Чувствительность цианобактерий к токсическому действию солей тяжёлых металлов Богачева, Александра Сергеевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1 Альтернативные методы исследования в токсикологии и современные представления о цитотоксичности тяжелых металлов (обзор литературы) 12

1.1 Общая характеристика методов определения токсичности с помощью гидробионтов и клеточных культур 13

1.2 Цианобактерии как перспективная модель исследования токсичности ксенобиотиков 21

1.3 Современные представления о токсичности тяжёлых металлов 23

1.3.1 Формы существования тяжелых металлов в поверхностных водах и почве 24

1.3.2 Метаболизм тяжелых металлов в почве и воде водоёмов 25

1.3.3 Токсическое действие тяжелых металлов на микроорганизмы 28

1.3.3.1 Условия токсического действия тяжелых металлов на микроорганизмы 30

1.3.3.2 Основные повреждения, индуцируемые тяжелыми металлами 35

1.3.3.3 Поглощение тяжелых металлов клетками микроорганизмов 43

Глава 2 Материалы и методы 47

2.1 Биологическая характеристика цианобактерии Synechocystis sp. 47

2.2 Исследования токсичности солей металлов в разных условиях температуры и освещённости 50

2.3 Методы световой и электронной микроскопии 52

2.4 Статистический анализ количественных и размерных показателей клеток 54

Глава 3 Собственные результаты 55

3.1 Исследование чувствительности Synechocystis sp. PCC 6803 к токсическому действию соли меди при разных условиях культивирования 55

3.2 Исследование чувствительности Synechocystis sp. CALU 713 к токсическому действию соли меди при разных условиях культивирования 58

3.3 Исследование чувствительности Synechocystis sp. PCC 6803 к токсическому действию соли кадмия при разных условиях культивирования 61

3.4 Исследование чувствительности Synechocystis sp. CALU 713 к токсическому действию соли кадмия при разных условиях культивирования 64

3.5 Исследование чувствительности Synechocystis sp. PCC 6803 к токсическому действию соли ртути при разных условиях культивирования 66

3.6 Исследование чувствительности Synechocystis sp. CALU 713 к токсическому действию соли ртути при разных условиях культивирования 69

3.7 Исследование чувствительности Synechocystis sp. PCC 6803 к токсическому действию соли серебра при разных условиях культивирования 71

3.8 Исследование чувствительности Synechocystis sp. CALU 713 к токсическому действию соли серебра при разных условиях культивирования 73

Глава 4 Морфологические изменения клеток Synechocystis sp. при воздействии солей тяжелых металлов по данным световой и электронной микроскопии 77

4.1 Морфологические изменения клеток Synechocystis sp. при воздействии солей тяжелых металлов по данным световой микроскопии 78

4.2 Ультраструктурные изменения клеток Synechocystis sp. при воздействии солей тяжелых металлов 83

Глава.5 Сравнительная чувствительность цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 и СALU 713 к токсическому действию солей тяжёлых металлов (обсуждение результатов исследования) 94

Выводы 117

Практические рекомендации 119

Список литературы 121

• Условия токсического действия тяжелых металлов на микроорганизмы
• Биологическая характеристика цианобактерии Synechocystis sp.
• Исследование чувствительности Synechocystis sp. CALU 713 к токсическому действию соли ртути при разных условиях культивирования
• Ультраструктурные изменения клеток Synechocystis sp. при воздействии солей тяжелых металлов

Введение к работе

Актуальность. Проблема поиска адекватных экспериментальных моделей с минимальным использованием теплокровных лабораторных животных по этическим и экономическим причинам в последние годы приобрела особую актуальность (Каспаров А.А. и др., 2008; Другов Ю.С., Родин А.А., 2009; Полозова Е.В. и др., 2009).

В современных условиях в токсикологии существует достаточно большой выбор альтернативных методов исследования для оценки токсичности широкого спектра химических веществ и биообъектов. Так, при анализе загрязнённости водоёмов, помимо простейших, принято использовать водоросли, биолюминесцентные бактерии и водных беспозвоночных - ракообразных (чаще всего ветвистоусых рачков, Daphnia magna), рыб, которые широко применяются для токсиколого-гигиенического нормирования водных источников различного назначения (Еськов А.П. и др., 2003; Евсеева Т.И. и др., 2007).

