Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Аналитический обзор литературы 11
1.1 Состояние рынка говядины в России .11
1.2 Послеубойные автолитические изменения, происходящие в мясе 13
1.3 Характеристика качественных групп мяса 17
1.4 Холодильная обработка мяса .19
1.5 Влияние способов замораживания на созревание мяса 25
1.6 Влияние способов низкотемпературной обработки мяса на изменения содержания свободных нуклеотидов .29
1.7 Современные методы идентификации качественных показателей мяса .39
1.8 Спектрофотометрические методы анализа 45
1.8.1 Инструментальные средства спектрофотометрического анализа 45
1.8.2 Спектры поглощения 46
1.8.3 Качественный анализ методом спектрофотометрии .47
1.8.4 Оптическая плотность свободных нуклеотидов мяса 48 Заключение к аналитическому обзору литературы .51
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследований .53
2.1 Организация экспериментальных исследований 53
2.2 Объекты исследований 54
2.3 Методы исследований
2.3.1 Определение величины рН мяса 56
2.3.2 Определение потери мышечного сока 57
2.3.3 Экстракция свободных нуклеотидов и нуклеозидов мяса 57
2.3.4 Определение свободных нуклеотидов и нуклеозидов мяса методом ВЭЖХ 58
2.3.5 Определение оптической плотности растворов свободных нуклеотидов и нуклеозидов спектрофотометрическим путем .58
2.3.6 Определение и контроль параметров процессов замораживания и размораживания мясного сырья 59
2.3.7 Методика математико-статистической обработки результатов исследований 59
ГЛАВА 3 Экспериментальная часть 61
3.1 Результаты исследований качественного состава и количественного содержания свободных нуклеотидов и нуклеозидов мяса методом ВЭЖХ..62
3.2 Результаты спектрофотометрических исследований растворов эталонных веществ свободных нуклеотидов и нуклеозидов 65
3.3 Результаты спектрофотометрических исследований экстрактов свободных нуклеотидов мяса 73
3.4 Исследование динамики оптической плотности экстрактов свободных нуклеотидов при хранении мяса, замороженного в парном виде и после охлаждения 81
3.5 Проведение производственной проверки и апробации сф-метода в условиях аккредитованных лабораторий 86
3.6 Оценка достоверности данных по идентификации мяса, замороженного в парном виде или после охлаждения, полученных методом ВЭЖХ и сф-методом 91
3.7 Определение потерь массы и степени сокращения при размораживании мышц, замороженных в парном виде и после охлаждения 95
3.8 Расчет экономической эффективности применения метода идентификации мяса, замороженного в парном виде или после охлаждения 101
Заключение .105
Список использованной литературы 107
Список сокращений, приведенных в работе 1
- Послеубойные автолитические изменения, происходящие в мясе
- Определение величины рН мяса
- Результаты спектрофотометрических исследований растворов эталонных веществ свободных нуклеотидов и нуклеозидов
- Определение потерь массы и степени сокращения при размораживании мышц, замороженных в парном виде и после охлаждения
Послеубойные автолитические изменения, происходящие в мясе
В послеубойный период свойства всех тканей животного организма значительно изменяются. Общее направление данных изменений может быть охарактеризовано как распад биологических систем. Причина распада – нарушение обмена веществ в тканях из-за прекращения поступления кислорода, синтеза и выработки энергии. Обратимые прижизненные процессы обмена веществ становятся необратимыми. Начинается самораспад, или процесс автолиза тканей (Криштафович В. И. и др., 2005; Смородин А. В. и др., 2009; Li S. et. al., 2012).
Исследования в области созревания мяса проводили многие отечественные и зарубежные ученые Антипова Л.В., (2001); Дибирасулаев М.А., (2002); Лисицын А.Б., (1996); Пискарев А.И., (1971); Соловьев В.И., (1966); Кудряшов Л.С., (1992, 2014).; Aristov C,(2001); Honikel K., (1978); Toldra F., (2001).
