Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 – Обзор литературы по технологиям производства биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья с использованием базидиальных грибов 11
1.1 Состояние производства биоэтанола в мире и в Российской Федерации 11
1.2 Характеристика лигноцеллюлозного сырья 15
1.2 Характеристика базидиальных грибов 19
1.2.1 Механизм действия целлюлаз базидиальных грибов 21
1.2.3 Механизм действия лигнинразрушающих ферментов 24
1.3 Характеристика существующих технологий произодства биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья 25
1.3.1 Предобработка лигноцеллюлозного сырья с использованием базидиальных грибов 29
1.3.2 Ферментативный гидролиз лигноцеллюлозного сырья 35
1.3.3 Конверсия лигноцеллюлозного сырья в биоэтанол 38
Выводы по главе 1 42
Глава 2 – Материалы и методы 43
2.1 Штаммы, питательные среды, культивирование и ферментация 43
2.2 Идентификация штаммов микроорганизмов 47
2.3 Определение концентрации биомассы 48
2.4 Определение концентрации редуцирующих сахаров 48
2.5 Определение концентрации глюкозы 49
2.6 Исследование целлюлазной активности чашечным методом 49
2.7 Определение фенолоксидазной активности чашечным методом (метод Бавендамма) 50
2.8 Определение жизнеспособности штаммов базидиальных грибов в присутствии пероксида водорода 51
2.9 Определение концентрации этилового спирта 51
2.10 Оптимизация состава питательной среды для штаммов базидиальных грибов 51
2.11 Статистические методы 52
Выводы по главе 2 53
Глава 3 – Исследование штаммов базидиальных грибов в качестве перпективных продуцентов биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья 54
3.1 Характеристика выделенных штаммов базидиальных грибов 54
3.2 Скрининг штаммов базидиальных грибов на способность продуцировать биоэтанол 58
3.3 Скрининг штаммов базидиальных грибов по критерию ферментативной активности 59
3.3.1 Исследование целлюлазной активности 59
3.3.2 Исследование фенолоксидазной активности 61
3.3.3 Температурная зависимость ферментативной активности штаммов базидиальных грибов 3.4 Исследование динамики накопления биомассы штаммов базидиальных грибов 64
3.5 Исследование динамики накопления целевого продукта и убыли исходного субстрата 66
3.6 Влияние концентрации исходного субстрата на жизнеспособность штаммов и на выход целевого продукта 70
3.7 Сравнение ээфективности исследуемых штаммов с известными ранее штаммами базидиалтных грибов 71
Выводы по Главе 3 73
Глава 4 – Определение дополнительных аспектов получения биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья с использованием базидиальных грибов, учитываемых при разработке технологической схемы 74
4.1 Исследование жизнеспособности штамма T. versicolor It-1 в присутствии пероксида водорода 74
4.2 Исследование возможности многократного использования биомассы для продуцирования этанола 76
4.3 Исследование конверсии лигноцеллюлозных субтратов в биоэтанол 76
4.4 Оптимизация состава питательной среды для штамма T. versicolor It-1 80
4.4.1 Качественный подбор источников азота и углерода 80
4.4.2 Оптимизация количественного состава жидкой питательной среды методом математического планирования эксперимента 82
Выводы по главе 4 85
Глава 5 – Разработка технологии получения биоэтанола с использованием базидиальных грибов 86
Выводы по главе 5 92
Выводы 93
Заключение 96
Список использованной литературы 97
- Предобработка лигноцеллюлозного сырья с использованием базидиальных грибов
- Исследование динамики накопления целевого продукта и убыли исходного субстрата
- Исследование конверсии лигноцеллюлозных субтратов в биоэтанол
- Разработка технологии получения биоэтанола с использованием базидиальных грибов
Введение к работе
Актуальность работы. Приоритетным направлением в топливно-энергетической
отрасли является разработка и применение реформулированных автомобильных топлив с
использованием кислородсодержащих добавок неуглеводородного происхождения.