Цианобактерии являются уникальными представителями мира микроорганизмов. Заселяя почти все освещаемые места обитания, обладая пластичным метаболизмом, они в настоящее время являются удобными модельными объектами для изучения целого ряда биологических процессов, таких как фотосинтез, азотфиксация, адаптация к изменяющимся условиям окружающей среды (Герасименко Л.М., Ушатинская Г.Т., 2002; Гусев М.В. и др., 2003). Благодаря короткому циклу их развития можно проследить на нескольких поколениях действие экстремальных факторов окружающей среды (Емцев В.Т. и др., 2005).

Одним из малоизученных, с точки зрения чувствительности к экотоксикантам, классов цианобактерий являются Synechocystis sp.

Тяжелые металлы относятся к наиболее широко распространенным поллютантам водной и почвенной среды (Будников Г.К. 1998; Луковникова Л.В. и др., 2004; Rai et al., 1990). Они составляют значительную долю загрязнителей окружающей среды и по токсичности занимают второе место после пестицидов. Однажды попав в биогеохимический цикл, они крайне редко и медленно покидают его (Никаноров А.М., Жулидов А.В., 1991; Онищенко Г.Г. и др., 2002; Шилов В.В. и др., 2010).

Параметры токсикометрии и механизмы токсического действия тяжелых металлов в экспериментальных исследованиях с использованием микроорганизмов изучены недостаточно.

Известно, что физиологические реакции микроорганизмов во многом зависят от таких параметров окружающей среды, как температура и освещенность. Данные о токсичности химических веществ для микроорганизмов при изменении этих параметров окружающей среды практически отсутствуют.

Цель исследования – оценить возможность использования цианобактерий Synechocystis sp. в качестве тест-объекта для оценки токсичности ксенобиотиков на примере солей тяжёлых металлов.

Достижение поставленной цели планировалось путем решения следующих задач:

1. Определить параметры токсичности солей тяжелых металлов (AgNO₃; 3CdSO₄8H₂O; Hg(CH₃COO)₂; CuSO₄5H₂O) для разных штаммов цианобактерий CALU 713 и РСС 6803 при оптимальных условиях среды обитания в динамике.

2. Исследовать влияние различных сочетаний температуры и освещенности среды обитания на параметры токсичности тяжёлых металлов для цианобактерии.

3. Оценить морфологические изменения цианобактерий в присутствии солей тяжёлых металлов.

4. Выявить наиболее чувствительный к токсическому действию солей тяжелых металлов штамм цианобактерий для использования в экспериментальной токсикологии.

Научная новизна. Впервые получены данные о параметрах токсичности солей тяжёлых металлов для цианобактерий Synechocystis sp. CALU 713 и РСС 6803. Показано, что изменения световых и температурных условий модифицируют чувствительность цианобактерий к токсическому действию солей тяжелых металлов. Снижение температуры и освещенности в разной степени усиливает токсический эффект солей тяжелых металлов.

Установлено, что морфологические изменения цианобактерий, вызванные токсическим действием солей тяжелых металлов, носят неспецифический характер, независимо от штамма и вида исследованного токсиканта, проявляются изменением формы и размеров, в том числе, делящихся клеток. На ультраструктурном уровне морфологические изменения представлены изменением толщины и целостности пептидогликанового слоя клеточной стенки; повреждением внутриклеточных органелл, имеющих отношение в основном к энергетическому обмену.

Наиболее чувствительным к токсическому действию солей тяжелых металлов и, соответственно, подходящим для использования в экспериментальной токсикологии является штамм Synechocystis sp. CALU 713. Для этого штамма токсичность металлов убывает в следующей последовательности (Hg > Cd > Ag > Cu), для штамма Synechocystis sp. РСС 6803 (Ag > Hg > Cd > Cu).