Развитие автолитических процессов мышечной ткани проходит в определенной последовательности этапов автолиза: парное мясо, посмертное окоченение, разрешение посмертного окоченения, созревание, глубокий автолиз. Качественные показатели мяса при этом существенно отличаются.
Парное мясо. В таком мясе мышечная ткань находится в расслабленном состоянии, рН среды составляет 6,8–7,2. Мясо характеризуется мягкой консистенцией, обладает значительной влагосвязывающей и влагоудерживающей способностью. Вкус и аромат не выражены. После убоя КРС, при температуре 0…+4С спустя 24-48 часов начинается процесс развития посмертного окоченения – «rigor mortis», а при более высоких температурах процесс посмертного окоченения развивается быстрее (Кудряшов Л.С. 2008).
Посмертное окоченение. По мере развития «rigor mortis», мясо становится жестким, теряет эластичность, с трудом поддается механической обработке. Жесткость мяса сохраняется и после варки. Резко уменьшается влагосвязывающая способность, достигая минимума к моменту полного развития окоченения. Вкусо-ароматические показатели такого мяса не выражены. Активная кислотность среды смещается в кислую сторону (рН 5,5–5,6). В работах Кудряшова Л. С. утверждается, что гликолитические процессы, приводящие к накоплению молочной кислоты и снижению рН мяса, в основном завершаются через 24 ч хранения при температуре плюс 4 С. Разрешение мышечного окоченения наступает после 24–48 ч (Каимбаева Л.А. и др., 2011; Кудряшов Л.С. и др., 2001). Скорость прохождения процесса посмертного окоченения в мышцах связана с температурой. Для КРС при температуре близкой к нулю, окоченение наступает через 18–24 ч и вдвое быстрее развивается при 15–18 С (Месхи А. И., 1984).
Посмертное окоченение мышц обусловлено развитием сложных биохимических процессов: деградация гликогена, распад креатинфосфорной кислоты и свободных нуклеотидов, образование актином и миозином актомиозинового комплекса, изменение гидратации мышц. Описанные выше процессы являются или прямой причиной наступления окоченения, или оказывают на него косвенное влияние (Ребезов М. В. и др., 2012). С прекращением поступления кислорода в организм, ресинтез гликогена в мясе после убоя заканчивается, и начинается его анаэробный распад - гликолиз. Он идет по пути фосфоролиза и амилолиза при участии АТФ. Гликоген путем ряда преобразований образует молочную кислоту. Содержание гликогена в мышцах перед убоем животного имеет важное значение и может варьироваться в пределах от 200 до 1000 мг % и более. В соответствии с этим меняется и концентрация молочной и ортофосфорной кислот и как следствие - величина рН. В результате накопления в мясе молочной и фосфорной кислот в среде увеличивается концентрация ионов водорода, в результате чего к 24 ч рН снижается до 5,5-5,7 (Berri С. et. al., 2005; Huff-Lonergan E. et. al., 2005; Pighin D. et. al., 2014).
Спустя 24 ч гликолиз приостанавливается, так как содержание АТФ практически исчерпывается и происходит накопление молочной кислоты. Ферментативный распад гликогена – обеспечивает запуск последующих физико-химических и биохимических процессов (Aliani M. et. al., 2013; Shen Q. et. al., 2015).
Стоит отметить чрезвычайно важную роль макроэргических соединений. Под воздействием аденазинтрифосфотазы АТФ распадается до АДФ и свободного неорганического фосфата, при этом высвободившаяся химическая энергия переходит в механическую энергию сокращения мышц, скорость развития окоченения напрямую зависит от количества АТФ. Учитывая важную роль нуклеотидов в созревании мяса данный вопрос рассмотрен отдельно, см. пункт 1.6. (стр. 30).
