Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Теоретические аспекты методологии идентификации 15
1.1. Научные принципы и критерии идентификации пищевых продуктов 15
1.2. Обзор методов идентификации растительного сырья и продуктов на их основе
1.2.1. Анализ действующих нормативных документов, регламентирующих процедуры и методы идентификации пищевой продукции, изготовленной на основе растительного сырья или с применением растительного сырья 41
1.2.2. Обзор научных разработок в области идентификации растительного сырья в пищевых продуктах с использованием анатомо-морфологических и физико-химических методов анализа 46
1.2.3. Обзор научных разработок в области идентификации растительного сырья в пищевых продуктах на основе ДНК-технологий 59
Заключение по 1 главе 67
Глава 2. Организация эксперимента. объекты и методы исследований 70
2.1. Организация эксперимента. Объекты исследований 70
2.2. Биологическая характеристика видов исследуемого плодово-ягодного сырья 74
2.3. Методы исследований 82
Глава 3. Исследование, оценка качества и подлинности плодово-ягодного сырья и продуктов его переработки с использованием органолептических и физико-химических методов 96
3.1. Товароведная характеристика исследуемого сырья 96
3.2. Оценка качества используемого плодово-ягодного сырья 100
3.3. Оценка качества и подлинности плодово-ягодного сырья методом ИК-Фурье спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения 115
3.4. Изучение содержания общего белка, его фракционного и аминокислотного состава в исследуемом сырье 132
3.5. Изучение количественного содержания некоторых Р-витаминных веществ плодово-ягодного сырья 144
3.6. Изучение липидного состава плодово-ягодного сырья 147
3.7. Подготовка продуктов переработки плодово-ягодного сырья 154
3.8. Исследование показателей качества продуктов
переработки согласно требованиям нормативных документов 157
Заключение по 3 главе 164
Глава 4. Разработка рецептур модельных многокомпонентных пищевых систем на основе продуктов переработки молокаи плодово-ягодного сырья и оценка их качества согласно нормативным документам
4.1. Мусс творожный с наполнителями из киви/вишни
4.2. Паста творожная с пюре из малины
4.3. Желе на основе молочной сыворотки и плодов банана
4.4. Альбуминовый напиток с пюре из крыжовника Заключение по 4 главе
Глава 5. Разработка метода видовой идентификации свежего и переработанного плодово-ягодного сырья на основе молекулярно-генетического анализа ДНК 192
5.1. Поиск нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ геномов исследуемого плодово-ягодного сырья по базам данных Genbank 192
5.2. Конструирование универсальных праймеров для проведения ПЦР 199
5.3. Определение оптимальных параметров амплификации и оценка специфичности разработанных праймеров 206
5.4. Выбор метода выделения ДНК из объектов исследований 212
5.5. Характеристика ДНК-тест систем и их верификация 217
Заключение по 4 главе 219
Глава 6. Оценка диагностической способности разработанных днк-тест-систем 222
6.1. Изучение влияния условий хранения на качество плодово-ягодного сырья и диагностическую способность ДНК-тест-систем 222
6.2. Оценка диагностической способности ДНК-тест-систем продуктов переработки плодово-ягодного сырья 233
Заключение по 6 главе 238
Глава 7. Практическая реализация результатов исследований по видовой идентификации растительного сырья в многокомпонентных пищевых системах с использованием днк-тест-систем 240
7.1. Технологическая схема идентификации растительного сырья 240
7.2. Детекция результатов амплификации методом гель-электрофореза 245
7.3. Интерпретация полученных результатов ПЦР 246
7.4. Практическая реализация результатов исследований
7.4.1. Идентификация плодово-ягодного сырья в модельных многокомпонентных пищевых системах 248
7.4.2. Идентификация плодово-ягодного сырья в пищевых продуктах, реализуемых на потребительском рынке 252
Заключение по 7 главе 264
Заключение
- Обзор научных разработок в области идентификации растительного сырья в пищевых продуктах с использованием анатомо-морфологических и физико-химических методов анализа
- Биологическая характеристика видов исследуемого плодово-ягодного сырья
- Оценка качества и подлинности плодово-ягодного сырья методом ИК-Фурье спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения
- Желе на основе молочной сыворотки и плодов банана
Введение к работе
Актуальность темы исследований. Одним из наиболее эффективных путей ликвидации дефицита эссенциальных нутриентов является создание функциональных пищевых продуктов. Сегодня в решении этого вопроса все большее внимание уделяется применению растительного сырья, о чем свидетельствует рост объемов российского рынка продуктов с его использованием.
Пищевые растения представляют большую ценность, прежде всего благодаря специфичным сочетаниям биологически и фармакологически активных компонентов. Такие вещества трудно создать искусственно, они хорошо усваиваются организмом человека, обладают лечебным и/или профилактическим действием. Благодаря природной гармонии и многообразию входящих в их состав макро- и микронутриентов (углеводы, витамины, минеральные вещества и др.) использование растительного сырья позволяет повысить пищевую ценность продуктов питания.