Практическая значимость. Обоснована целесообразность использования цианобактерий Synechocystis sp. CALU 713 и РСС 6803 для оценки степени загрязнённости водных объектов солями тяжёлых металлов. В результате проведённых исследований получены параметры токсичности солей тяжёлых металлов (AgNO₃; 3CdSO₄8H₂O; Hg(CH₃COO)₂; CuSO₄5H₂O) для двух штаммов цианобактерий Synechocystis sp. В этих условиях выявлены морфологические изменения поверхности и ультраструктуры изменений клеток Synechocystis sp. Полученные результаты могут использоваться в научно-исследовательских и практических работах в области экологической токсикологии и в скрининговых исследованиях токсичности химических веществ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Цианобактерии Synechocystis sp. штаммов CALU 713 и РСС 6803 чувствительны к токсическому действию тяжёлых металлов. Токсичность определяется дозозависимым эффектом снижения скорости роста цианобактерий в инкубационной среде на водной основе. Параметры токсичности существенно зависят от условий температуры и освещённости.

2. Токсическое действие солей тяжёлых металлов характеризуется морфологическими изменениями формы и размеров клеток, клеточных мембран, нуклеоплазмы и содержащихся в ней рибосом, фотосинтетических органелл – тилакоидов.

Реализация работы. Материалы диссертационного исследования используются в научной работе отдела клинической токсикологии НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе при оценке токсичности биосред больных с острыми отравлениями для определения уровня эндотоксемии; в учебном процессе кафедры общей и клинической токсикологии, кафедры микробиологии и микологии и кафедры медицинской экологии и эпидемиологии ГОУ ДПО СПб МАПО, а также в научно-практической деятельности Территориального управления Роспотребнадзора по городу Санкт-Петербургу. По теме данной диссертации подготовлено два учебных пособия.

Апробация работы. Материалы настоящего исследования представлены на: международном экологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 29 июня – 2 июля 2003г.); на ХХХIХ научной конференции “Хлопинские чтения” – “Здоровье населения в современной среде обитания” (г. Санкт-Петербург, 2006г.); на ХХХХIII научной конференции “Хлопинские чтения” – “Чрезвычайные ситуации: организационные, экологические и эпидемиологические проблемы” (г. Санкт-Петербург, 2010г.); на юбилейной научно-практической конференции молодых учёных “Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины” (г. Санкт-Петербург, 22 апреля 2010г.); на Российской научной конференции с международным участием “Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии” (г. Санкт-Петербург, 19-20 мая 2011).

Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения. Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ ГОУ ДПО СПбМАПО в 2006 – 1010 гг.(тема «Исследование эффективности современных методов диагностики и лечения отравлений», разделы «Мониторинг обращения потенциально-опасных химических веществ на территории Санкт-Петербурга» и «Изучение ультраструктурных механизмов токсичности тяжёлых металлов»).

Личное участие автора. Автор принимал личное участие в планировании, организации и выполнении исследований, проводил регистрацию и оценку результатов, статистическую обработку, обобщение и анализ полученных данных.

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 138 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методик исследования, двух глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Диссертация содержит 17 таблиц, иллюстрирована 15 рисунками. Список использованной литературы включает 187 источников, из которых 84 отечественных, 103 зарубежных.

Условия токсического действия тяжелых металлов на микроорганизмы

Токсичность металлов зависит от физиологического состояния микроорганизма, химического состояния металла и особенностей окружающей среды [151]. Реакция различных групп микроорганизмов на действие тяжелых металлов специфична и связана с их систематическим положением. Ингибирующее влияние тяжелых металлов на рост и жизнеспособность микроорганизмов наблюдается в следующих диапазонах концентраций: для органортутных соединений и серебра в отношении для различных эукариотных микроорганизмов - 1(Г8-10-бМ, для большинства бактерий - 10 6- 10"4 М [184].

Имеются сведения об аккумуляции зелеными водорослями отдельных тяжелых металлов, о влиянии на этот процесс факторов среды, а также о некоторых механизмах их поглощения [14].

Грамположительные бактерии более чувствительны к их действию, чем грамотрицательные [93], хотя эта закономерность проявляется не всегда [163].