После убоя животного падает экстрагируемость миозина и сохраняется на протяжении 20-24 ч хранения мяса. В первые 3-5 часов после убоя, пока содержание АТФ достаточно высоко актин наблюдается в глобулярной форме. Волокна мышечной ткани расслаблены, сократительные белки характеризуются высокой гидратацией. При взаимодействии актина с миозином наблюдается образование актомиозина, что приводит к понижению водосвязывающих свойств мышечной ткани (Кудряшов Л.С., 2008; Соловьев В.И., 1966; Li S. et. al., 2012). Волокна мышечной ткани переходят в состояние посмертного окоченения неравномерно, это явление объясняется неоднородностью распределения ферментов (Lomiwes D. et. al., 2014). Пик снижения водосвязывающей способности мышечной ткани отмечен на 20–24 ч после убоя животного и затем, продолжает очень медленно повышаться, но так и не достигает исходного уровня. Посмертное окоченение непосредственно включается в процесс созревания мяса.
Созревание мяса – это комплекс изменений его свойств, обусловленных развитием автолиза, в результате которых мясо приобретает свойственный ему аромат, вкус, становится мягким, сочным и более доступным действию пищеварительных ферментов по сравнению с мясом в состоянии посмертного окоченения.
На практике для говядины при 0 С пик окоченения приходится на 24–28 ч. Затем происходит разрешение посмертного окоченения: мышцы расслабляются, снижаются прочностные характеристики мяса, повышается влагосвязывающая способность. Сущность механизма, описываемого явления, еще недостаточно изучены и ясны. Очевидна связь ослабления поперечных связей актина и миозина с дальнейшей ассоциацией комплекса. В производственных условиях данный процесс протекает при выдержке туш в остывочных камерах (48-72 ч с момента убоя животного) при температуре 2–4 С. Как правило, для говядины с нормальным развитием автолиза ее нежность и водосвязывающая способность достигают своей оптимальной величины в следующие сроки: при 0–5 С – 12 суток, при 8–10 С – 5–6 суток. Органолептические показатели достигают оптимума на 10–14 сутки. В дальнейшем улучшение аромата и вкуса не наблюдается (Ребезов М. Б. и др., 2012).
Определение величины рН мяса
Изменение массы блоков мяса и бескостных отрубов в процессе размораживания и хранения в размороженном виде определялись путём поштучного взвешивания на весах ВСП-30/10-3 (интервал взвешивания от 200 г до 30 кг, погрешность ±10 г) и на малых весах марки ВСП-1 (интервал взвешивания от 1 кг до 3 кг, погрешность ±0,5 г). Потери массы от вытекания сока (%) определяются по разности массы мяса до и после размораживания по формуле 3:
Свободные нуклеотиды экстрагировали по стандартной методике экстракции аденинсодержащих нуклеотидов мышечной ткани. Экстракция осуществлялась с помощью 0,6 М хлорной кислоты, мышечная ткань тщательно растиралась и смешивалась с раствором хлорной кислоты, таким образом, при дальнейшем центрифугировании получали безбелковый раствор свободных нуклеотидов мяса. Перед количественным и качественным определением свободных нуклеотидов методом ВЭЖХ и спектрофотометрическим методом проводилась нейтрализация хлорной кислоты 0,1 М раствором гидроксида калия (Северин С. Е. и др. 1989).
Для анализа свободных нуклеотидов и нуклеозидов мяса использовали метод ВЭЖХ. В настоящее время - это один из распространенных лабораторных методов анализа органических соединений. Он позволяет проводить разделение веществ на основании их различий в гидрофобных свойствах молекул веществ-аналитов. Возможность использовать сорбенты с привитыми гидрофобными заместителями в сочетании с растворителями разной элюирующей силы позволяет изменять селективность хроматографической системы в очень широких пределах (Lough W., 1996). Содержание свободных нуклеотидов и нуклеозидов мяса определяли на универсальном жидкостном хроматографе "agilent-1200" Agilent Technologies (USA) на колонке Phenomenex Sphere Clone ODS (2) 250 4/6,5 мкм.
Спектрофотометрический метод определения адениновых нуклеотидов основан на измерении светопоглощения в ультрафиолетовой области. Растворы нуклеотидов обладают характерными пиками поглощения при длинах волн 260 и 250 нм, обусловленными содержанием в составе молекул аденозиновой и инозиновой группы соответственно.
