хроматографические методы исследования.
Для определения состава и исследования эффективности средства доставки: методы электронной, оптической, флуоресцентной, конфокальной микроскопии и цитологические методы исследования.
Научная новизна
-
Подобран эффективныйметод очисткилактоферрина.
-
Оптимизированы параметры лиофильной сушки лактоферрина.
3. Изучен состав и свойства полученного лактоферрина.
3. Разработана эффективная система доставки лактоферринав тонкий ки
шечник.
Теоретическая и практическая значимость исследования:
На основе полученных результатов теоретических и экспериментальных исследований разработан способ получения высокоочищенного лактоферрина.
Разработана система доставки для лактоферрина (а также других белков, функциональные активности которых осуществляются в тонком кишечнике), позволяющая доставить лактоферрин до целевых рецепторов в организме, и тем самым увеличить его биодоступность.
Разработана технологическая схема производстваинкапсулированного лак-тоферрина, исследованы физико-химические показатели и показатели безопасности готового продукта, определены сроки и условия хранения продукта, разработана и техническая документация.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Параметры процесса очистки лактоферрина.
-
Параметры лиофильной сушки лактоферрина.
-
Свойства полученного лактоферрина.
-
Состав оболочки для лактоферрина и ее характеристики.
-
Технологическая схема получения инкапсулированного лактоферрина. Апробация и степень достоверности результатов.Основные результаты
диссертационного исследования представлены на российских и международ
ных научно-практических конференциях, школах («Биотехнологии будущего-
2013» (Москва, 2013)и др.), выставках (Российская агропромышленная выстав
ка «Золотая осень -2012» (Москва, 2012), 6-я Международная биотехнологиче
ская выставка — ярмарка «РосБиоТех» (Москва, 2012), а также зарубежных на
учных школах (VIthtrainingSchoolonBioencapsulation (Ньячанг, 2014) и конфе
ренциях 3rd и 5rdInternationalConference «MolecularMaterials (M3 и М5)» (Син
гапур, 2014 и 2015), 4th InternationalConference
«Perspectivesfordevelopmentofmolecularandcellularbiology» (Ереван,
2013),TheoreticalandAppliedSciencesinthe USА (США, 2015),
Theprioritiesoftheworldscience: experimentsandscientificdebate" (США, 2015),
Zwiastowa. Naukiiprakty (Польша, 2015), Sharing the Results of Research To
wards Closer Global Convergence of Scientists" (Канада, 2015),
4thInternationalConferenceonEnvironment, ChemistryandBiology (ICECB 2015, Ок
ленд, НоваяЗеландия) идр.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе три статьи в журналах, рекомендованных ВАК «Современные проблемы науки и образования», «Врач-аспирант» и «FoodandRawmaterials».
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих основных разделов: введение,аналитический обзор, материалы и методы исследования, экспериментальная часть, выводы, список использованных источников и приложения. Основное содержание работы изложено на 133 страницах машинописного текста, содержит 23таблицы и 46 рисунков. Список литературы включает 133 наименования.
Анализ способов получения и применения лактоферрина
Конформационные изменения при связывании с ионами железа, обеспечивают образование более компактной структуры лактоферрина. Связанный атом железа прячется внутри белковой глобулы, что объясняет конформационную стабильность образованного комплекса в мочевине, по сравнению с апо-формой белка. Несмотря на идентичность аминокислотных лигандов в металлосвязывающих центрах, аффиность ионов железа к белковой части лактоферрина существенно выше (в 300 раз), чем у трансферрина, даже при низких рН (рН=3) [59].
Углеводный компонент лактоферрина состоит из остатков сиаловой (5-ацетамид-3,5-дидеокси-D-глицеро-D-галактононулозоновой) кислоты, фукозы (6-деоксигалактозы), гексозы и N-ацетилглюкозамина и связан с белковой частью гликозидной связью через амидный азот аспарагина.