В оценке качества плодово-ягодного сырья и продуктов на их основе важное место занимает контроль за соблюдением научно обоснованных рецептур и определения подлинности сырьевого состава готовых продуктов. Известно, что ГОСТы и ТУ устанавливают показатели, нормы и требования к качеству сырья и готовой продукции. В технической документации, разработанной и утвержденной на каждый вид продукции, прописывается состав используемого сырья и его соотношение. Сырье и продукция, содержащие компоненты растительного происхождения, отличающиеся от декларированного содержания данных компонентов в нормативных документах (технические условия, международные национальные и отраслевые стандарты), являются фальсифицированными. По экономическим соображениям наиболее распространенными методами фальсификации являются использование более дешевых пищевых заменителей либо применение пищевых добавок, имитирующих оригинальные ингредиенты, входящие в рецептуру продукта питания. Как правило, продукты, полученные такими способами, имеют пониженную пищевую ценность.
Решение проблемы обнаружения фальсификаций растительного сырья в продуктах требует разработки соответствующих методов идентификации и имеет первоочередное значение в перечне мероприятий, направленных на достижение безопасности и качества реализуемой пищевой продукции. В целях выявления фальсификации пищевой продукции идентификация осуществляется путем совокупной оценки физико-химических и других показателей, подтверждающих подлинность рецептурного состава. Наиболее перспективным для решения данной задачи является метод, основанный на ДНК-диагностике, а именно метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который отличается универсальностью, глубоким уровнем видовой дифференциации, высокой воспроизводимостью и возможностью количественного анализа. Все вышеперечисленное указывает на актуальность настоящего диссертационного исследования.
Степень разработанности темы. На современном этапе формируется научная база по созданию и апробации различных методов идентификации
компонентов растительного сырья в продуктах питания. Имеются научные разработки о возможностях анатомических, органолептических, физико-химических методов анализа для целей идентификации растительных ингредиентов в продуктах питания (Пчелкина, 2009, 2010; Боков, 2014; Горожанина, 2005, 2006; Эллер, Балусова, 2005, 2006; Черняк и др., 2007; Расжигин, 2007, 2008; Гуровская, 2013; и др.). Известны работы как отечественных, так и зарубежных авторов, посвященные вопросам изучения видовой принадлежности и филогенетики растений с применением молекулярно-генетических методов, в том числе с использованием ПЦР (Баева, 2009; Боронникова 2009, 2014; Борон-никова, Нечаева, 2012; Бельтюкова, 2010; Матвеева и др., 2011; Мухина, 2012; Калаев и др., 2012; Москвитина, Dunemann, 2010; Oliveira et al., 1999; Goulo et al., 2001; Fernndez et al., 2002; Nguyen et. al., 2005; Paniego et. al., 2002; Barkley et al., 2006; Dirlewanger et al. 2002; Manifesto et al., 2000; Mc Gregor et al., 2000; Spooner et al., 2005; Tam et al., 2005; Konovalov et al., 2010; Melnikova et al., 2012; Jiao et al., 2014; Schulman et al., 2004; He et al.,2012; Meyers et al., 2003; Porter et al., 2009; Schmutz et al., 2010; Xu et al., 2002; Andolfo et al., 2013 и др.).
В области применения ПЦР разработаны различные методы выделения ДНК, описаны требования, предъявляемые к ДНК-мишеням, имеются оснащенные лаборатории по синтезу родо- и видоспецифичных праймеров, используемых в ПЦР-анализе, описаны различные способы оптимизации стадий проведения ПЦР, имеется ряд разработанных методик по идентификации растительных компонентов в продуктах питания (Фомина, 2012; Архипов и др., 2010; Просеков и др., 2011; патенты: TW1261070; WO2006040373; JP2009279002 (А); GB2283568 (А) и др.). Однако, основанные на ДНК-диагностике методы идентификации растительного сырья в пищевых продуктах пока не нашли широкого применения в практическом товароведении в силу недостаточной научной, методической и технологической базы, что определило актуальность выполненной работы.