Изменение чувствительности микроорганизмов к тяжелым металлам наблюдается не только у представителей отдельных систематических групп, но и в пределах рода, вида и даже у особей одной популяции [138]. На определенных стадиях развития микроорганизмы проявляют различную чувствительность к действию тяжелых металлов. Так, снижение токсичности меди для Thiobacillus ferrooxidans наблюдалось в начале экспоненциальной фазы роста [34]. Под действием меди клетки Anabaena sp. АТСС 7120 лизировались на ранних, а не поздних стадиях роста [137]. A. spiroides наиболее чувствительна к кобальту в начале фазы интенсивного роста, наименее - в конце ее [39]. Однако культура Microcystis aeruginosa в фазе логарифмического роста более устойчива к токсическому действию тяжелых металлов, чем в стационарной фазе [19]. Для химически индуцируемых повреждений обнаружение эффектов в большей степени зависит от отношения количества токсического вещества к количеству клеток, чем непосредственно от концентрации токсического вещества [115]. Степень повреждения клеток Anabaena flosaquae и Anacystis nidulans ртутью снижалась с увеличением количества клеток в культуре [90]. Аналогичные данные получены и для A. inaqualis [178].

Согласно многочисленным исследованиям из тяжелых металлов наиболее токсичны ртуть, серебро, медь, кадмий, свинец, хром, никель, цинк и кобальт [1,79,113,122].

Токсическое действие недиссоциированных солей и комплексов тяжелых металлов с аминокислотами, органическими хелаторами в большинстве случаев слабее, чем действие их свободных ионов [87, 156, 183]. Так, медь проявляет максимально токсичный эффект для микроорганизмов в ионной форме [125, 165]. При связывании меди внеклеточными продуктами микроорганизмов с образованием металлоорганических соединений ее токсичность подавляется [101].

При действии тяжелых металлов на микроорганизмы имеет место зависимость «доза-эффект», выражающаяся в изменении микробной реакции на металл в зависимости от его концентрации. Действие металлов в определенных пределах прямо пропорционально их концентрации. В ряде случаев отмечается экспоненциональная зависимость. Отрицательное действие меди на клетки Sarcinaflava, Bacillus cereus, В. articulatus, Lyngbya nigra находилось в прямой зависимости от концентрации металла и усиливалось с ее повышением. Линейная зависимость в ингибировании роста Nostoc linckia солями ртути наблюдалось при увеличении их содержания в среде [133]. Установлена, двухфазная реакция многих микроорганизмов на тяжелые металлы при низких концентрациях металла наблюдается стимулирование роста и процессов метаболизма, а с увеличением концентрации наступает ингибирование и прекращение роста [18]. Такие металлы как, Cd , Ni , Со , Сг , Си , Pb , Zn2+, As3+ в НИЗКИХ концентрациях стимулировали рост и метаболические процессы микроорганизмов, при высоких дозах наблюдался ингибирующий эффект [37, 38].

Наиболее чувствительными тест-параметрами, наблюдаемыми на морфологическом уровне для многих культур {Synechococcus sp. АТСС 21144, Anabaena variabilis АТСС 29413, Nostoc sp. АТСС 29133) следует считать изменение формы и размера клеток за счет варьирования толщины и нарушения целостности пептидогликанового слоя, увеличение объема клеток в 1,5 - 2,0 раза, расхождение тилакоидных мембран с образованием внутритилакоидных пространств, а также накопление полифосфатных и липидных гранул. В то же время следует отметить, что культуры проявляют адаптационные способности и устойчивость к действию ионов цинка, возрастающие в ряду Synechococcus - Anabaena - Nostoc [69].

Ртуть либо проявляла стимулирующий или ингибирующий эффект [60, 180], либо не оказывала стимулирующего действия, как в случае с Anabaenaflos-aqnae, Anacystis nididans, Synechocystis aquatilis, а сразу подавляла рост микроорганизмов [79, 181].