Измерения осуществлялись с применением спектрофотометра SPEKOL-1500 analуtik JENA (Германия) и специализированного программного обеспечения «Win ASPECT», а так же на спектрофотометрах других фирм производителей - Cary 50 Bio «Agilent Technologies» (США), UV-3600 Shimadzu (Япония). 2.3.6 Определение и контроль параметров процессов замораживания и размораживания мясного сырья
Определение температуры
Измерение температуры в процессе замораживания/размораживания мясного сырья проводили с помощью самопишущего электронного измерителя температуры - «ИС-203.2», производства «ТЕХНО-АС» (Россия) с заданным интервалом времени между измерениями путем непосредственного контакта прибора с объектом измерения с последующей компьютерной обработкой полученных данных. Определение относительной влажности воздуха Определение величины относительной влажности воздуха в процессе охлаждения, замораживания, хранения и размораживания мяса определяли с помощью пишущего термогигрометра - «ДВ-2-ТСМ», производства «МИКРОФОР» (Россия) с последующей обработкой данных на компьютере. Определение скорости движения воздуха Величину скорости движения воздуха в камерах холодильной обработки и хранения измеряли термоанемометром «ТТМ-2-01М» (Россия) с диапазоном измерения скорости движения воздуха от 0,1 до 20 м/с, погрешность ±0,1 м/с.
Экспериментальные данные, полученные в результате проведенных исследований, были подвергнуты статистической обработке. Минимальная повторность анализов при выполнении экспериментальных исследований принята 5-ти кратной. При этом определялись основные статистические показатели, необходимые для оценки достоверности различий внутри и между вариантами опытных данных (Ахназарова С. А. и др., 1985). Статистическую обработку результатов исследований осуществляют с применением пакета прикладных программ DataFit 8.2, MS Excel 2007.
Результаты спектрофотометрических исследований растворов эталонных веществ свободных нуклеотидов и нуклеозидов
Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, было показано, что количественный состав свободных нуклеотидов в мясном сырье может быть использован для различия мяса, замороженного в парном виде и после охлаждения. Однако данный метод имеет ряд недостатков, препятствующих его внедрению для производственного контроля. Поэтому существует необходимость в разработке альтернативного метода более простого, быстрого и применимого на производстве. В рамках данного исследования нами было предложено разработать метод, основанный на принципах спектрофотометрии, так как эти методы обладают, как правило, всеми перечисленными характеристиками. Для этого нами были проведены спектрофотометрические исследования на монорастворах препаратов веществ высокой степени чистоты АТФ, АДФ, АМФ, ИМФ (свободные нуклеотиды), инозина и гипоксантина (нуклеозиды).
Характерные спектры поглощения монорастворов препаратов чистых веществ свободных нуклеотидов и нуклеозидов Анализ спектров поглощения показывает, что АТФ имеет характерный максимум поглощения, который наблюдается при длине волны 260 нм, АДФ – при 259 нм, для АМФ – при 260 нм, для ИМФ – при 250 нм, для инозина – при 250 нм, для гипоксантина – при 249 нм.
Таким образом, показано, что вещества, содержащие аденозин (АТФ, АДФ, АМФ), имеют максимум поглощения в диапазоне длин волн 259–260 нм, а инозиновая кислота, инозин и гипоксантин – при 249–250 нм. Доминирующее значение при определении термического состояния мяса, замороженного в парном виде или после охлаждения, имеют вещества АТФ и ИМФ, так как на их долю приходится наибольшая концентрация. После определения спектрофотометрических характеристик монорастворов эталонных веществ высокой степени чистоты АТФ, АДФ, АМФ, ИМФ (свободные нуклеотиды), инозина и гипосантина (нуклеозиды), были изучены смеси растворов свободных нуклеотидов и нуклеозидов в концентрациях, идентичных по их содержанию в мясе, замороженном в парном виде или после охлаждения (рисунок 3.3).