Цель и задачи исследований. Целью работы является расширение предупредительных мер фальсификации продукции путем разработки научных аспектов и практической реализации метода видовой идентификации плодово-ягодного сырья в многокомпонентных пищевых системах на основе молекулярно-генетического анализа ДНК.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
- анализ и систематизация действующих нормативных документов, зако
нодательных актов, научной и патентной литературы по критериям и методам
идентификации растительного сырья и продуктов на их основе;
- оценка качества отдельных представителей плодово-ягодного сырья,
встречающегося в рецептурах при формировании ассортимента пищевой про
дукции Rubus idaeus (малины обыкновенной), Fragaria ananassa (земляники са
довой), Rbes va-crspa (крыжовника обыкновенного), Prunus fruticosa (вишни
степной), Rosa majalis Herrm (шиповника майского), Actinidia deliciosa (киви
деликатесной), Msa paradisiaca (банана) и продуктов их переработки с исполь
зованием органолептических и физико-химических методов; обоснование воз-
можности применения этих методов для целей идентификации;
разработка и оценка качества модельных многокомпонентных пищевых систем, в т.ч. на основе продуктов переработки молока и плодово-ягодного сырья в молочных и молокосодержащих продуктах;
разработка метода идентификации плодово-ягодного сырья в продуктах питания на основе молекулярно-генетического анализа ДНК;
оценка диагностической способности разработанных ДНК-тест-систем, в т.ч. изучение влияния условий хранения на качество плодово-ягодного сырья и диагностическую способность ДНК-тест-систем;
практическая реализация результатов исследований по видовой идентификации плодово-ягодного сырья в многокомпонентных модельных пищевых системах, а также реализуемых на потребительском рынке продуктах с использованием разработанных ДНК-тест-систем.
Научная концепция. С целью развития теории и практики выявления ассортиментной и качественной фальсификации предложен высокоэффективный метод видовой идентификации плодово-ягодного сырья в многокомпонентных пищевых продуктах разных технологий производства на основе молекулярно-генетического анализа ДНК. Данный подход позволит обеспечить потребителя безопасной и качественной продукцией и предупредить реализацию на потребительском рынке фальсифицированных товаров.
Научная новизна. Получены новые данные о составе и свойствах плодово-ягодного сырья (Rubus idaeus, Fragaria ananassa, Rbes va-crspa, Prunus fruticosa, Rosa majalis Herrm, Actinidia deliciosa, Msa paradisiaca) с использованием физико-химических методов, в т.ч. ИК-спектры, общий и фракционный состав белков, аминокислотные и липидные профили, содержание катехинов и антоцианов. Сделаны выводы о возможностях апробированных методов для целей видовой идентификации свежего и переработанного плодово-ягодного сырья.
С использованием компьютерного анализа, а также базы данных GenBank NCBI определены консервативные участки последовательностей генов рДНК плодово-ягодного сырья: Rubus idaeus (малина обыкновенная), Fragaria ananassa (земляника садовая), Rbes va-crspa (крыжовник обыкновенный), Prunus fruticosa (вишня степная), Rosa majalis Herrm (шиповник майский), Acti-nidia deliciosa (киви деликатесная), Msa paradisiaca (банан). Сконструированы видоспецифичные праймеры для идентификации ДНК плодово-ягодного сырья методом ПЦР; экспериментально подобраны оптимальные параметры процесса амплификации (концентрация праймеров 10 пкмоль, режим амплификации – 95 оС, 10 с; 60 оС, 10 с; 72 оС, 20 с; 40 циклов). Выбрана универсальная методика экстракции ДНК с использованием коммерческого набора «Сорб-ГМО-А», где в качестве лизирующего агента использован гуанидин хлорид, обеспечивающий максимальный выход ДНК из растительного сырья.
Выявлены отличия в аналитической чувствительности метода ПЦР, обусловленные различной видовой устойчивостью ДНК к механическим воздействиям и термообработке растительного сырья. Установлено, что наиболее
высокая стабильность ДНК характерна для малины, киви и банана – продукты амплификации ДНК в повидле обнаруживаются при разведениях исходных экстрактов ДНК в 100 раз; ДНК земляники характеризуется наибольшей чувствительностью к механическим воздействиям и действию повышенных температур – в повидле земляники продукты амплификации в разведениях исходной ДНК не обнаружены. Экспериментально установлено, что условия хранения плодово-ягодного сырья не оказывают отрицательного влияния на структуру молекул ДНК плодово-ягодного сырья и разработанная ДНК-тест-система с высокой эффективностью позволяет идентифицировать видовую принадлежность гомогенизированного сырья. Показана целесообразность использования метода для практического товароведения.
Научно обоснована и экспериментально доказана высокая эффективность применения ДНК-тест-систем для идентификации плодово-ягодного сырья в продуктах переработки, модельных многокомпонентных пищевых системах и продуктах, реализуемых на потребительском рынке.
Научная новизна соответствует паспорту специальности 05.18.15 (пункт 9) – разработка и совершенствование сенсорных и аналитических методов идентификации и оценки показателей качества пищевых продуктов, продуктов функционального и специализированного назначения.
Теоретическая значимость работы. Результаты по разработке метода видовой идентификации плодово-ягодного сырья в пищевых продуктах на основе ПЦР-анализа являются вкладом в развитие методологической базы товароведной экспертизы при подтверждении соответствия подлинности. На основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей рДНК изучаемого плодово-ягодного сырья показаны внутривидовые связи изучаемых видов растений, что дает понимание предела возможностей использования разработанных прай-меров в экспериментальных исследованиях и практическом товароведении по видовой идентификации сырья, входящего в один биологический род.