Лактоферрин человеческого молока содержит поли-N-ацетил глюкозоаминокликаны. Хотя гликаны имеют определенные пространственные характеристики, их роль в какой-либо биологической активности еще предстоит определить [32, 59, 111]. Их удаление не оказывает регистрируемого действия на конформацию и функции лактоферрина [70]. Четыре аминокислотных остатка наиболее важны для связывания железа (гистидин, тирозин и аспарагиновая кислота), а аргинин отвечает за связывание иона карбоната.
Доказано, что лактоферрин может также связывать ионы других металлов, таких как медь, марганец и алюминий в биологических системах. Доля молекулы лактоферрина, которую занимают эти катионы может быть совсем небольшой.
Лактоферрин относится к щелочным белкам, его изоэлектрическая точка по разным данным составляет 8,0 – 8,5 [13], 8,7 [57], 9,7 [32, 70]. Присоединение ионов железа к белку меняет его изоэлектрическую точку с 9,2 на 8,7 за счет одновременного присоединения отрицательно заряженных бикарбонатных ионов [32]. Показано, что лактоферрин участвует не только в транспорте ионов железа, цинка и меди, но и в регуляции их всасывания [3, 29]. Наличие непрочно связанных ионов цинка и меди не влияет на железосвязывающую функцию лактоферрина, а фактически даже усиливает ее [2, 29, 32]. Fe+3 c лактоферрином представляет собой объединение красного цвета. Одновременно с фиксацией ионов металлов в железосвязывающем центре белка происходит фиксация аниона. В физиологических условиях это карбонат или бикарбонат, который с помощью электростатических взаимодействий связан с остатком аргинина. Присутствие аниона необходимо для прочного связывания железа с лактоферрином, так как он нейтрализует положительный заряд катиона металлов [3, 49].
Многие функции лактоферрина определяются его поверхностными свойствами. Заряд по поверхности распределен неравномерно, можно выделить три области положительного заряда: на N-конце (остатки 1-5), на первой -спирали (остатки 12-31) и между двумя долями (рисунок 1.2.1).
Лактоферрин относится к системе врожденного иммунитета. Существуют данные о том, что лактоферрин опосредованно вовлечен в процессы клеточного иммунитета. Главные биологические функции белка — это связывание и транспорт ионов железа, но кроме этого лактоферрин обладает антибактериальной, антивирусной, антипаразитарной, различными каталитическими активностями, а также противораковым, антиаллергическим, иммуномоделирующим действиями и радиопротективными свойствами [3, 30, 32].
Поскольку лактоферрин является железосвязывающим белком и может находиться в железонасыщенном состоянии, то некоторые его биологические функции обусловлены наличием ионов железа [2].
Одной из важнейших функций лактоферрина молока, определяемых его способностью связывать железо, является транспорт железа и обеспечение его высокой усвояемости организмом новорожденного из молока матери [2]. Решающую роль в этом процессе играет наличие специфических рецепторов к лактоферрину в слизистой оболочке кишечника человека, где происходит адсорбция целого белка [61]. Известно, что железо влияет на такие клеточные процессы, как синтез ДНК, в меньшей степени РНК и белков, секреция антител, экспрессия поверхностных маркеров на лимфоцитах и рецепторов интерлейкина-2 и многие другие.
Таким образом, лактоферрин, регулируя процессы всасывания ионов железа, может косвенно влиять на широкий спектр физиологических активностей [3, 40, 94]. Лактоферрин проявляет антибактериальную активность по отношению грамположительным, грамотрицательным бактериям и к некоторым актиномицетам (таблица 1.2.1).
Заключение по обзору литературы
Из-за функциональных характеристик лактоферрина, предпринимались попытки производства и очистки его для использования в качестве лечебной и пищевой добавки [6]. Разработаны различные методы выделения лактоферрина из коровьего молока и сыворотки, получаемой при производстве сыра. Кислотно осажденный казеин используется в качестве исходного материала для выделения лактоферриа из коровьего молока. Творожная сыворотка является еще одним источником, используемом для получения лактоферрина в крупном масштабе. Сывороточные фракции молока или молозива являются лучшими источниками для получения лактоферрина в лабораторном масштабе [4].