Одной из таких кислородосодержащих добавок является биоэтанол. Объём его мирового
производства достигает 86 млрд литров в год. В качестве основного сырья для
производства биоэтанола топливного назначения используется лигноцеллюлоза, так как
она является наиболее доступным и дешевым сырьем. Использование непищевых
продуктов в процессах производства биоэтанола имеет ряд других преимуществ, в том
числе, не оказывает влияние на продовольственный рынок. Кроме этого, использование
отходов деревообрабатывающей, сельскохозяйственной и других отраслей
промышленности способствует решению экологической проблемы, заключающейся в
эффективной утилизации отходов. Одной из задач развития биоэнергетической отрасли
является поиск новых экологически безопасных способов конверсии лигноцеллюлозного
сырья с использованием биологических объектов, в том числе поиск новых
производственных микроорганизмов, перерабатывающих растительное сырье в целевые
продукты. В связи с этим, крупнейшие нефтяные компании мира – Exxon Mobil, British
Petroleum, Royal Dutch Shell, Chevron Corporation, Petrobras, Total активно инвестируют
средства в разработку технологий производства биотоплив (биоэтанол, биодизельное
топливо). Начиная с 2006 года суммарные инвестиции этих компаний составили более
7 млрд $. Главным недостатком всех существующих в настоящее время технологий
получения биоэтанола с использованием живых организмов является необходимость
обязательной предобработки лигноцеллюлозного сырья для удаления лигнина. Давно
известно, что базидиальные грибы являются природными деструкторами
лигноцеллюлозы, имеющими мощные ферментные системы (комплексы целлюлаз и лигниназ), однако исследования данных грибов в качестве продуцентов этанола активно проводятся только в последние несколько лет.
В связи с этим актуальным является поиск новых штаммов базидиальных грибов, способных утилизировать лигноцеллюлозное сырье и продуцировать биоэтанол.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации: соглашения № 14.577.21.0070 от 05.06.2014 г., а также в рамках проектной части Государственного задания в сфере научной деятельности по Заданию № 10.14.2014/K от 17.07.2014 г.
Цель и основные задачи работы. Цель работы – разработка основ одностадийной технологии производства топливного биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья без стадии делигнификации с использованием базидиальных грибов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- поиск и выделение новых штаммов базидиальных грибов;
- скрининг штаммов по способности к продуцированию биоэтанола и оценке степени
ферментативной активности;
- выявление температурной зависимости ферментативной активности штаммов
базидиальных грибов;
исследование динамики накопления этанола штаммами базидиальных грибов на модельных субстратах;
исследование влияния концентрации исходного субстрата и целевого продукта на жизнеспособность штаммов базидиальных грибов;
- исследование возможности осахаривания лигноцеллюлозных субстратов при
твердофазном культивировании;
- исследование возможности прямой конверсии лигноцеллюлозных субстратов в
топливный биоэтанол;
- разработка технологической схемы прямой конверсии лигноцеллюлозного сырья в
компонент автомобильных бензинов – биоэтанол с использованием базидиальных
грибов.
Научная новизна работы.
-
Выделены новые штаммы базидиальных грибов, являющиеся продуцентами биоэтанола (впервые получено значение выхода спирта 0,5 г этанола/1 г глюкозы по сравнению с описанными в литературе штаммами) и имеющие высокую степень ферментативной активности (полученные при оценке ферментативной активности чашечным методом данные превосходят описанные в литературе).
-
Предложен способ оценки количества продуцируемого этанола на единицу биомассы, позволяющий сравнивать штаммы с отличающимися выходом биомассы и количеством продуцируемого спирта.
-
Установлена температурная зависимость целлюлазной и фенолоксидазной активностей выделенных штаммов базидиальных грибов.
-
Показана возможность прямой конверсии лигноцеллюлозного сырья в топливный биоэтанол с использованием базидиальных грибов, минуя стадии химической и биологической предобработки.
-
Предложена принципиальная схема безотходного производства топливного биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья, предполагающая использование штамма базидиального гриба Trametes versicolor It-1.
Теоретическая ценность работы. Выявлена высокая целлюлазная активность для штаммов Trametes versicolor It-1, Trametes hirsuta MT-24.24 и Trametes hirsuta MT-17.24, являющихся грибами белой гнили. Разработан комплексный подход к изучению базидиальных грибов – перспективных продуцентов биоэтанола.
