Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Состояние вопроса, цель и задачи исследований 12
1.1. Медико-биологические аспекты создания биопродуктов для функционального питания 12 1.2. Физиолого-биохимические свойства пробиотических бактерий 16
1.3. Пути повышения метаболической активности молочнокислых бактерий 22
1.4. Сироп шиповника как дополнительный источник витаминов и микроэлементов функциональных биопродуктов 26
1.5. Особенности технологии производства сублимированных биопродуктов 27
1.6. Выводы по обзору литературы 33
ГЛАВА 2. Организация эксперимента, объекты и методы исследований 35
2.1. Организация и схема проведения исследования 35
2.2. Объекты исследований 37
2.3. Методы исследований 37
2.3.1. Методики исследований и приборное обеспечение 37
ГЛАВА 3. Разработка биотехнологии консорциума микроор ганизмов с пробиотическими свойствами 41
3.1. Обоснование выбора заквасочных культур для биопродукта 41
3.2. Изучение сочетаемости заквасочных культур и выбор оптимальных температур их развития в микробном консорциуме 47
3.3. Выбор оптимальных соотношений заквасок молочнокислых бактерий для получения консорциума 50
3.4. Исследование антагонистической активности микроорганизмов заквасок и их консорциума к тест-культурам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов 54
3.5 Исследование резистентности микроорганизмов заквасок и их микробного консорциума к антибиотикам 59
3.6. Исследование устойчивости заквасок молочнокислых бактерий и созданного на их основе консорциума микроорганизмов к фенолу, NaCl, желчи и щелочной реакции среды 60
3.7. Исследование синтеза экзополисахаридов заквасок и их микробного консорциума 62
3.8. Исследование морфологических особенностей колоний
микроорганизмов в заквасках и микробном консорциуме 64
ГЛАВА 4. Разработка технологии жидкого и сухого биопродуктов для функционального питания, изучение их качественных показателей и обоснование их сроков хра нения 68
4.1. Разработка научно-обоснованной технологии жидкого биопродукта для функционального питания 68
4.2. Разработка научно-обоснованной технологии сухого биопродукта для функционального питания 77
4.3. Изучение качественных показателей биопродуктов «Целебный-1» свежевыработанных и в процессе хранения 82
4.4. Изучение качественных показателей биопродуктов «Целебный-2» свежевыработанных и в процессе хранения 88
4.5. Оценка микробиологической и токсикологической безопасности биопродуктов 94
4.6. Изучение состава, пищевой и биологической ценности функциональных биопродуктов «Целебный» 96
4.7. Результаты производственной проверки, разработка и утверждение НТД, оценка экономической эффективности и социальной значимости разработанных технологий биопродуктов 103
Выводы
Список литературы
- Сироп шиповника как дополнительный источник витаминов и микроэлементов функциональных биопродуктов
- Изучение сочетаемости заквасочных культур и выбор оптимальных температур их развития в микробном консорциуме
- Исследование синтеза экзополисахаридов заквасок и их микробного консорциума
- Изучение качественных показателей биопродуктов «Целебный-1» свежевыработанных и в процессе хранения
Сироп шиповника как дополнительный источник витаминов и микроэлементов функциональных биопродуктов
При производстве биопродуктов на молочной основе для ферментации используют микроорганизмы, обладающие разными технологичными и функциональными свойствами. Живые микроорганизмы или ферментированные ими молочные продукты способствуют правильной работе организма человека, благотворно влияют на состояние иммунитета за счет нормализации его микробной экосистемы и могут быть использованы, как для профилактики различных заболеваний, так и для лечения [129, 132, 135].
К бактериям пробиотикам относятся представители родов Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Propionibacterium, Leuconostoc, Lactobacillus, которые входят в состав заквасок для получения ферментированных кисломолочных продуктов с пробиотическими свойствами. Молочнокислые бактерии являются важным компонентом микробного ценоза желудочно-кишечного тракта человека и животных и поэтому широко используются как основа препаратов и пищевых продуктов для бактериотерапии и бактериопрофилактики нарушений микроэкологического баланса. Бактерии пробиотики населяют кишечник человека и служат защитным барьером на пути проникновения патогенной микрофлоры [143, 145, 148].