Стратегии очистки белка основаны на свойствах молекулы. Поскольку лактоферрин имеет положительный заряд, он эффективно связывается на катионообменной смоле и элюируется раствором солей. Поскольку лактоферрин связывает Fe3+, он может быть очищен с помощью аффинной хроматографии ионов металлов [37].
Другие используемые методы включают аффинную хроматографию с иммобилизацией таких материалов, как: гепарин, синяя краска, -лактоглобулин, антитела или ДНК. Кроме того, металл-хелатная аффинная и гидроксиапатит колоночная хроматографии были использованы для очистки лактоферрина [4, 39].
Однако часто, степень очистки, полученных в промышленных масштабах препаратов, является неудовлетворительной. Препараты могут быть загрязнены протеазами или фрагментами протеолитической деградации лактоферрина. Некоторые исследователи использовали ПАВ в сочетании с гидрофобной хроматографей для очистки лактоферрина от примесных белков. Wetlaufer и Koenigbauer, Рухадзе и др. показали, что поверхностно-активные вещества могут изменить удерживание белков гидрофобными адсорбентами [6, 26].
Впервые в промышленном масштабе бычий лактоферрин был получен в Бельгии в 1985 г. В 1989 году MILEI GmbH в Германии основано производство лактоферрина из сыворотки, получаемой при производстве сыра и молока по технологии, разработанной Milk Industry Co., Ltd в 1986 году. Сюда из европейских стран поступает около 600–700 тыс. т молока в год, которое перерабатывается по схеме безотходного производства. Используя преимущественно мембранную технологию, из обезжиренного молока и подсырной сыворотки вырабатывается в год около 30 т лактоферрина с чистотой не менее 96 % [4]. В мире производится около 60 т коровьего лактоферрина в год. Кроме Японии и Германии лактоферрин вырабатывают в промышленных масштабах в: MILEI в Германии, DMV International в Нидерландах, DOMO Food Ingredients в Бельгии, Tatua Nutritionals и Fonterra Новой Зеландии, MG Nutritionals в Австралии и Armor Proteins во Франции. Наиболее крупные биофабрики находятся в Японии, Новой Зеландии и США. В России продукция с коровьим лактоферрином, производимая небольшими предприятиями, пока ничтожно мала, несмотря на высокий потенциал соответствующих ресурсов, прежде всего вторичного молочного сырья. Правда, в последнее время намечается положительная тенденция в вопросах переработки молочной сыворотки с использованием инновационных разработок на основе нанотехнологий [6, 37]. Практическое применение лактоферрина началось в 1986 г., с производства японской компанией Morinaga Milk Industry детского питания – «BF-L dry milk», обогащенного коровьим лактоферрином. Добавление лактоферрина в детское питание способствовало улучшению микрофлоры кишечника (стимулировало рост молочнокислых бактерий Bifidobacterium и Lactobacillus), повышению уровня сывороточного ферритина и гематокрита, снижению количества заболеваний дыхательных путей. Кроме того, лактоферрин препятствовал окислению липидов в детком питании. В настоящее время детское питание, обогащенное коровьим лактоферрином, продается в Японии, Южной Кореи и Индонезии [4, 39].
Йогурт и пищевые добавки с лактоферрином японской компании Morinaga способствует устранению симптомов ротавирусной инфекции. Лактоферрин-содержащие пищевые проукты разрабатываются также в Австралии компанией Tatura milk. Помимо молочных продуктов и пищевых добавок они включают специальные композиции для спортсменов. Производится также лактоферрин-содержащий кефир, способствующий стимуляции роста костной ткани [39].
В последнее время перечень продуктов, содержащих коровий лактоферрин, значительно расширился (таблица 1.3.1) [6, 4].