Токсичность тяжелых металлов для микроорганизмов в значительной степени определяется составом среды культивирования, взаимодействуя с минеральными компонентами сред. Тяжелые металлы могут образовывать практически нерастворимые гидроокиси, фосфаты и карбонаты. При взаимодействии с органическими компонентами - стабильные комплексы [1, 97]. Для нитрифицирующих бактерий, подверженных действию Cu2+, Zn2+,Cd +, присутствие фосфатов, карбонатов, ОН" и NH/ в средах приводило к их кореципитации с ионами металлов, при этом токсическое действие последних резко снижалось [145]. Ингибирующий эффект меди для Nostoc muscorum в значительной степени снижался добавлением солей железа (FeS04 и FeCb), а на средах cNH/не проявлялся вообще [185]. ЭДТА является сильным хелатирующим агентом, присутствие которого в среде уменьшает концентрацию свободных ионов металлов [120]. Добавление ЭДТА снижало ингибирующее действие ртути, урана и кадмия на окисление закисного железа и рост Thiobacillas ferroxidans [143]. В присутствии ЭДТА, нитрилтриацетата, цитрата, аспартата нейтрализовалось токсическое действие меди для Vibrioalginoliticiis [168]. Добавление в среду комплексообразователей заметно уменьшало поглощение меди Е. coli. Наиболее эффективным ингибитором накопления Си в клетках был цитрат, в меньшей степени MES (2-1Ч-морфолиноэтансульфоновая кислота) [92].

В водоемах в присутствии сильных хелатирующих органических лигандов - естественных (гуминовые кислоты, аминокислоты, полипептиды, пирокатехин, фруктоза) и искусственных (ЭДТА) происходит спонтанное образование комплексных соединений тяжелых металлов [68, 83]. Увеличение комплексообразуїощей способности среды снижает накопление металлов микро водорослями, поскольку они более доступны в виде свободных ионов или неорганических комплексов. Например, такие органические соединения, как цистеин и ЭДТА снижают концентрацию меди в среде культивирования Pseudomonas syringae с 100 до 5 мкМ [89]. В то же время известны случаи, когда Synechocystis sp. РСС 6803, Plectonema boryanum и Chlorella sp. поглощают олово в виде органических соединений, причем с увеличением молекулярной массы возрастает и активность накопления [88, 141].

В работах Babich Н. (1977) и Pettersson А. (1985) показано, что концентрация ионов водорода значительно влияет на жизнеспособность микроорганизмов в присутствии тяжелых металлов. В кислой среде металлы более подвижны, чем в нейтральной и щелочной, поэтому снижение рН обычно усиливает токсичность тяжелых металлов для микроорганизмов. Так, токсичность никеля для гетеротрофных бактерий проявлялась при кислых значениях рН. Рост Bacillus sabtilis, Enterobacter aerogenes и Nocardia carollina полностью ингибируется в присутствии Си, Ni при рН = 5,5. Повышение рН до 8,5 снимает токсический эффект металлов. Ионы А13+ проявляют максимально токсичный эффект для A. cylindrica при рН = 6,0.

Согласно данным Н. Babich (1980) повышение температуры обычно усиливает токсичность тяжелых металлов. Сравнительное изучение действия РЬ , Ni , Zn , Cd на клетки Klebsiella aerogenes при различных температурах (28, 37 и 44 С) показало, что число жизнеспособных микроорганизмов при 37 С было меньше, чем при 28 С в присутствии РЬ2+и Ni2+и незначительно изменялось в присутствии Zn2+ и Cd2+. При 44 С в присутствии металлов размножения клеток не отмечалось. Благоприятной для размножения клебсиеллы в присутствии металлов была температура 28 С.

Биологическая характеристика цианобактерии Synechocystis sp.

Цианобактерий - это своеобразная группа живых организмов, у которой наличие оксигенного фотосинтеза сочетается с прокариотной организацией.

Synechocystis sp. - это одноклеточные цианобактерий сферической формы, иногда агрегаты, в которых клетки соединены аморфной слизью или слизистым чехлом. Диаметр клеток 2-3 мкм. Деление клеток бинарное, в двух или трех взаимно перпендикулярных плоскостях, клетки в культуре обычно располагаются парами [25].