Из литературных источников известно, что лактобактерии обладают про-теолитической, антимикробной активностью, высокой метаболической активностью, нейтрализуют токсины, нормализуют кислотно-щелочной баланс ки 16 шечника, способствуют усвоению лактозы, оказывают иммуномодулирующее действие, синтезируют экзополисахариды, устойчивы в средах содержащих желчь [2, 23, 30]. В большинстве случаев лактобактерии - это длинные «палочки» правильной формы, располагаясь как поодиночке, так и в виде коротких цепочек, иногда имеют кокковидную форму. В процессе нормального метаболизма лактобациллы производят перекись водорода, продуцируют молочную кислоту, которая способствует более полному усвоению железа, фосфора, кальция, а кислая среда стимулирует рост нормальной аутомикрофлоры кишечника, улучшает перистальтику кишечника и препятствует росту патогенных бактерий, гнилостной и газообразующей флоры. Так же они продуцируют ли-зоцим и вещества по действию схожие с антибиотиками, такие как лактоцидин, реутин, лактолин и плантарицин [32, 33, 49, 160, 161].
Продукты метаболизма лактобактерии действуют угнетающе на сальмонеллы, шигеллы, клостридии, псевдомонады, стафилококки, стрептококки, лис-терии, некоторые виды грибов. Наиболее выражена эта активность у представителей видов Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus buchneri. Подтверждено исследованиями, что Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus обладают высокими бактерицидными свойствами в отношении возбудителя сибирской язвы. Доказано подавление роста уропатогенных штаммов кишечной палочки в присутствие Lactobacillus casei [166, 170].
Потенциальная способность к накоплению биологически активных веществ пробиотическими микроорганизмами различна и зависит от видовой и штаммовой принадлежности, а так же проявляется в создании определенных условий культивирования. Важно использовать для ферментации молока и составления микробного консорциума лактобактерии, которые синтезируют экзополисахариды, что повышает вязкость и влагоудерживающую способность сгустка в готовом продукте. Экзополисахариды являются загустителями природного происхождения, улучшают консистенцию молочного продукта и тем самым повышают его потребительские свойства, а также оказывают благоприят 17
ное воздействие на организм человека посредством адгезии микроорганизмов на стенках кишечника, так же они являются стимуляторами защитных реакций организма. Молочнокислые культуры, синтезирующие экзополисахариды (ЭПС), могут способствовать наибольшему сохранению полезных свойств получаемой продукции, ее конкурентоспособности при заданных показателях качества и безопасности. В настоящее время исследование микробных полисахаридов приобрело особое значение еще и потому, что их свойства открывают возможность широкого применения экзополисахаридов в медицине, в фармацевтической промышленности, пищевой и ряде других областей народного хозяйства. [8, 10, 24, 25, 63, 131].
Лактобациллы стимулируют размножение и кислотообразование бифидо-бактерий, синтезируют витамины, а также положительно влияют на состояние здоровья человека при различных дисбактериозах, острых и хронических заболеваниях пищеварительного тракта, воспалительных процессах дыхательных путей, мочеполовой системы. Лактобациллы обладают разнообразными биологическими свойствами, активно участвуют в обменных и регуляторных процессах организма и представляют в связи с этим интерес как объект изучения для разработки пробиотических препаратов и продуктов функционального питания [19,30,69,163].
Lactobacillus acidophilus самые известные пробиотические бактерии, они обитают в тонкой кишке человека. Lactobacillus acidophilus продуцируют молочную кислоту L(+) типа, устойчивы к воздействию кислой рН среды, фенола и солей желчных кислот, имеют высокую антагонистическую активность, более чем другие штаммы пробиотиков. Lactobacillus acidophilus увеличивают устойчивость к патогенным бактериям, дрожжам и грибам, таким как Candida, сальмонелла, кишечная палочка E.coli и золотистый стафилококк. В процессе жизнедеятельности производят антимикробные соединения, или антибиотики, такие как ацидолин, лактоцидин, бактериоцин. Имеются подтвержденные данные, что Lactobacillus acidophilus способны регулировать некоторые иммунологические параметры воспаления. Повышает защитные свойства организма, стимулируя выработку интерферона. Улучшает перистальтику толстого кишечника и его опорожнение, а так же снижает уровень холестерина.
