Введение к работе
Актуальность работы. В последние годы обнаружена группа заболеваний, характеризующихся прогрессирующим поражением различных отделов нервной системы и имеющих необычный генетический механизм возникновения и развития. Прионные инфекции – категория трансмиссивных нейродегенеративных болезней животных и человека, объединенных на основе общности этиологии и клинических симптомов. Возбудителями заболевания являются прионы. Основные характеристики – длительный инкубационный период, медленно прогрессирующее течение, патологические изменения третичной структуры белка, вследствие чего нарушаются механизмы функционирования нервных тканей, отсутствие признаков инфекционного воспаления и иммунного ответа, неизбежный летальный исход.
Начало заболевания наступает, как правило, в среднем или позднем возрасте. Заражение человека чаще всего происходит при употреблении в пищу мясопродуктов, полученных от зараженных животных, либо при нейрохирургических вмешательствах, трансплантации тканей, назначении гормонов, полученных от зараженных доноров с нераспознанной прионной инфекцией, использовании для полива зараженных сточных вод.
В связи с вероятностью возникновения прионных заболеваний у человека и животных, что впоследствии может привести к их массовому распространению, а также в связи с неизбежной летальностью заболеваний, необходима разработка действенных методов диагностики, в том числе на ранних стадиях возникновения заболеваний.
Основными методами диагностики прионных заболеваний животных остаются различные варианты иммунологического анализа, а именно: иммуногистохимическое выявление аномальной формы приона на срезах тканей мозга, электроэнцефалография, вестерн-блоттинг и иммуноферментный анализ.
Существующие методы диагностики прионных инфекций в качестве объекта исследования используют ткани мозга животных или лимфоидные ткани. В процессе переработки животного сырья возможна перекрестная контаминация и заражение патогенной формой прионного белка нормальных прионов, присутствующих в других частях туши.
Данные методы имеют различную диагностическую ценность – одни требуют значительных затрат по времени, другие обладают низкой чувствительностью и специфичностью, высокой инфекционной опасностью для оператора.
Поэтому усовершенствование и разработка более чувствительных и специфичных, а также экспрессных методов идентификации патогенной формы прионного белка остаются актуальной проблемой.
Таким методом может быть разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР имеет ряд преимуществ – прямое определение ДНК возбудителя, высокая специфичность, высокая чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, сравнительно небольшие затраты времени на проведение анализа.
Степень проработки темы исследований. Постоянно увеличивающийся теоретический интерес к проблеме диагностики прионных заболеваний обусловлен результатами молекулярно-биологических исследований структуры прионных белков, позволивших собрать и систематизировать значительный материал о структуре, функции и накоплении в зараженном организме человека и животных данных инфекционных агентов, и определить новые направления в дальнейших подходах к диагностике и терапии прионных болезней.
Исследования по изучению прионов и вызываемых ими болезней обобщены в трудах российских и зарубежных ученых: В.Б. Григорьева, В.А. Зуева, В.И. Покровского, S. Prusiner (Стенли Прузинера), А. Aguzzi (Адриано Агуззи) и др.
Цель и задачи исследований. Целью работы является разработка прототипов молекулярно-генетических тест-систем для выявления патогенного прионного белка крупного рогатого скота.
Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:
- определить среди исследуемых объектов образцы животного происхождения с наиболее высокой степенью потенциальной опасности в отношении продукции патогенных форм прионного белка;
- провести анализ нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей синтез патогенного прионного белка крупного рогатого скота;
- сконструировать олигонуклеотидные праймеры для амплификации специфических последовательностей патогенного прионного белка крупного рогатого скота;
- выбрать параметры и провести оптимизацию процессов амплификации фрагментов гена патогенного прионного белка;
- разработать положительный контрольный образец, являющийся индикатором работы амплификационной смеси и маркером длины ПЦР-продуктов;
- разработать внутренний контрольный образец для оценки эффективности проведения анализа;
- изучить специфичность разработанной ПЦР-системы и олигонуклеотидных праймеров;
- оценить условия хранения ПЦР-тест-системы;
- провести испытания, направленные на установление сроков пригодности ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота.