Практическая значимость работы. Теоретические и экспериментальные исследования позволили сформулировать требования к технологическим процессам, связанным с получением и апробацией ДНК-тест-систем для идентификации плодово-ягодного сырья в экспериментальных модельных системах и готовых продуктах питания, и разработать методические рекомендации к их использованию (Идентификация плодово-ягодного сырья в продуктах питания методом ПЦР: методическое руководство. – Кемерово: Изд-во КемТИПП, 2017).
Разработана и утверждена техническая документация на получение продуктов (мусс творожный с наполнителем из киви/вишни (ТУ 9209-224-020683315-2017), паста творожная с пюре из малины (ТУ 9222-230-020683315-2017), желе на основе молочной сыворотки и плодов банана (ТУ 9222-231-020683315-2017), альбуминовый напиток с пюре из крыжовника (ТУ 9222-232-020683315-2017). В технические документы внесены методики контроля растительного сырья с использованием ПЦР-анализа.
Результаты исследований прошли успешные испытания в ООО «Биотек»,
ГУ ЯО «Ярославский государственный институт качества сырья и пищевых продуктов», а также заложены в разработанных технических условиях, по которым налажен выпуск продукции на предприятиях отрасли (НПО «Здоровое питание», ООО «МКС»).
Разработанные методы ДНК-анализа используются в учебном процессе ФГБОУ ВО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)» при подготовке бакалавров и магистров, а также при организации научно-исследовательской работы аспирантов.
Методология и методы исследования. Исследования выполнены в рамках инициативных исследований и федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме: «Молекулярно-генетический анализ ДНК растительного происхождения с целью разработки тест-систем для идентификации фальсификации продуктов на их основе», соглашение на предоставление гранта от 14.11.12 № 14. В 37.21.1968.
При проведении исследований использовали общепринятые, стандартные и оригинальные методы исследований – органолептические, биологические, физико-химические (спектрофотометрия, ИК-Фурье спектроскопия, ВЭЖХ, хромато-масс-спектрометрия и др.), микробиологические, методы молекулярно-генетического анализа.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Экспериментальные доказательства ограниченных возможностей применения органолептических и физико-химических методов анализа, как регламентируемых действующей нормативной базой, так и оригинальных методов (по аминокислотным и липидным профилям, ИК-спектрам) для целей идентификации плодово-ягодного сырья в продуктах питания.
-
Дизайн видоспецифичных праймеров для идентификации ДНК плодово-ягодного сырья (Rubus idaeus, Fragaria ananassa, Rbes va-crspa, Prunus fruti-cosa, Rosa majalis Herrm, Actinidia deliciosa, Msa paradisiaca) методом ПЦР и результаты сравнительной оценки методов выделения ДНК из плодово-ягодного сырья и продуктов его переработки.
-
Результаты оптимизации параметров проведения ПЦР, экспериментальные данные по выявлению предела обнаружения метода при различных условиях хранения и технологиях переработки плодово-ягодного сырья.
-
Доказательства высокой эффективности разработанных ДНК-тест-систем для видовой идентификации плодово-ягодного сырья в практическом товароведении для контроля качества продуктов переработки плодово-ягодного сырья, модельных многокомпонентных пищевых систем и продуктов, реализуемых на потребительском рынке, подвергнутых различным химическим и физическим воздействиям.
Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты диссертационной работы обсуждены на конференциях межрегионального и международного уровней: V Международной научно-практической конференции (Новосибирск, 2014); Международной научной конференции «Пищевые инновации и биотехнологии» (Кемерово, 2014, 2015); Международной научно-
практической конференции «Интеграционные процессы развития мировой научной мысли в XXI веке» (Казань, 2014); XII Международной научно-практической конференции «Проблемы современной биологии» (Москва, 2014); Международной научно-практической конференции «Инновационные вопросы в научной среде» (Уфа, 2014); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной науки в XXI веке» (Махачкала, 2014); Международной научно-практической конференции «» (Белгород, 2014); Международной научно-практической конференции «Безопасность и качество сельскохозяйственного сырья и продовольствия. Создание национальной системы управления качеством пищевой продукции» (Москва, 2016).
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в монографиях, статьями в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации основных материалов диссертационных исследований: «Достижения науки и техники АПК», «Пищевая промышленность», «Вестник КрасГАУ», «Техника и технология пищевых производств», «Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий», «Успехи современного естествознания», «Техника и технология», а также в журналах из международных баз цитирования Scopus и Web of Science, материалах конференций, сборниках научных работ институтов, отчетах по НИР, в методических указаниях и др.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка литературы (505 источников, в том числе 125 иностранных) и приложений. Работа изложена на 345 страницах, содержит 83 рисунка и 57 таблиц.