Предложенные применения очищенного лактоферрина включают также: пищевые консерванты, пищевые добавки, препараты железа, фармацевтические препараты, спортивное питание, пищевые продукты, жевательные резинки, жидкость для полоскания рта и косметика. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) США оценило лактоферрин и считает его безопасным компонентом (пищевых продуктов и медикаментов США, 2001). В мясной промышленности, лактоферрин может быть использован как компонент, уменьшающий рост загрязняющих бактерии и позволяющий продлить срок годности. Лактоферрин может заменить пищевые и кормовые добавки в качестве консерванта. Лактоферрин используется в качестве добавки в корм для телят, для профилактики диареи новорожденных и для увеличения веса. Лактоферрин также может стимулировать усвоение углеводов [26, 39].
Методы исследования
Известно, что тепловая обработка лактоферрина может привести к денатурации лактоферрина и потери физиологической активности. Правильно лиофилизированный препарат может поддерживать адекватную физическую и химическую стабильность во время транспортировки и длительного срока хранения, даже при комнатных темепературах.
Основная функция сублимационной сушки является отделение растворителя от растворенного вещества, чтобы минимизировать термическую деструкцию продукта, для предотвращения вспенивания продукта при применении вакуума. Целью оптимизации лиофилизации было изучение влияния различных наполнителей и условий циклов лиофилизации на стабильность продукта. Циклы лиофилизации лактоферрина В отличие от многих обычных методов сушки, которые используют испарение как механизм сушки, в ходе сублимационной сушки растворитель сначала затвердевает (Шаг 1: замораживание) и впоследствии удаляется из системы с помощью сублимации (Шаг 2: первичная сушка). Чтобы достичь желаемого остаточного уровня растворителя используют еще шаг десорбции (Шаг 3: вторичная сушка).
Замораживание является важным этапом, поскольку микроструктуры, образующиеся при замерзании, определяют качество конечного продукта и показатели первичной и вторичной сушки. При замерзании повышается вероятность агрегации, изменения рН за счет кристаллизации буферных солей, снижение гидрофобного взаимодействия, формирования большего размера кристалов и увеличение ионной силы. Смещение рН может быть уменьшено за счет оптимального выбора буфера (т. е. избежать использования сукцината, фосфат) или за счет снижения концентрации буфера, что будет рассмотрено на следующем этапе оптимизации. Образцы лактоферрина с различными наполнителями замораживали до -40 С до полного отвердевания.
На этапе первичной сушки давление в камере снижается до 1 мбар и температура повышается для проведения процесса сублимации кристаллов льда, образующихся при замерзании. Применение вакуума приводит к свободному перемещению водяного пара из замороженной массы.
Есть только два параметра процесса, которыми управляли на этапе первичной сушки: 1) давление в камере, 2) температура полки.
Первичная сушка осуществляется при низком давлении 1 мбар для повышения скорости сублимации льда. Температура полки является важным параметром, так как она влияет на скорость сушки, управляя температурой продукта благодаря равномерной передачи тепла и / или путем предоставления необходимой энергии для сублимации. Температура полки в случае трех рассматриваемых циклов варьировалась: оставалась неизменной после стадии замерзания -40С или повышалась до -15 С или -20 С (рисунок 3.2.1
Цель вторичной сушки - это уменьшение несвязанной воды (влаги) на уровне, которая является оптимальной для стабильности (менее 1%) конечного продукта. Температура полки была значительно выше (45С), чем для первичной сушки. Для лактоферрина в процессе сушки температура образца не должна превышать критическую 50-55С, превышение которой приводит к полной денатурации белка. Температура увеличивалась медленно, потому что быстрый рост температуры мог привести к распаду продукта из-за наличия высокой остаточной влажности, которая присутствует в аморфных продуктах. Циклы, рассматриваемые в данном исследовании преставлены в таблицах 3.2.1- 3.2.3.