Практическая значимость работы. Разработана технологическая схема производства биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья с использованием штамма Trametes versicolor It-1, позволяющая получать биоэтанол из лигноцеллюлозного сырья напрямую без стадии предобработки исходного субстрата. Создана коллекция штаммов базидиальных грибов, являющихся продуцентами биоэтанола и имеющих высокую степень ферментативной активности. Показана возможность получения редуцирующих сахаров при использовании штаммов базидиальных грибов в процессе осахаривания лигноцеллюлозного сырья.
Апробация результатов исследований. Основные положения и результаты работы доложены на четырех конференциях: «Химические аспекты возобновляемой энергетики» (РФ, Москва, 22 октября 2014 г.), «III Международный микологический
форум – 2015» (РФ, Москва, 14-15 апреля 2015 г.), Международный молодежный научный форум «Ломоносов-2015» (РФ, Москва, 13-17 апреля 2015 г.), «Химические аспекты возобновляемой энергетики» (РФ, Москва, 21 сентября 2016 г.).
Личное участие автора в получении результатов. Все исследования, описанные в данной диссертации, были проведены при непосредственном участии автора, за исключением определения концентрации биоэтанола хроматографическим методом и секвенирования штаммов базидиальных грибов. Личный вклад автора состоит в постановке цели, задач, выделению штаммов базидиальных грибов и создании коллекции, проведении скрининга штаммов на способность продуцировать биоэтанол, целлюлазы и фенолоксидазы, проведении ряда экспериментов по исследованию динамики накопления целевого продукта и убыли исходного субстрата, изучению влияния концентрации исходного субстрата и целевого продукта на жизнеспособность штамма, исследованию возможности прямой конверсии лигноцеллюлозного сырья в биоэтанол и разработке технологической схемы производства биоэтанола с использованием базидиальных грибов.
Достоверность и обоснованность полученных результатов подтверждается учетом всех основных влияющих на результаты исследования факторов, реальностью данных при расчетах, использованием традиционных современных методов измерения.
Публикации. Основное содержание работы изложено в 7 публикациях, из них 3 статьи (3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 1 статья, индексируемая в базах данных Scopus и Web of Science), 2 тезисов докладов на конференциях, 2 патента на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, заключения, списка литературы. Библиографический список состоит из 152 наименований. Диссертация содержит 20 таблиц и 29 рисунков.
Предобработка лигноцеллюлозного сырья с использованием базидиальных грибов
Предобработка лигноцеллюлозы является необходимой стадией, оказывающей влияние на эффективность всех последующих стадий процесса получения биоэтанола. Цель предобработки – уменьшение степени кристалличности целлюлозы, разрушение матрикса из лигнина и гемицеллюлоз, и, как следствие, увеличение биодоступности субстрата [26]. Выделяют следующие критерии эффективности предобработки: предотвращение деструкции целлюлозы и гемицеллюлоз; предотвращение образования ингибиторов ферментов и токсичных для микроорганизмов соединений; удаление лигнина; высокий выход сахаров в результате ферментативного гидролиза предобработанного субстрата; низкие энергетические затраты; низкие капитальные затраты; возможность промышленного применения выбираемого способа предобработки [75-77].
Все способы предобработки разделяют на: физические (измельчение, дробление, облучение), химические (предобработка щелочами, кислотами, окисляющими реагентами и органическими растворителями), физико-химические («паровой взрыв», «аммонийный взрыв», окисление в водной фазе) и биологические [23]. Физический способ предобработки является необходимым для любого вида лигноцеллюлозы, так как позволяет оптимизировать объём загружаемого сырья. Предобработка сырья физико-химическими способами в промышленном масштабе является капитало- и энергоёмкой [78]. Химические способы с использованием кислот или щелочей, являются наиболее распространенными в настоящее время, так как позволяют добиться высокой степени делигнификации сырья [79]. Однако применение химических реагентов может приводить к деструкции гемицеллюлозы и целлюлозы с образованием токсичных веществ, таких как органические кислоты и фурановые соединения [80, 81]. Биологический метод предобработки лигноцеллюлозной биомассы основывается на способности различных микроорганизмов разрушать лигнин. Преимущество такого метода заключается в том, что ферментативная делигнификация протекает в мягких условиях и не приводит к образованию токсичных отходов, требующих утилизации, то есть данный способ является наиболее экологически безопасным [76].