Обзор научных разработок в области идентификации растительного сырья в пищевых продуктах с использованием анатомо-морфологических и физико-химических методов анализа
Идентификация как вид деятельности имеет свою структуру, включающую цели и задачи, объекты и субъекты, средства и методы.
Идентификация имеет сходства и различия с другими видами оценочной деятельности: оценкой качества, контролем качества и сертификацией. Общими признаками являются испытания для определения фактических значений и проверка соответствия требованиям нормативных документов. Различия заключаются в перечне критериев; в субъектах, определяющих оценочную деятельность; в конечном результате. Конечным результатом идентификации является подтверждение соответствия либо выявление фальсификации.
Термин идентификация трактуется по-разному. Анализ нормативных документов показал, что термин «идентификация» имеет следующие определения.
Идентификация – процедура, посредством которой устанавливают соответствия представленной на сертификацию продукции требованиям, предъявляемым к данному виду продукции нормативными документами (Сертификация пищевых продуктов и продовольственного сырья в РФ, 1996).
В ГОСТ Р 51293-99 дается следующее определение идентификации: «Идентификация – установление соответствия конкретной продукции образцу и/или ее описанию» [88].
В ФЗ от 2.01.2000 № 29-ФЗ термин идентификация определяется как «деятельность по установлению соответствия определенных пищевых продуктов, материалов и изделий требованиям нормативных, технических документов и информации о них, содержащейся в прилагаемых к ним документах и на этикетках» [237].
Наиболее четким является определение, данное в ФЗ от 27.12.2002 № 184-ФЗ (в ред. от 23.07.2013) «О техническом регулировании»: «Идентификация – установление тождественности продукции ее существенным признакам» [238].
Существенные признаки – это критерии идентификации, предназначенные для установления тождественности и/или подлинности товаров. Критерии могут быть выражены с помощью комплексных и/или единичных показателей качества или характеристик. В качестве критериев идентификации должны быть выбраны показатели, отвечающие следующим требованиям: типичность для конкретного вида, наименования или однородной группы продукции; объективность и сопоставимость; проверяемость; трудность фальсификации. Наибольшую значимость имеет типичность, которая может характеризоваться комплексными или, что реже, единичными показателями, дополняющими друг друга и отличающимися разной степенью достоверности. Так, для кофе натурального наиболее типичным критерием идентификации служит содержание кофеина. Однако при частичной небольшой замене натурального кофе зерновыми заменителями или цикорием не всегда возможно идентифицировать натуральность кофе по кофеину. В этом случае критерий содержания кофеина должен быть дополнен органолептическими методами, а также определением микроструктуры тканей. Добавка зерновых заменителей приведет к появлению крахмальных зерен, что для кофе несвойственно.
В связи с этим в нормативном документе (ГОСТ Р 51881-2002) на кофе растворимый, который подвергается более частой фальсификации, чем кофе в зернах, введен новый показатель для цели идентификации – массовая доля углеводов (общая глюкоза, общая ксилоза) в пересчете на сухое вещество. Такой показатель позволяет отличить кофейное зерно от зерна хлебных злаков, но не позволяет выявить видовую принадлежность кофе, т.е. к какому виду относится кофейное зерно – Арабика, Робуста или Либерика [91].
Для виноградных вин наиболее типичными и объективными критериями идентификации являются количество и размер взвешенных коллоидных частиц, изменение дисперсности и устойчивости коллоидных систем при добавлении электролитов, например, NaCL и изменении рН.
Данные критерии идентификации широко используются в исследованиях, посвященных разработке и оценке потребительских свойств напитков. Анализ литературных данных установил, что наряду с известными критериями авторами предлагаются новые критерии и показатели, что связано с применением новых видов сырьевых ресурсов, в том числе плодово-ягодного сырья.
В работах Школьниковой М.Н. [372] разработаны многокомпонентные напитки на основе растительного сырья, отличительной особенностью оценки которых являются показатели, характеризующие подлинность и физиоло гическую ценность напитков. Выделены маркеры, подтверждающие подлинность бальзамов, проведено исследование пигментных биологически активных соединений черники обыкновенной в качестве показателя подлинности сырья [152, 370, 371, 373].
Рядом авторов (Маюрниковой Л.А., Гореликовой Г.А., Школьнико-вой М.Н.) предложены безалкогольные напитки на основе обогащенного селеном донника, дополнительным показателем качества для идентификации в напитке селена является показатель, отражающий содержание селена в готовом напитке [52, 53, 54]. Разработаны десерты профилактического назначения [192], напитки, обогащенные микронутриентами, выделены маркеры для идентификации подлинности напитков [52, 152, 191, 193].