Способствует улучшению пищеварения и усвоению питательных веществ (в частности, молока и молочных продуктов, что особенно важно для лиц с непереносимостью лактозы). С использованием этой культуры разработаны, выпускаются и успешно применяются пробиотики, такие как НариЛак, Нарине, Биолакт, Ацидофилин и другие. [19, 70, 73, 170].
Lactobacillus casei - это факультативные анаэробные грамположительные палочки. Lactobacillus casei способны изменять состав и метаболическую активность кишечной флоры посредством увеличения количества бифидобакте-рий и уменьшения активности бета-глюкуронидазы в кишечнике. Обладают устойчивостью к воздействию кислотности желудочного сока. Они выделяют пептидогликан, который, поддерживает естественную защиту организма и стимулирует иммунные реакции в желудочно-кишечном тракте. Lactobacillus casei производят бактериоцины, соединения, которые ограничивают рост патогенных микроорганизмов в тонкой кишке. Некоторые исследования продемонстрировали возможность Lactobacillus casei ингибировать активность опухолевых клеток и стимулировать активность нормальных клеток. Используются Lactobacillus casei в различных БАДах (Нормоспектрум, Ультрабиотик, Ацидо-бак и др.) и биопродуктах для придания им пробиотических свойств, а также иммуностимуляторах (Имудон). На Российском рынке кисломолочных продуктов наиболее известны Actimel фирмы Данон и Imunele фирмы Вимбильдам. За рубежом широко применяется штамм Lactobacillus casei Shirota (кисломолочный напиток Yakuit) [28, ПО, 166, 170].
Изучение сочетаемости заквасочных культур и выбор оптимальных температур их развития в микробном консорциуме
Титруемую кислотность определяли по ГОСТ 3624-92 (титриметрический метод), активную кислотность определяли потенциометрическим методом на приборе рН-метр/иономер SG8-ELK Seven pro Mettler Toledo. Массовую долю общего количества белка определяли с использованием автоматической установки для определения общего азота по Кьельдалю, ГОСТ 53951-2010. Массовую долю жира определяли по ГОСТ Р 53749-2009, 29247-91, массовую долю влаги по ГОСТ 3626-73, 29246-91, массовую долю белка в СОМО по ГОСТ Р 52791-2007, массовую долю белка сухого биопродукта по ГОСТ 30648.2-99, кислотность сухого биопродукта по ГОСТ 30305.3-96, индекс растворимости по ГОСТ 30305.4-95. Массовую долю общего сахара определяли по ГОСТ 5903-89. Органолептические показатели ГОСТ 28283 - 89; ГОСТ Р ИСО 22935-2-201. Количество экзополисахаридов определяли антроновым методом [32]. Концентрации экзополисахаридов (ЭПС) определяли следующим образом: к 1 объему культуральной жидкости добавляют 4 объема дистиллированной воды и 10 объемов свежеприготовленного антронового реактива, смесь перемешивают, инкубируют на водяной бане при температуре 100 С в течение 10 минут. Приготовление антронового реактива: 0,16 г антрона растворяют в 100 мл 25,7 Н серной кислоты, перемешивают. Концентрацию ЭПС устанавливают на спектрофотометре при длине волны 620-625 нм, в качестве стандарта используют раствор глюкозы различной концентрации: 1%; 2; 3%; 4%.
Жирнокислотный состав определяли по ГОСТ Р 51483-99, минеральный, витаминный и аминокислотный составы биопродуктов определяли с использованием газожидкостного хроматографа Clams 500 фирмы Perkin-Elmer, УФ/ВИД спектрофотометра Lambda 35, жидкостного хроматографа «Series 200» Perkin-Elmer, атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно-связанной плазмой (АЭС с ИСП).