Среди различных живых организмов, базидиальные грибы обладают уникальной природной способностью к синтезу лигно- и целлюлозолитических ферментов, позволяющих подвергать биодеструкции различные органические соединения растительного и животного происхождения, получая все необходимые компоненты для своей жизнедеятельности. [82, 83]. Наиболее изученными видами базидиальных грибов, ээфективно биодеструктирующими лигноцеллюлозу, являются Phanerochaete crysosporium, Trametes hirsuta, Ceriporiopsis subvermispora, Ceriporia lacerata, Stereum hirsutum, Polyporus brumalis, Echinodontium taxodii [76, 84-92]. Эффективность биодеструкции указанными штаммами приведена в таблице 1.
В результате предобработки рисовой шелухи с использованием базидиальных грибов P. chrysosporium NBRC (IFO) 31249, T. versicolor NBRC (IFO) 4937 и P. ostreatus ATCC 66376 в течение 60 суток степень делигнификации составила 21, 37 и 30% соответственно, сократилось содержание целлюлозы в сырье на 49, 58 и 32% [93]. К деструкции лигнина способны базидиальные грибы родов Trametes и Pleurotus [93, 94]. При культивировании T. hirsuta на кукурузных кочерыжках в течение 42 суток масса субстрата уменьшилась на 48%, при этом потеря лигнина, целлюлозы и гемицеллюлоз составила 72, 34 и 78% соответственно [94].
Несмотря на то, что базидиальные грибы способны получать все необходимые питательные вещества из лигноцеллюлозы, установлено, что добавление органических и неогралических соединений способно активировать лигно- и целлюлозолитические ферменты грибов. Например, добавление CuSO4 в питательную среду позволило значительно увеличить активность лакказ базидиальных грибов Volvariella volvacea, T. trogii и P. ostreatus [95-98], а при предобработке измельченных кукурузных кочерыжек штаммом P. chrysosporium ATCC 24725 добавление MnSO4 в субстрат позволило уменьшить содержание лигнина в сырье на 41% за 3 недели предобработки [95].
Для осуществления процессов предобработки лигноцеллюлозного сырья перспективными являются базидиальные грибы, которые способны деструктировать лигнин без разрушения целлюлозы, например, таким грибом является Ceriporiopsis subvermispora [99]. На примере предобработки стеблей бамбука в процессе скрининга из 34 культур базидиомицетов был отобран штамм E. taxodii 2538, способный удалить до 24% лигнина без разрушения целлюлозы за 4 недели [100]. Ещё в одном исследован6ии при использовании такого же субстрата степень делигнификации штаммом Punctularia sp.1 TUFC20056 за 12 недель составила 54%, в то время как потери холоцеллюлозы не превышали 3% [101]. За 12 недель эксперимента штаммы Perenniporia medulla-panis и Phlebia tremellosa показали высокую лигнинолитическую активность при использовании в качестве субстрата березовой древесины (убыль лигнина составила 73 и 75% соответственно, при этом, убыль целлюлозы не превышала 3%), а за 30 дней эксперимента не произошло убыли целлюлозы при частичной убыли лигнина при предобработке сосновой древесины штаммом Pycnoporus cinnabarinus [102].
Важным аспектом, влияющим на эффективность предобработки, помимо самих штаммов и исходных субстратов, являются условия проведения эксперимента, такие как температура, аэрация и др. Интенсивная аэрация является важнейшим условием проведения эксперимента, так как делигнификация является окислительным процессом. Для облегчения проникновения свободного кислорода между частицами сырья используется такой физический метод предобработки, как измельчение. Однако степень измельчения имеет свой оптимум. Например, при использовании щепы (размер частиц 40304 мм) степень делигнификации составила 13%, при использовании древесной стружки (размер частиц 3 мм) – 31%, дальнейшее измельчение субстрата не способствовало интенсификации процесса, так как происходило уменьшение диффузии кислорода из-за уплотнения слоя субстрата [103]. Сходные результаты получились при твердофазной предобработке корневища рапса с размером частиц 0,4-0,8 мм базидиомицетом P. ostreatus NRRL 2366: степень делигнификации составила 36%, уменьшение размера частиц привело к сокращению степени делигнификации до 15% [104, 105].