Васильевой С.Б. с соавторами проведены исследования плодово-ягодного сырья Кузбасса (арония, барбарис, брусника, вишня Бессея и Степная, ирга, клюква, крыжовник, черная смородина, шиповник) и показана его безопасность для использования в свежем и переработанном виде. Доказано, что плоды ирги и вишни из Кемеровской области обладают высокими орга-нолептическими свойствами и накапливают значительное количество пищевых веществ, служат доступным и ценным растительным сырьем и могут использоваться при производстве плодовых вин [30].
В данных работах отсутствуют показатели для целей идентификации растительного сырья, а приводятся показатели, косвенно характеризующие его присутствие – физиологическая ценность, органолептические показатели, содержание обогащающего компонента.
Биологическая характеристика видов исследуемого плодово-ягодного сырья
Постоянное совершенствование методов молекулярной биологии и накопление данных по составу генома плодово-ягодных растений [159, 188, 210, 390, 407] способствовали появлению методов идентификации сырья растительного происхождения в продуктах питания, основанных на ДНК-технологиях с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод полимеразной цепной реакции позволяет из единичных клеток, содержащихся в анализируемом образце, получить необходимое количество ДНК для их идентификации [444]. Установление видовой принадлежности растительного сырья при помощи ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем видовой дифференциации, высокой воспроизводимостью и возможностью количественного анализа. Кроме того, ДНК более устойчива в условиях технологического процесса, чем традиционно используемые низкомолекулярные маркеры [387]. Учеными предложены многочисленные модификации по совершенствованию ПЦР [294, 335, 355, 364, 365, 380, 438, 476].
Несмотря на то, что использование метода ПЦР для видовой идентификации тканей растительного происхождения получило высокую оценку зарубежных специалистов, в нашей стране это направление не нашло еще широкого практического применения.
Достаточно много работ посвящено изучению методов выделения ДНК из растительных объектов. Выделение ДНК из объектов исследований, ее количество и чистота существенно влияют на проведение молекулярно-генетического анализа [389, 445].
Исследователи Manen J.F. et al. [382] разработали метод выделения ДНК без гомогенизации растительного материала и центрифугирования. Основным способом избавления от клеточной стенки являлась правильно подобранная энзиматическая смесь выделенных из Trichoderma longibrachiatum различных карбогидраз, гидролизующих клеточные стенки. Оптимизация времени инкубации для каждого из испытанных видов растений способствовала выходу ДНК без ее фрагментации.
Для выделения ДНК используют методы с раствором мелкодисперсного оксида кремния «силики» при выделении из агарозных гелей [399, 499], микроорганизмов [447, 482], почв [415, 478], некоторых эукариот [395, 422, 434], листьев растений [135]. Эти методы продемонстрировали, что ДНК, выделенная с использованием раствора оксида кремния, может быть использована для проведения ПЦР реакции [388, 415] и других манипуляций с ДНК [422].
Существуют способы, позволяющие, по утверждению исследователей, выделять ДНК, пригодную для целей рестрикции и амплификации, из бактерий, грибов и растений без использования потенциально опасных растворителей фенола и хлороформа [267, 446]. Общей проблемой высших растений при выделении ДНК являются загрязняющие вещества, у плодово-ягодных культур – это присутствие повы 61 шенного содержания полисахаридов [416, 423, 452] и полифенолов [402, 405, 435, 441]. В дальнейшей работе это влияет на использование ДНК в исследованиях путем угнетения энзимной активности реакции [401]. Также ДНК из выделенных образцов становится нестабильной для длительного хранения [384, 490]. Присутствие различных ингибиторов в растворе вызывает угнетение ДНК-полимеразной активности [396].
В литературе описаны результаты по выделению ДНК и удалению полисахаридов из разнообразных источников [383, 394, 396, 404, 406, 417, 433, 452, 477, 485, 486, 489, 490, 505].
Существует 2 основных принципиальных классических подхода для очистки целевой ДНК: очистка путем органической экстракции [393] с последующим осаждением ДНК спиртами и растворением ее в воде и ТЕ-буфере и дифференциальная сорбция ДНК на твердом носителе. В настоящее время широкое распространение получили методы выделения ДНК и РНК, основанные на связывании нуклеиновых кислот с сорбирующими носителями. Наборы для выделения ДНК широко коммерциализованы. В качестве сорбирующих выступают силикатные [386, 397, 419] и реже нитроцеллюлоз-ные [272, 442] носители. Гель хроматография практически не используется при изоляции нуклеиновых кислот, в то время как для выделения аминокислот метод широко применим [440].
Однако следует заметить, что, несмотря на разработанные методы выделения ДНК из растительных объектов, не существует единого оптимального метода экстракции ДНК, и в каждом конкретном случае в зависимости от вида сырья и его химического состава необходимо оптимизировать процедуру выделения ДНК [118, 292].