Биологическую ценность образцов определяли методом расчета аминокислотного скора. Метод основан на сравнении результатов определения аминокислотного состава белков продуктов, соответствующем аминокислотному составу «идеального белка». Перевариваемость белков биопродуктов пищеварительными ферментами «in vitro» определяли в системе «пепсин-трипсин» по общепринятой методике.
Пищевую ценность биопродуктов определяли методом расчета интегрального скора, энергетическую ценность определяли расчетным способом по общепринятой методике. Р - галактозидазную активность молочнокислых бактерий определяли по их кислотообразующей активности в молоке, путем вычисления образовавшейся в процессе сквашивания молочной кислоты.
Влагоудерживающую способность сгустков оценивали по количеству вы-делившейся сыворотки, методом центрифугирования 10 см разрушенного сгустка по методике ВНИМИ [74].
Токсические элементы определяли по ГОСТ Р 51301-99, ГОСТ 26930-86, ГОСТ 26927-86, микотоксины по ГОСТ 30711-01, антибиотики по МУК 4.1.1912-04, МУ 3049-84, пестициды по ГОСТ 23452-79 [36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 76, 80, 82, 84, 113]. Сроки годности и условия хранения пищевых продуктов по МУК 4.2.1847-04.
Методы микробиологического анализа проводили по ГОСТ 9225-84; отбор и подготовка проб для микробиологического анализа по ГОСТ Р 54004-2010; количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) по ГОСТ 10444.15-94.
Изучение свойств сочетаемости и устойчивости (к желчи, NaCl, щелочной реакции среды) микроорганизмов заквасок определяли по методикам «Сборника инструкций по селекции молочнокислых бактерий и бифидобакте-рий, и подбору заквасок для кисломолочных продуктов» и сборника «Микробиологические основы молочного производства».
Морфологию бактерий изучали путем приготовления препаратов, окрашенных метиленовым синим по Грамму, с последующим микроскопированием в иммерсионной системе с объективом 100 при помощи бинокулярного микроскопа МИКМЕД-5. Антагонистическую активность по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам изучаемых заквасок молочнокислых бактерий, а также полученного в ходе выполнения микробного консорциума, определяли методом последовательных разведений и развивающихся смешанных популяций в сравнении с ростом тест-культур в жидкой питательной среде, с последующим высевом на плотные среды по прописи. В качестве тест-микроорганизмов использовали: E.coli, S.aureus, Pr.vulgaris, Ps.mirabilis, Kl.pneumoniae, Sh.flexneri, Sh.sonnei, S.cottbus. Для количественного подсчета тест-культуру культивировали методом серийных разведений в гидролизован-ном молоке совместно с фильтратом закваски при температуре 37С в течении 18-24 ч. Резистентность к антибиотикам микроорганизмов заквасок определяли по методу серийных разведений в жидкой питательной среде по прописи [19, 35,44,113,114,].
Показатели безопасности продуктов определяли в соответствии с медико-биологическими требованиями утвержденных нормативных документов [113].
Для объективной оценки полученных результатов исследования при выполнении экспериментов применяли их математическую обработку.
Статистическую обработку экспериментальных данных по результатам 3-5 повторностей проводили по стандартным программам и алгоритмам с использованием регрессионного анализа и плана оптимизации многофакторного эксперимента [46].
Исследование синтеза экзополисахаридов заквасок и их микробного консорциума
Затем в ходе эксперимента изучали количество жизнеспособных клеток в ферментированных продуктах, титруемую кислотность, продолжительность сквашивания и влагоудерживающую способность сгустков - важные показатели для оценки свойств заквасок.
Результаты исследований отражены в таблице 3.1.1. Проведенные исследования показали, что заквасочные культуры: L-l, L-2, L-4 и БК-Алтай-Снж обладали лучшими производственно-ценными свойствами: наименьшей продолжительностью сквашивания от 7 до 10 часов, высоким количеством жизнеспособных клеток 109КОЕ-10ПКОЕ в см3 и лучшими показателями по влагоудерживающей способности, поэтому они были выбраны для создания микробного консорциума.