Учитывая то, что ферменты – вещества белковой природы, их активность сильно зависит от температуры. Для грибов эффективным диапазоном температур, при котором сохраняется активность ферментов является диапазон 20-36 С. Однако для каждого штамма оптимум может сильно различаться как в пределах указанного диапазона, так и за его пределами. При биодеструкции грибом Collybia dryophila березовых листьев содержание лигнина и холоцеллюлозы в субстрате уменьшилось на 72,8 и 27,7% соответственно при температуре 20 С, и на 32,9 и 6,4% соответственно при температуре 10 С [106]. Для гриба T. versicolor за 3 недели предобработки при температуре 25 С содержание лигнина в исходном субстрате сократилось на 15%, а при температурах 20С и 35 С – на 8 и 4% соответственно [107]. Оптимумом делигнификации для штамма Merulius tremellosus PRL 2845 является диапазон 25-30 С (с убылью лигнина более 30% за 8 недель эксперимента), а для штамма C. subvermispora ATCC 96608 оптимум обнаркужился при температуре 28 С [108].
Исследование динамики накопления целевого продукта и убыли исходного субстрата
Проведено исследование динамики накопления целевого продукта (этанола) и убыли исходного субстрата, в качестве которого были выбраны шестиатомные моносахариды глюкоза, фруктоза, галактоза, дисахарид целлобиоза и пятиатомные моносахариды арабиноза и ксилоза. Выбор пяти последних сахаров обусловлен их присутствием в гемицеллюлозах, входящих в состав лигноцеллюлозного сырья. Показано, что образование спирта из глюкозы штаммом T. versicolor IT-1 начиналось на первые сутки (5,1 г/л спирта при 44 % конверсии исходного субстрата) и концентрация достигала максимального значения на 9 сутки (11,3 г/л при 97,4 % конверсии исходного субстрата). Для штамма T. hirsuta MT-24.24 наблюдалось равномерное накопление этанола в течение всего времени текущего эксперимента, максимальное значение достигалось на 10 сутки – 11,0 г/л при конверсии исходного субстрата 93,2%. Результаты исследований представлены на рисунке 18. Следует отметить, что в стационарных анаэробных условиях глюкоза потреблялась грибами незначительно и практически вся расходовалась на образование этанола.
При сравнении динамики накопления целевого продукта с использованием в качестве исходного субстрата фруктозы и галактозы отмечено 77 % и 80 % потребление фруктозы штаммом T. hirsuta MT-24.24 уже на первые сутки анаэробной стадии соответственно. Максимум концентрации спирта для данного штамма был достигнут на 8-е сутки и составил 3,4 г/л при культивировании на фруктозе и 0,5 г/л на 5-е сутки при использовании в качестве исходного субстрата галактозы. Для штамма It-1 при культивировании на фруктозе максимум биоэтанола составил 8,9 г/л к 10 суткам культивирования, на галактозе максимум был достигнут также на 10 сутки и составил 1,7 г/л (рисунки 19 и 20).
При использовании в качестве исходного субстрата целлобиозы установлено, что максимальный выход целевого продукта (8,3 г/л, что составляет 77,6 % от теоретически возможного) штаммом It-1 достигается на 7 сутки, штамм MT-24.24 имеет сходные показатели конверсии целлобиозы с большим периодом брожения: 8,2 г/л на 10-е сутки культивирования рисунок 21). При использовании в качестве исходных субстратов арабинозы и ксилозы, максимум концентрации этанола был достигнут к 7 и 10 суткам культивирования для ксилозы и арабинозы соответственно и составил по 1,2 г/л для обоих субстратов (рисунки 22 и 23) при сбраживании штаммом MT-24.24.
Для штамма T. versicolor It-1 наблюдалась сходная картина. Максимум концентрации спирта был достигнут к 7 суткам культивирования и составил 1,5 г/л и 1,7 г/л для арабинозы и ксилозы соответственно (рисунки 19 и 20).
Таким образом, была показана эффективность использования штаммов T. versicolor It-1 и T. hirsuta MT-24.24 для сбраживания не только гексоз, но и пентоз.