На базе ФГБОУ ВО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)» проведены работы по подбору коммерческих наборов реагентов, позволяющих получать высокого качества ДНК из животного и плодово-ягодного сырья. Просековым А.Ю. с соавторами [150] выбран оптимальный высокопроизводительный метод выделения животной ДНК из проб биологического происхождения и многокомпонентных составов на их основе. Изучено количественное содержание животной ДНК в пробах биологического происхождения и многокомпонентных составах на их основе. Проведен сравнительный анализ методик выделения ДНК растений продовольственного сырья. На основании полученных данных предложен наиболее эффективный способ выделения ДНК [291]. Голубцовой Ю.В., Ше-вяковой К.А. [46] исследован способ экстракции ДНК из ягод крыжовника и продуктов с их использованием. Установлено, что при использовании набора реагентов «Сорб-ГМО-А» получена ДНК более высокой концентрации и чистоты. Остроумовым Л.А. с соавторами [201] проведен сравнительный анализ методов экстракции ДНК из образцов фруктов и продуктов питания на их основе. Установлено, что наибольшей эффективностью отличается коммерческий набор «ПРОБА-ЦТАБ» и «Набор реактивов для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов» (разработчик ООО «НПО ДНК-технология», Москва). Москвиной Н.А., Голубцовой Ю.В. и др. [212] показано, что для экстракции ДНК из продуктов переработки плодово-ягодного сырья наиболее приемлемыми являются коммерческие наборы «ПРОБА-ЦТАБ» и «Сорб-ГМО-А».
Проведен анализ нуклеотидных последовательностей геном плодово-ягодного сырья, используемых в производстве продуктов питания [8, 47] и их филогении [5, 211, 220]; оптимизированы параметры проведения полимераз-ной цепной реакции; показана возможность использования разработанных олигонуклеотидных праймеров для видовой идентификации персика и абрикоса в термообработанных продуктах [221]; разработана ПЦР-тест-система для идентификации в повидле плодово-ягодного сырья (Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniana, Prunus per-sica) [219].
Оценка качества и подлинности плодово-ягодного сырья методом ИК-Фурье спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения
Метод ИК-спектроскопии широко используется для оценки подлинности и качества лекарственного сырья, в частности в оценке загрязнения сырья элементами техногенной группы [34, 141, 142, 337, 357]; в исследованиях по идентификации компонентов растительного сырья, в частности триогликози-дов [343].
Проведенные нами исследования показали, что с помощью метода ИК-Фурье спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения можно получить индивидуальные ИК-спектры плодово-ягодного сырья. Экспериментально установлено, что рисунок ИК-спектра, такие спектральные характеристики, как интенсивность полосы поглощения и площадь под спектральной кривой поглощения являются строго специфичными для каждого вида сырья и позволяют идентифицировать видовую принадлежность при введении в библиотеку прибора стандартного спектра образца.
Остается открытым вопрос о возможностях данного метода в идентификации растительного сырья в многокомпонентных пищевых системах.
В работе предпринята попытка идентификации вида плодово-ягодного сырья в многокомпонентной пищевой системе. Для этих целей были сняты спектры плодово-ягодного сырья (малины, киви, крыжовника, шиповника, банана, земляники, вишни, черешни и др.) и введены в библиотеку ИК-спектрометра и в дальнейшем были использованы для изучения возможности идентификации вида плодово-ягодного сырья в фруктовых гомогенизированных смесях.
Данные спектрограммы, представленной на рис. 3.8, показывают, что программный пакет IRsolution ИК-спектрометра из собственных библиотек спектров идентифицировал наличие плодово-ягодного сырья с вероятностью 799–769 % и 717 % из 1000 (позиции 1–6 и 8 в подписях к рис. 3.8), однако выбрал в качестве основного вида – плоды черешни, которых не было во фруктовой смеси (выделенная позиция № 1 в списке ИК-спектров библиотеки).
В литературных источниках практически нет сведений о возможности использования ИК-спектроскопии в оценке подлинности растительного сырья в составе многокомпонентных пищевых систем. Имеется работа И.А. Авиловой и Д.В. Хлыстова [2] по возможности использования метода ИК-спектроскопии для определения качества растительных масел, подтверждения подлинности состава, а также для идентификации производителя растительных
Таким образом, метод ИК-Фурье спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения позволяет идентифицировать плодово-ягодное сырье; полученные индивидуальные ИК-спектры и спектральные характеристики
(интенсивность полосы поглощения и площадь под спектральной кривой поглощения) являются строго специфичными для каждого вида сырья и обусловлены, по-видимому, морфологическими особенностями строения и химического состава.
Изучение возможности применения метода ИК-Фурье спектроскопии для идентификации вида плодово-ягодного сырья в многокомпонентных пищевых системах (гомогенизированных плодово-ягодных смесях) показало, что данный метод не позволяет идентифицировать конкретный вид искомого сырья.