Клеточная оболочка грамотрицательного типа, состоящая из цитоплазматической мембраны, пептидогликанового слоя и наружной липополисахаридной мембраны. Её биогенез скоррелирован с процессами роста и деления клеток. Клеточная оболочка выполняет защитную функцию, ответственна за форму клетки и противостоит осмотическому давлению [36] (рис. 2.1).

У Synechocystis sp. есть специфический наружный слизистый слой с полигональными структурами, который никогда не участвует в процессе клеточного деления [16].

Клетки последовательно делятся в одной или двух плоскостях перпендикулярно или не строго перпендикулярно друг к другу [132]. Они содержат периферические тилакоиды (уплощенные структуры, которые образованы двумя тесно сближенными мембранами). На внешней поверхности тилакоидов располагаются фикобилисомы, состоящие из водорастворимых пигментов белковой природы (фикобилипротеинов), которые поглощают свет и передают энергию возбуждения в реакционные центры, т. е. играют роль антенны. Под электронным микроскопом они имеют вид гранул диаметром 28 - 55 нм, расположенных правильными рядами на внешней поверхности тилакоидов.

Внутреннее трехцилиндрическое ядро фикобилисомы составляют молекулы аллофикоцианина и аллофикоцианина В. К нему примыкают расходящиеся в разные стороны палочковидные образования (стержни), построенные из агрегированных молекул фикоцианина и фикоэритрина, при этом фикоэритрин располагается на периферии.

Помимо пигментов в состав фикобилисомы входят неокрашенные линкерные полипептиды, необходимые для высокоупорядоченной пространственной организации фикобилипротеинов, а также для прикрепления фикобилисомы к мембране [17].

Молярный процент G+C пар оснований в ДНК Synechocystis sp. (гуанин-цитозин - это два из четырёх нуклеотидов, кодирующих аминокислоты, входящие в состав ДНК) находится в пределах 30 - 48%. По этому признаку род подразделяют на три кластера: морские виды, у которых содержание G+C пар составляет 30 - 31%; виды с низким содержанием G+C пар (35 - 37%) и виды с высоким содержанием G+C пар (42 - 48%) [77].

В работе использованы штаммы цианобактерий из коллекции Санкт-Петербургского государственного университета и Московского государственного университета (табл. 2.1)

Штамм Synechocystis sp. РСС 6803 был выделен из пресного водоема в штате Калифорния (США) в 1968 г. Р. Кунизава [95].

Штамм Synechocystis mimiscula CALXJ 713 был выделен из источника в долине гейзеров на полуострове Камчатка (t = 36 С, рН = 7,0) Б.В. Громовым в 2001г. и идентифицирован Э. Куком. Штамм до настоящего времени недостаточно изучен [70].

Исследование чувствительности Synechocystis sp. CALU 713 к токсическому действию соли ртути при разных условиях культивирования

Токсичность соли ртути (Hg(CH3COO)2) исследовали в динамике. Подсчёт живых клеток в инкубационной среде проводили на 4, 7, 10 и 14-е сутки в разных температурных условиях (при 15 и 23 С) и разных условиях освещённости (500 и 2200 лк). Результаты исследования представлены в таблице 3.6.

Согласно представленным данным, во всех сериях эксперимента чувствительность цианобактерии штамма CALU 713 к токсическому действию ацетата ртути в 2 - 180 раз существенно превосходила таковую у штамма РСС 6803.

При оптимальных условиях культивирования (23 С и 2200 лк) минимальная токсичность соли ртути была зарегистрирована на 7-е сутки (ЕС50 = 20,9 ±1,6 мкг-л"1). Однако к концу эксперимента (14-е сутки) наблюдалась 100% гибель исследуемой культуры, что свидетельствовало о высоком токсическом эффекте соли ртути на данный штамм цианобактерии.