Изучение свойств лактоферрина
Для определения локализации капсул в клетках исследована серия оптических срезов (Z-серия), выполненных на разных уровнях в плоскости, перпендикулярной оптической оси. Это позволило определить, что капсулы действительно находятся в той же плоскости, что и ядро клетки (окрашенное синим на рисунке 3.4.26), а не прикреплены к поверхности клетки (не находятся выше центрального положения осевой клеточного ядра).
Чтобы установить возможность дальнейшего использования оболочек, а также эффективность для доставки лактоферрина была исследована их цитотоксичность для клеток MCF-7.
Для этого были получены пустые капсулы в качестве контроля и микроконтейнеры с преинкапсулированным лактоферрином. К клеткам MCF-7, образующим монослой на дне планшета, заполненной питательной средой, добавляли полученные капсулы в концентрации 50 капсул на клетку. Цитотоксичность капсул определяли через 24, 48, 72 и 144 ч инкубации при +37 С и 5% CO2 методом восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5 дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест), позволяющего определить активность дегидрогеназы в метаболически активных клетках. Результаты представлены на рисунке 3.4.27. клетки с инкапсулированным 48 72 Продолжительность, ч 144 ЛФ Рисунок 3.4.27 - Количество жизнеспособных клеток в % с пустыми капсулами, свободным и инкапсулированным лактоферрином относительно клеток, культивируемых в отсутствии капсул (100%), измеряемого с помощью МТТ-теста. Концентрация клеток - 1105 в лунке во всех случаях. Каждая полоса представляет собой среднее из трех проб
Установлено, что жизнеспособность клеток снизилась незначительно, когда клетки культивировали с пустыми микрокапсулами ( 10%), что позволяет говорить о незначительной токсичности Parg[BSAA]4 капсул. После 24 часов инкубации жизнеспособность клеток с пустыми капсулами и капсулами с инкапсулированным лактоферрином находилась примерно на одинаковом уровне, что говорит о том, что лактоферрин оставался заключенным в капсулы и разрушения оболочки не происходило. В отличие от капсулированного лактоферрина, свободный белок приводил к снижению жизнеспособности на 38% по сравнению с контролем (клетками без добавок).
После 24 часов инкубации клеток с инкапсулированным лактоферрином происходило постепенное уменьшение жизнеспособности с 76,22% и 69% после 48 и 71 ч соответственно до 67,7% после 144 ч инкубации, что может быть связано с постепенным разрушением капсулы и выпуске активного вещества. При этом жизнеспособность клеток с инкапсулированным ЛФ на протяжении всего периода инкубации была выше клеток со свободным ЛФ, что можно объяснить медленным выпуском и 35% -ным поглощением капсул клетками.
В свою очередь, свободный лактоферрин приводил к снижению жизнеспособности на 38-52%, однако, после 144 ч отмечено небольшое повышение жизнеспособности клеток, что возможно связано с релапсом.
Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о пролонгированном действии инкапсулированного препарата, в то время как эффективность свободного препарата с течением времени снижается
Технологическая схема производства инкапсулированного лактоферрина представлена на рисунке 3.5.1, она включает следующие операции: приемка, подготовка и хранение сырья, очистка полученного лактоферрина, сушка препарата, капсулирование лактоферрина, холодная стерилизация, придание товарной формы, маркировка, транспортирование и хранение.
Препарат должен вырабатываться по ТУ 9381-001-02068315-11 и изготавливаться по технологической инструкции, утвержденной в установленном порядке, с соблюдением санитарных норм и правил и соответствовать Единым санитарно-эпидемиологическим и гигиеническим требованиям к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) (ТС ЕврАзЭС). Все поступающее сырье, вспомогательные тароупаковочные материалы, должны отвечать требованиям действующих стандартов, технических условий, санитарных норм и правил, гигиенических нормативов. Приемку сырья, вспомогательных материалов для производства производят партиями, при наличии удостоверения о качестве и безопасности и санитарно-эпидемиологического заключения.