Исследование конверсии лигноцеллюлозных субтратов в биоэтанол
Все рассмотренные ранее существующие технологии производства биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья можно разделить на две принципиальные технологии: технологии, предполагающие раздельные делигнификацию, осахаривание и сбраживание и технологии, в которых эти процессы объединяются в одну стадию.
В этой связи исследование возможности конверсии лигноцеллюлозных субстратов проводилось двумя способами. Первый способ заключается в культивировании штамма T. versicolor It-1 на твердом лигноцеллюлозном субстрате (солома ржи с размером частиц 5-10 мм) в течение времени, необходимого для накопления максимального количества сахаров и дальнейшее помещение предобработанных субстратов в анаэробные условия с биомассой гриба, полученной в процессе погруженного культивирования. Второй способ предполагает прямую конверсию лигноцеллюлозных субстратов с использованием погруженной культуры базидиальных грибов, при которой биомасса с исходным субстратом сразу помещаются в анаэробные условия.
В результате эксперимента согласно первому способу установлено, что исследуемый штамм способен эффективно осахаривать измельченную солому, достигая максимального количества сахаров (48,4 г сахаров из 1000 г субстрата) на 2-е сутки. Последующее снижение количества образующихся сахаров связано с их потреблением грибом и расходованием на рост и развитие мицелия гриба (рисунок 27).
Для оценки эффективности осахаривания лигноцеллюлозных субстратов с использованием базидиальных грибов проведен теоретический расчет выхода биоэтанола из образовавшихся сахаров согласно уравнению реакции: СбНОб сбраживание» 2С2Н5ОН + 2СО2
Расчет показал, что из 1000 г измельченной соломы теоретически возможно получить 23,9 г биоэтанола. При проведении эксперимента по конверсии предобработанной в течение двух суток соломы было показано, что выход этанола составил 12 г из 1000 г соломы, то есть 50% от теоретически возможного.
Второй вариант исследований заключался в исследовании возможности прямой конверсии модельных субтратов, в качестве которых были выбраны Na-КМЦ, МКЦ, измельченная солома ржи (размер частиц 5-10 мм), хвойные опилки (размер частиц 10-15 мм), опилки (размер частиц 1-2 мм) в концентрациях 20, 20, 30 и 30 г/л соответственно. Результаты показали, что исследуемый штамм более эффективно конвертировал в этиловый спирт КМЦ натриевую соль, концентрация этанола при этом достигала 2,1 г/л за 7 суток. По-видимому, КМЦ обладала большей биодоступностью по сравнению с другими субстратами. При конверсии микрокристаллической целлюлозы и измельченной соломы были достигнуты концентрации спирта 1,6 г/л и 1,7 г/л соответственно. При пересчете исходного количества соломы ржи на 1000 г, концентрации образующегося спирта соответствовали значениям 105, 80 и 56,7 г/л. При исследовании конверсии опилок с размером частиц 10-15 мм, концентрация этанола была меньше предела измерения, при уменьшении размера частиц до 1-2 мм, концентрация спирта составила 0,97±0,01 г/л. При пересчете на 1000 г субстрата количество спирта составило 32,3 г.
Было провелено сравнение эффектиности сбраживания сбраживания лигноцеллюлозных субстратов штаммом Т. versicolor It-1 с известными базидиальными грибами - спиртопродуцентами. Результаты представлены в таблице 12.
Учитывая количество накапливаемых сахаров и время культивирования, последовательное осахаривание и сбраживание соломы ржи штаммом T. versicolor It-1 оказалось сопоставимым по эффективности со штаммами P. chrysosporium MTCC-787 и P. chrysosporium NCIM 1106. При сравнении количества продуцируемого биоэтанола показано однозначное преимущество штамма T. versicolor It-1 перед известными в литературе штаммами-спиртопродуцентами в 2,4-4,5 раза (в зависимости от субстрата).
Таким образом, прямая конверсия лигноцеллюлозного сырья в биоэтанол имеет преимущества перед последовательным осахариванием и сбраживанием субстратов, а штамм T. versicolor It-1 может быть эффективно использован в технологиях консолидировапнной биопереработки.