При изолированном снижении освещённости до 500 лк в начале эксперимента наблюдался минимальный токсический эффект соли ртути (ЕС50 = 600,5 ± 10,52 мкг-л"1). В динамике, начиная с 7-х суток и до конца наблюдения, отмечалось увеличение токсичности в 38,7 - 500,4 раза по сравнению с исходными данными с максимальной выраженностью на 7-е сутки.

При изолированном снижении температуры среды до 15 С максимальный токсический эффект соли ртути отмечался на 7-е сутки (ЕС50 = 1,3 ± 0,3 мкг-л"1), а минимальный - на 10-е сутки (ЕС50 = 24,8 ±1,5 мкг-л"1).

При максимально некомфортных условиях (температура 15 С, освещённость 500 лк) токсический эффект соли ртути, также как и при действии солей меди и кадмия, был максимально высоким (ECso= 1,6 ± 0,1 - 1,8 ±0,1 мкг-л"1) и сохранялся на протяжении всего эксперимента (до 14-х суток). В этих условиях культивирования токсический эффект соли ртути был в 4,9 -352,9 раза выше, чем при других условиях культивирования. Аналогичная зависимость наблюдалась и в отношении солей других металлов для данного штамма.

Таким образом, в результате проведённых исследований установлено, что цианобактерии штамма Synechocystis sp. CALU 713 обладают высокой чувствительностью к токсическому действию соли ртути Hg(CH3COO)2. На выраженность токсического эффекта данной соли наиболее существенное влияние оказывало снижение температуры среды, в меньшей степени -освещённости. Получены данные об усилении токсического эффекта Hg(CH3COO)2 по влиянию на рост культуры цианобактерии к 10-м суткам, что, по-видимому, связано с более медленным развитием эффекта за счет постепенного истощения адаптационных механизмов. Такой же эффект мы наблюдали для данного штамма и в отношении токсического действия соли меди.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии значительной чувствительности Synechocystis sp. РСС 6803 и CALU 713 к токсическому действию соли ртути, как при оптимальных условиях культивирования (23 С и 2200 лк), так и при изменении температурного и светового режимов. При этом установлено, что токсичность соли ртути для этих штаммов цианобактерии достоверно выше, чем солей меди и кадмия. Однако необходимо отметить, что цианобактерии штамма С ALU 713, как при оптимальных (23 С и 2200 лк), так и при неблагоприятных условиях (15 С и 500 лк) культивирования оказались более чувствительны к токсическому действию соли ртути, чем РСС 6803.

Ультраструктурные изменения клеток Synechocystis sp. при воздействии солей тяжелых металлов

Выявленные по данным световой микроскопии морфологические признаки токсического действия солей тяжелых металлов в отношении исследуемых одноклеточных микроорганизмов позволили предположить отражение этого эффекта на ультраструктурном уровне.

В настоящее время ультраструктурные внутриклеточные изменения при воздействии солей тяжёлых металлов у цианобактерий Synechocystis sp. изучены недостаточно.

В связи с этим на трансмиссионном электронном микроскопе были проведены исследования ультраструктуры клеток цианобактерий Synechocystis sp. штаммов РСС 6803 и С ALU 713 при культивировании в среде с тяжёлыми металлами.

Культуру Synechocystis sp. при оптимальных условиях (23 С, 2200лк) культивировали в среде с добавлениями солей тяжёлых металлов (AgNC ; 3CdS04-8H20; Hg(CH3COO)2; CuS04-5H20) в концентрациях, ингибирующих рост 50% клеток в культуре (ЕСбо)- Затем после пробоподготовки образцы просматривали в электронном микроскопе TESLA-BP 500 при увеличении х 8000, 10000,14000.

Результаты проведённых исследований представлены на рисунках 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8.

Согласно данным, представленным на рисунке 4.3 а, в контроле у Synechocystis sp. РСС 6803 внутриклеточные органеллы тилакоиды расположены в 6 - 8 концентрических рядах в форме подковы. Наружный чехол дифференцирован слабо. Область нуклеоида четко выражена, сферической или овальной формы, несколько ассиметричная, зернистой структуры.