Закваски L-l, L-2, L-3 и бакконцентрат БК-Алтай-Снж предназначены для прямого внесения в нормализованную молочную смесь согласно инструкции по применению. Использование заквасок прямого внесения позволяет, при соблюдении технологических параметров производства, получить продукт гарантированного качества. Но возможна и предварительная активизация используемых заквасочных культур, которая позволяет сократить время получения готового продукта и интенсифицировать размножение и развитие микроорганизмов.
Активизацию БК-Алтай-Снж осуществляли следующим образом: в обезжиренное молоко первого сорта, пастеризованное при температуре (95 ± 1)С в течение (45 ± 1) мин и охлажденное до температуры (33 ± 1)С вносили концен-трат из расчета 1 порция на 1 дм молока. Предварительно сухой концентрат тщательно растирали для равномерного распределения бактериальных клеток в
Для активизации закваски L-l, L-2, L-4, сухую закваску предварительно растворяли в течение 10-15 мин. в 1 дм молока пастеризованного и охлажденного до температуры (40±1) С для L-1, (39±2) С для L-2, (41±1) С для L-4. Выдерживали в течение (0,5-1,0) час в термостате при температуре заквашивания. Затем сразу вливали в нормализованную и охлажденную до температуры сквашивания смесь, тщательно перемешивали в течение 10-15 мин. Для равномерного распределения бактериальных клеток по всему объёму молока дополнительно перемешивали смесь через 1 и 2 часа после начала активации.
В дальнейшем из заквасок был составлен микробный консорциум, в соотношении 1:1:1:1 и исследованы его свойства в сравнении со свойствами заквасок входящих в его состав [19]. Изучение сочетаемости заквасочных культур и выбор оптимальных температур их развития в микробном консорциуме
Для создания микробного консорциума с высокими пробиотическими свойствами была изучена сочетаемость исходных заквасок, входящих в его состав. Под сочетаемостью понимается способность культур создавать при совместном культивировании в молоке симбиотические взаимоотношения. Совместное применение разных культур в составе комплексной закваски может изменять биотехнологические свойства молочнокислых бактерий, например прочность сгустка и степень его восстановления после разрушения, влагоудер-живающую способность, скорость накопления молочной кислоты [97]. Сочетаемость микроорганизмов исходных заквасок определяли, оценивая количество жизнеспособных клеток, влагоудерживающую способность, лак-тосбраживающую активность, продолжительность свертывания молока микробным консорциумом по сравнению с продолжительностью свертывания молока исходными заквасками при равных органолептических показателях,.
При проведении эксперимента подбирали оптимальную температуру, при которой микробный консорциум проявил бы свои лучшие биотехнологические свойства. Приготовление заквасок к исследованию осуществлялось в соответствии с инструкциями по приготовлению и применению заквасок для кисломолочных продуктов на предприятиях молочной промышленности.
Изучение качественных показателей биопродуктов «Целебный-1» свежевыработанных и в процессе хранения
Изучены качественные показатели биопродуктов «Целебный-1», «Целебный-1» с сахаром и «Целебный-1» с сиропом шиповника свежевыработанных и в процессе хранения. В качестве контроля был использован кисломолочный продукт «Биолакт», с доказанными пробиотическими свойствами, полученный по традиционной технологии с использованием в качестве закваски двух штаммов ацидофильной палочки. Основные качественные показатели свежевыработанных биопродуктов представлены в таблице 4.3.1.
Качественные показатели биопродуктов в процессе хранения изучались в соответствии с МУК 4.2.1847-04, которые устанавливают порядок проведения и методологию санитарно-эпидемиологической оценки обоснования сроков годности и условий хранения пищевых продуктов. Отбор проб проводили на 1, 5,7,10, 15,и 20 сутки.
При проведении микробиологических исследований было установлено, что в свежевыработанных биопродуктах не были обнаружены бактерии группы кишечной палочки, патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы, дрожжи и плесени. Не отмечалось роста этих микроорганизмов в процессе хранения, что соответствует показателям безопасности по ме дико-биологическим требованиям.