Разработка технологии получения биоэтанола с использованием базидиальных грибов
На основании результатов, полученных при проведении исследований по выявлению штаммов, обладающих ферментативной (целлюлазной и лигниназной) активностью и способных к прямой конверсии лигноцеллюлозы в этанол, предложена принципиальная технологическая схема производства биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья (рисунок 28). Сырье, в качестве которого могут быть использованы солома, либо опилки, поступает в блок подготовки сырья. В блоке подготовки осуществляется измельчение сырья: для опилок рекомендуемый размер частиц составляет 1-2 мм, для соломы – 5-10 мм. Затем измельченное сырье поступает в блок стерилизации, где осуществляется обработка сырья 1 % раствором пероксида водорода в течение одного часа. Стерильный субстрат поступает в ферментеры блока сбраживания. Ферментеры представляют собой емкости, внутренний объем которых разделен на две камеры фильтрующей перегородкой. Одна камера предназначена для загрузки биомассой базидиальных грибов, другая для загрузки стерильных субстратов. Биомасса для процесса ферментации производится следующим образом. Питательная среда (процесс оптимизации состава которой описан в главе 4) подается в блок культивирования биомассы (ферментеры), в котором происходит ее стерилизация и осуществляется засев питательной среды жидкой культурой базидиального гриба. Культивирование биомассы осуществляется в течение 3-4 суток. Процесс ферметации сбраживания субстрата (соломы или опилок) протекает в течение 5-7 дней при температуре 25 0С. Биомасса используется в течение не менее трех циклов ферментации (с загрузкой свежего сырья для каждого цикла). Культуральная жидкость направляется в блок ректификации. Кубовый остаток процесса ректификации направляется в рецикл в блок культивирования биомассы. Отработанные субстрат и биомасса поступают на осушку и прессование с целью производства лигноцеллюлозных удобрений, либо кормов, обогащенных белком. Технологические показатели процесса приведены в таблице 16.
Выход биоэтанола по отношению к сырью (соломе ржи) составляет 6 % масс. Преимуществом предлагаемой технологии является безотходность и отсутствие воздействия на окружающую среду. Важным аспектом предложенной технологии производства биоэтанола, основанной на применении базидиальных грибов для сбраживания лигноцеллюлозных субстратов, является отсуствие примесей, таких как, метанол и сивушные масла, в составе культуральной жидкости.
В таблицах 19-20 приведены расчеты себестоимости одной тонны биомассы и этанола. Расчет себестоимости целевых продуктов приведен без учета затрат на проведение процесса.
Таким образом, стоимость одной тонны этанола по предложенной технологии составляет 97880,2 руб/т. На текущий момент средняя себестоимость одной тонны биоэтанола, полученного из лигноцеллюлозного сырья по реализованным в промышленности технологиям, составляет от 820 /т до 1270 /т. Трудности в объективном сравнении себестоимости биоэтанола из различного вида сырья обуславливаются, в первую очередь, себестоимостью самого сырья, а во-вторых, все существующие технологии производства биоэтанола предполагают использование дрожжей S. cerevisiae, которое принципиально отличается от предлагаемого в данной работе использования грибов-базидиомицетов. Кроме вышесказанного, стоит учесть, что побочным продуктом производства этанола из лигноцеллюлозного сырья по предложенной технологии является лигноцеллюлоза, обогащенная белком, которая является ценным кормовым продуктом, а также может быть использована в качестве удобрения, либо в качестве субстрата для проведения биоремедиации почв, в том числе, нефтезагрязненных [151, 152]. Оценочная стоимость одной тонны углеводно-белкового кормового продукта составляет 7100 руб/т при себестоимости 5200 руб/т. Затраты на реализацию технологии (сырье, электроэнергия, пар), могут быть компенсированы за счет реализации побочных продуктов. Одним из вариантов развития предлагаемой технологии является создание рабочей площадки одновременно вблизи источников сырья и площадок для использования не только целевого, но и побочных продуктов.
Таким образом, принимая во внимание себестоимость биоэтанола, а также возможность производства углеводно-белкового кормового продукта и удобрения, можно сделать вывод, что предложенная технология является перспективной для реализации в промышленности.