Научная новизна работы:
- исследована и оптимизирована температура отжига олигонуклеотидных праймеров, которая составила: для левого праймера 56С, для правого праймера 55,80С;
- экспериментально исследован и разработан состав реакционной смеси;
- разработан положительный контрольный образец, являющийся индикатором работы амплификационной смеси и маркером длины ПЦР-продуктов для последующей электрофоретической детекции;
- разработан внутренний контрольный образец с оптимальной концентрацией 1 пг в ПЦР-пробе, который добавляется на этапе выделения ДНК и исключает ошибки исследователя при постановке реакции;
- определены оптимальные условия хранения (в сухом, защищенном от света месте при температуре 4±2С) и установлены достоверные сроки пригодности ПЦР-тест-системы (4 месяца, при соблюдении условий хранения).
Показано, что разработанная ПЦР-тест-система имеет ряд конкурентных преимуществ по сравнению с имеющимися на мировом рынке аналогами для определения патогенной формы прионного белка – обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет проводить диагностику прионных заболеваний на ранних стадиях возникновения, способствует снижению инфекционной опасности для оператора при исследовании пробы, находящейся в закрытой пробирке.
Практическая значимость работы заключается в разработке ПЦР-тест-системы, позволяющей осуществлять прижизненную идентификацию патогенного прионного белка у животных в ветеринарии, контроль качества сырья животного происхождения при производстве препаратов медицинского назначения, оценку содержания патогенной формы прионного белка животного происхождения в продуктах питания, производимых пищевой промышленностью.
По результатам исследований разработан проект технических условий и методические указания по использованию ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы». Государственный контракт от «16» февраля 2011 г. № 16.512.11.2077.
Методология и методы исследования. Определение содержания общего белка в пробах проводили по методике выполнения измерений массовой доли общего и белкового азота в мясе, мясных продуктах и белоксодержащих пищевых продуктах методом сжигания по Дюма на анализаторе белкового азота «Rapid N cube».
Молекулярно-массовое распределение белков в объектах оценивали с помощью белкового электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) методом Лэмли. Просмотр и фотографирование гелей проводили на УФ-трансиллюминаторе TCP-20M («Vilber Lourmat», США) при длине волны излучения – 312 нм.
Идентификацию белков проводили методом фингерпринта пептидных масс, для чего получали масс-спектр аминокислотной последовательности белка после проведения гидролиза трипсином в ПААГ. Масс-спектры обрабатывались с помощью программы «FlexAnalysis 2.4».
Для анализа последовательностей ДНК, кодирующей синтез гена PRNP прионного белка, использовали базу данных NCBI.
Для сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей синтез гена PRNP прионного белка, и построения филогенетического дерева была использована компьютерная программа «CrustalW».
Компьютерный анализ подбора праймеров для амплификации специфических последовательностей патогенного прионного белка проводили с помощью программ: «NSBI Blast2» – для определения гомологии при секвенировании соответствующих праймеров, «Primer3 Output» – для подбора и оценки параметров праймеров.
Исследования с использованием метода ПЦР в режиме реального времени были осуществлены в соответствии с требованиями нормативно-технической документации относительно определения патогенных микроорганизмов в продуктах переработки крупного рогатого скота (ГОСТ Р 52833-2007(ИСО 22174:2005) и МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности»).
Степень достоверности и апробация работы. Основные положения диссертации получили одобрение на научно-практических конференциях, в том числе: на Международном научном форуме «Пищевые инновации и биотехнологии» (г. Кемерово, 2013г.), VII Международной научно-практической конференции «Тенденции и инновации современной науки» (г. Краснодар, 2013), VI Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (г. Бийск, 2013), Международной научно-практической конференции «Проблемы развития биотехнологий» (г. Екатеринбург, 2013), Международной научно-практической конференции «Техника и технологии: роль в развитии современного общества» (г. Краснодар, 2013), II Международной научно-практической конференции «Сельскохозяйственные науки и агропромышленный комплекс на рубеже веков» (г. Новосибирск, 2013), VI Международной студенческой научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии» (г. Ульяновск, 2013).
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе две статьи в отраслевых журналах, рекомендованных ВАК: «Техника и технология пищевых производств», «Фундаментальные исследования».
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих основных разделов: введение, аналитический обзор, организация, объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, практическая реализация результатов исследований, выводы, список использованных источников и приложения. Основное содержание работы изложено на 146 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц и 29 рисунков. Список литературы включает 158 наименований.