Данные о количественном содержании веществ для корректного приготовления растворов свободных нуклеотидов и нуклеозидов были получены на основе проведенных нами исследований с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (таблица 3.1). Из рисунка 3.3 видно, что максимум спектра поглощения смеси свободных нуклеотидов и нуклеозидов, идентичных по их содержанию в мясе, замороженном в парном виде, наблюдается в диапазоне длин волн 259±0,6 нм, характерном для аденозиновых нуклеотидов - АТФ, АДФ, АМФ, в то время как, высота максимума спектра поглощения смеси свободных нуклеотидов и нуклеозидов, идентичных по их содержанию в мясе, замороженном после охлаждения, приходится в области длин волн 249±0,5 нм, характерной для инозиновой кислоты и нуклеозидов. Максимумы спектров поглощения смесей свободных нуклеотидов и нуклеозидов, адекватных по их содержанию в мясе, замороженном в парном виде или после охлаждения достоверно отличны друг от друга при р 0,01, п=20.
Спектры поглощения растворов, показанные на рисунке 3.3, представляют собой сумму спектров поглощения каждого компонента смеси растворов нуклеотидов и нуклеозидов, входящих в их состав. Высота пика спектра поглощения смеси свободных нуклеотидов, складывается из каждого соединения обладающего собственным поглощением. Вещества, содержащие аденозин (АТФ, АДФ, АМФ), имеют максимум поглощения в диапазоне длин волн 259-260 нм (что характерно для мяса, замороженного в парном виде), а инозиновая кислота, инозин и гипоксантин - при 249-250 нм (что характерно для мяса, замороженного после охлаждения).
Таким образом, при проведении исследований, нами были определены два характерных пика для спектров поглощения исследуемых растворов свободных нуклеотидов и нуклеозидов при 249-250 нм и 259-260 нм, позволяющие дифференцировать растворы свободных нуклеотидов, идентичных по их содержанию в мясе, замороженном в парном виде и после охлаждения.
Значения максимумов спектров поглощения смесей свободных нуклеотидов и нуклеозидов, в концентрациях, характерных для мяса, замороженного в парном виде или после охлаждения были измерены в двадцатикратной повторности для каждой группы растворов, данные были обработаны и представлены в виде усредненных значений и их стандартных отклонений в таблице 3.2.
Термическое состояние мяса Растворы свободных нуклеотидов и нуклеозидов, идентичные по их содержанию в мясе Замороженном в парном виде (х ±s) Замороженном после охлаждения (х ±s)
Максимум поглощения, нм 259±0,6 249±0,5 Различия достоверны по критерию Стьюдента для сравниваемых максимумов поглощения спектров свободных нуклеотидов и нуклеозидов при р 0,01 Таким образом, не смотря на то, что максимумы поглощения растворов свободных нуклеотидов и нуклеозидов, идентичных по их содержанию в мясе, замороженном в парном виде и после охлаждения, расположены достаточно близко друг к другу (таблица 3.2), они имеют достоверное отличие за счет высокой воспроизводимости данного показателя и его низкого стандартного отклонения. Это позволяет осуществить дифференцирование исследуемых растворов, с высокой степенью достоверности (р 0,01).
После определения максимумов поглощения спектров модельных растворов свободных нуклеотидов, для более полного определения признаков отличия, нами были проведены измерения оптической плотности (D) при длинах волн, соответствующих максимумам спектров поглощения для исследуемых растворов свободных нуклеотидов и нуклеозидов. Измерение оптической плотности проводили в двадцатикратной повторности для каждой группы растворов, полученные данные представлены в таблице 3.3.
Определение потерь массы и степени сокращения при размораживании мышц, замороженных в парном виде и после охлаждения
Анализ данных таблицы 3.9 позволил утверждать, что значения критерия М для мяса, замороженного в парном виде, составил - 1,10±0,07, что в 1,5 больше значений полученных для мяса, замороженного после охлаждения - 0,73±0,03.
Статистическая обработка полученных значений критерия М для мяса, замороженного в парном виде и мяса, замороженного после охлаждения, по средствам расчета критерия Стьюдента, позволила утверждать, что разница между определяемыми показателями достоверна, при уровне значимости, р 0,01 (п=10),что дало возможность с высокой долей вероятности дифференцировать исследуемое мясное сырье.