У Synechocystis CALU 713 в контроле тилакоиды расположены в 5 - 6 концентрических рядах, местами резко изгибающихся. Наружный чехол дифференцирован слабо. Область нуклеоида полигональной формы, зернистой структуры (рис.4.3 б)

У Synechocystis sp. штаммов РСС 6803 и С ALU 713, в присутствии всех исследованных солей тяжёлых металлов отмечалось утолщение клеточной стенки, что, по-видимому, связано с адсорбцией ионов тяжёлых металлов на клеточной поверхности, в результате чего клетка теряла сферическую форму.

Помимо этого у цианобактерий обоих исследуемых штаммов наблюдался плозмолиз - отслоение клеточной стенки от протопласта, что, по-видимому, явилось следствием изменения проницаемости цитоплазматической мембраны (рис. 4.4 а-г). Необходимо отметить, что аналогичные эффекты наблюдались при воздействии на клетки цианобактерий всех исследуемых солей тяжёлых металлов.

По данным В. Rai et al. (1990), при воздействии тяжёлых металлов на клетки эукариотических зеленых водорослей наблюдалось разрушение хлорофилла и каротиноидов, отмечалось снижение фотосинтетической активности. Роль белков и липопротеинов в связывании металлов внутри клеток ранее была продемонстрирована N. Robinson (2001).

Результаты наших исследований, полученных при помощи электронной микроскопии показали, что при культивировании цианобактерии штамма РСС 6803 в среде с солями тяжёлых металлов внутри клетки наблюдалось расхождение тилакоидных мембран с расширением внутритилакоидного пространства, а также деструкция этих фотосинтетических органелл (рис. 4.5 а-б).

Аналогичные результаты получены и при изучении воздействия солей тяжёлых металлов на цианобактерии штамма CALU 713: в хроматоплазме наблюдалось реактивная вакуолизация тилакоидов, деструкция фикобилисом и их агглютинация (рис. 4.5 в-г).

Согласно данным, представленным на рисунке 4.6, у Synechocystis sp. РСС 6803 после культивирования в среде с добавлением солей кадмия, меди, ртути и серебра наблюдалось разрушение рибосом, в результате чего цитоплазма теряла характерную зернистость и в ней появлялись обширные светлые участки (рис. 4.6 а-б). Нуклеоид, в норме гомогенный, агрегировал в нерегулярно расположенные плотные тяжи.

При культивировании Synechocystis sp. С ALU 713 в среде с солями тяжёлых металлов также развивались изменения как в цитоплазме, так и в нуклеоиде, в результате чего, нуклеоид приобретал волокнистую структуру, а в нуклеоплазме, на некоторых срезах появлялись электронноплотные внутрицитоплазматические структуры (рис. 4.6 в-г).

По-видимому, данные электронноплотные внутрицитоплазматические структуры являются полифосфатными телами, играющими важную роль в связывании ионов металлов и их детоксикации, что согласуется с данными Т.Е. Jensen et al. (1982), В. Rai et al. (1990), И.Б. Савельева (2000), выявивших накопление полифосфатных гранул у цианобактерий Anabaena flos-aquae, А. variabilis, Nostoc sp. и Plectonema boryanum в ответ на воздействие ионов цинка и кадмия.

Согласно данным представленным на рисунке 4.7, установлено, что при культивировании Synechocystis sp. в среде, содержащей соли тяжёлых металлов, муреиновый слой у двух исследуемых штаммов цианобактерий местами утолщается и толстым слоем располагается между дочерними клетками, что препятствует их расхождению, в результате чего нарушается процесс деления.

В результате проведённых исследований установлено, что под действием солей тяжёлых металлов в культуре цианобактерий обоих штаммов наблюдались деструктивные клетки, у которых в цитоплазме не дифференцировались отдельные органеллы при сохранении мембраны (рис. 4.8 а-г).

Таким образом, в результате анализа данных электронной микроскопии, установлено, что под воздействием солей тяжёлых металлов (AgNOs; 3CdS04-8H20; Hg(CH3COO)2; CuS04-5H20) у цианобактерий Synechocystis sp. CALU 713 и РСС 6803 развиваются аналогичные морфологические изменения.