Важной характеристикой пробиотических биопродуктов является их способность сохранять свои свойства в процессе хранения, поэтому изучение изменения количества жизнеспособных клеток в биопродуктах в процессе хранения является необходимым для установления сроков хранения.
В связи с этим изучали изменения качественных показателей биопродуктов в процессе хранения при температуре (4±2)С.
В ходе исследований определяли изменения органолептических и физико-химических показателей биопродуктов «Целебный-1», «Целебный-1» с са 82 харом и «Целебный-1» с сиропом шиповника и сравнивали их с контрольным образцом.
Вкус и запах Консистенция чистый кисломолочный однородная плотная вязкая чистыйкисломолочный,выраженныйоднороднаяплотнаявязкая чистыйкисломолочный,выраженный,сладкийоднороднаяплотнаявязкая чистый,кисломолочный, совкусом шиповникаоднороднаяплотнаявязкая
Цвет молочно-белый, равномерный по всей массе светло-коричневый, равномерный по всей массе
Количество клеток на начало срока годности, не менее, КОЕ/г: молочнокислых бактерий 107 1010 1010 1010
Масса продукта (г), в которой не допускаются: БГКП (колифор-мы)S. aureus патогенные, в т.ч. сальмонеллыдрожжи, не более, КОЕ/гплесени, не более, КОЕ/г ОД 1,025,0 50 50 При хранении биопродуктов было отмечено постепенное нарастание титруемой кислотности и небольшое снижение рН (рис. 4.3.1, 4.3.2).
Изменение активной кислотности биопродуктов «Целебный-1», «Целебный-1» с сахаром и «Целебный-1» с сиропом шиповника в процессе хранения. При этом нарастание кислотности у образца биопродукта «Целебный-1» с сиропом шиповника по сравнению с двумя другими образцами идет менее интенсивно. Исследовано изменение количества жизнеспособных клеток в биопродуктах (рис. 4.3.3) При этом наблюдалось незначительное снижение количества молочнокислых бактерий консорциума в биопродуктах после 10 суток хранения. Отмечено, что в образце биопродукта «Целебный-1» с сиропом шиповника это снижение самое незначительное по сравнению с другими образцами. i_
Была проведена математическая обработка экспериментальных данных. В результате математической обработки получены уравнения, описывающие зависимость титруемой кислотности (у) от продолжительности хранения (х):
Во всех случаях величина достоверности аппроксимации R приближается к 1. Обработка экспериментальных данных подтверждает закономерности, зафиксированные в ходе эксперимента.
На следующем этапе контролировали органолептические показатели, которым присвоено количественное выражение в баллах. Оценку проводили по 10 балловой шкале оценки по Шидловской В.П. [146], рекомендованной для кисломолочных напитков (заквасок), 5 баллов - внешний вид, цвет, консистенция и 5 баллов - запах, вкус и аромат, с последующим построением профило-грамм.
В процессе исследования были изучены качественные показатели биопродуктов «Целебный-2», и «Целебный-2» с сиропом шиповника свежевыработанных и в процессе хранения. В качестве контроля использовался биопродукт, полученный с использованием ацидофильной палочки по традиционной технологии и высушенный сублимацией. Основные качественные показатели свежевыработанных биопродуктов представлены в таблице 4.4.1. Качественные показатели биопродуктов в процессе хранения изучались в соответствии с МУК 4.2.1847-04, которые устанавливают порядок проведения и методологию санитарно-эпидемиологической оценки обоснования сроков годности и условий хранения пищевых продуктов. Отбор проб проводили на 1, 60, 90,130, 180, 200 и 216 сутки. В ходе исследований определяли изменение органолептических показателей, титруемой кислотности биопродуктов, количество жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий. Органолептические показатели - вкус и запах- консистенция- цвет чистый кисломолочный мелкодисперсный сыпучий порошоккремовый, равномерный по всей массе чистый кисломолочный мелкодисперсный сыпучий порошоккремовый, равномерный по всей массе чистый кисломолочный со вкусом шиповника мелкодисперсный сыпучий порошок светло-коричневый, равномерный по всей массе