Обобщение и изучение выполненных работ опытно-промышленной апробации спектрофотометрического метода показало, что он может быть использован для идентификации термического состояния мяса, замороженного в парном виде и после охлаждения. Установлено, что данный метод является простым и быстрым и соответствует требованиям к методам для производственного контроля.
На основании результатов производственной проверки комиссией был рекомендован разработанный быстрый спектрофотометрический метод идентификации термического состояния мяса, замороженного в парном виде и после охлаждения для обоснования дифференцированных технологических режимов размораживания, обеспечивающих сохранение качества и снижения потерь бескостных мясных отрубов и блоков для использования в производственных условиях предприятия (Приложение Б).
В целях осуществления валидации и подтверждения достоверности, получаемых результатов с помощью разработанного нами метода дифференциации мяса, замороженного в парном виде и после охлаждения, были проведены сличительные испытания в трех различных организациях: - лаборатории холодильной технологии продуктов животного происхождения «Всероссийского научно-исследовательского института холодильной промышленности» (ФГБНУ ВНИХИ); - лаборатории научно-методических работ, биологических и аналитических исследований «Всероссийского научно-исследовательского института мясной промышленности им. В. М. Горбатова» (ФГБНУ «ВНИИМП им. В. М. Горбатова»); - на базе аккредитованного испытательного центра «Всероссийского научно-исследовательского института технологии консервирования» (ФГБНУ «ВНИТеК»).
В результате лабораторной апробации метода и подтверждения достоверности, получаемых с помощью него результатов выданы: - Заключение «об апробации спектрофотометрического метода ускоренной идентификации термического состояния мяса, замороженного в парном виде или после охлаждения для обоснования применения дифференцированных технологических режимов размораживания, обеспечивающих сохранение качества и снижение потерь бескостных мясных отрубов и блоков». В лаборатории Научно-методические работы, биологические и аналитические исследования ФГБНУ «ВНИИМП им. В. М. Горбатова» была проведена апробация ускоренного метода идентификации термического состояния мяса 21 декабря 2015 г. Измерение оптической плотности проведено на спектрофотометре Cary-50 Bio. Анализ и обобщение данных показали, что в результате выполненных определений показателя М, согласно предложенной методике ускоренной идентификации термического состояния мяса, замороженного в парном виде или после охлаждения, значения критерия, полученные для образцов мяса, замороженного в парном виде, достоверно различны от значений критерия, полученных для мяса, замороженного после охлаждения. Разница достоверна при р 0,001. Полученные результаты согласуются с данными, полученными в условиях лаборатории холодильной технологии продуктов животного происхождения ВНИИ холодильной промышленности. (Приложение В). - Акт «об апробации спектрофотометрического метода ускоренной идентификации термического состояния мяса, замороженного в парном виде или после охлаждения для обоснования применения дифференцированных технологических режимов размораживания, обеспечивающих сохранение качества и снижение потерь бескостных мясных отрубов и блоков».
В аккредитованном испытательном центре ФГБНУ ВНИИ технологии консервирования была проведена апробация ускоренного метода идентификации термического состояния мяса в период с 13по 15 января 2016 г. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре VarianCary-100 в режиме сканирования по длинам волн.
Анализ и обобщение данных показали, что в результаты выполненных определений критерия М, для образцов мяса, замороженного в парном виде достоверно различны от значений критерия, полученных для мяса, замороженного после охлаждения. Разница достоверна для n=5, при р 0,001.
Полученные результаты на Varian Cary-100 являются воспроизводимыми по отношению к данным, полученным на спектрофотометре Spekol-1500 в лаборатории холодильной технологии продуктов животного происхождения ФГБНУ ВНИХИ по данной методике. (Приложение Г). Таким образом, полученные результаты (акт апробации метода в производственных условиях ОАО «Мясокомбинат Клинский», заключение и акт об успешной проверке достоверности получаемых данных и апробации метода в лабораторных условиях) убедительно доказали эффективность применения, разработанного, спектрофотометрического метода идентификации мяса, замороженного в парном виде или после охлаждения, как в лабораторных условиях, так и в условиях производства.