Растительные белки являются составной частью многих продовольственных товаров. Большинство плодов, ягод и овощей содержат мало белка – около 0,5–1,5 %, и их аминокислотный состав значительно беднее аминокислотного состава белков животного происхождения [331]. Вместе с тем при использовании плодов, ягод, овощей значительно улучшается усвояемость белков других продуктов (мясо, хлеб, крупы). Кроме того, малое количество белков позволяет широко использовать овощи и фрукты в диетах с ограничением белка.
Более существенная роль у ферментов растений. В свежих плодах и овощах содержится высокоактивный комплекс ферментов, сохраняющих свою активность в кишечнике и включающихся в процесс гидролиза и синтеза органических веществ. Это значительно облегчает работу кишечника и способствует лучшему усвоению зерномучных, кондитерских, жиросодер-жащих, мясных и рыбных продуктов. Азотистые вещества овощей, фруктов и ягод имеют существенное значение для формирования потребительских свойств этих продуктов, в частности в формировании вкуса и аромата.
Товароведение как наука непрерывно развивается, что выражается в разработке новых научно обоснованных товароведных показателей, качественно и количественно характеризующих свойства сырья и продовольственных товаров, которые могут использоваться в оценке качества и подлинности используемых компонентов при производстве продуктов питания.
Существуют работы по использованию характеристик белков и аминокислот в оценке качества растительных белков и натуральности продуктов (в частности мандаринового сока).
Гуровской Е.А. [111, 112] разработан новый объективный товароведный показатель качества растительных белков – молекулярная масса, который внесен в качестве основного критерия в нормативную документацию – ТУ-9143-022-56529037-13 и может служить достоверным критерием при определении степени фальсификации растительного сырья и продуктов его переработки. Разработан модифицированный метод тонкослойной гель-хроматографии (ТСГХ) определения молекулярной массы как составной части комплекса методов, предназначенных для товароведной оценки растительных белков, простой, экономичный, доступный. На основе модифицированного метода ТСГХ разработаны методики определения ММ белков 21 злака и патент RU 1793372, разработан способ контроля натуральности мандариновых соков по значению массовой концентрации общего и аминно-го азота (формального числа), пролина, массовой доли золы, ее щелочности, хлораминового числа. Если хотя бы один из вышеуказанных показателей не входит в пределы варьирования, то фиксируется факт нарушения натуральности [258].
В данном подразделе предпринята попытка выявления видовых особенностей исследуемого плодово-ягодного сырья по содержанию общего белка, его фракционного и аминокислотного состава.
Желе на основе молочной сыворотки и плодов банана
Использование растительных добавок в производстве молочных продуктов оказывает влияние на содержание в них витаминов, углеводов, минеральных веществ, пищевых волокон. Кроме того, молочным продуктам они придают выраженный вкус и запах добавленных растительных наполнителей, а также привлекательный внешний вид. Кроме улучшения органолепти-ческих показателей продукта, растительные ингредиенты выполняют роль пребиотика, вследствие чего данный продукт можно рекомендовать для питания людей в условиях неблагоприятных эколого-гигиенических факторов, а также для массового питания [22, 121, 136, 189, 223, 225, 293, 316].
Однако не исключена возможность фальсификации по структуре и видовой принадлежности плодово-ягодного сырья и готовых молочных продуктов на его основе. По экономическим соображениям чаще всего фальсифицируют малоценное плодово-ягодное сырье, реализуя его как высококачественное [204].
В данной главе представлены результаты по подбору ингредиентного состава и технологий производства молочных продуктов – мусса творожного с наполнителями из киви/вишни, пасты творожной с пюре из малины, желе на основе молочной сыворотки и плодов банана, альбуминового напитка с пюре из крыжовника.
Задачи данного этапа исследований: - подбор ингредиентного состава и технологий молочных продуктов с использованием плодово-ягодного сырья; - оценка качества разработанного продукта по органолептическим, физико-химическим показателям качества и показателям безопасности; - оценка возможности использования регламентируемых показателей качества с целью видовой идентификации плодово-ягодного сырья в составе продукта; - разработка технической документации на молочный продукт с последующим включением в перечень показателей качества показателей для цели идентификации вида плодового или ягодного сырья.
Учеными разработаны различные рецептуры и технологии получения муссов: муссов творожных с фруктовыми наполнителями из банана, апельсина, кураги, лимона [293]; сливочного мусса с добавлением овсяной муки [129]; гипоаллергенного мусса на молочной сыворотке [306]; мусса клюквенного на основе молочной сыворотки с заменой желатина на пищевые волокна Citri-Fi, а сахара на фруктозу [32]; мусса на молочной сыворотке с фруктовыми порошками [126]. Имеются объекты интеллектуальной собственности на композиции для получения мусса творожного [270] и способа его производства [264] и др.
В качестве исходных компонентов при разработке мусса творожного с плодово-ягодными наполнителями использовали: творог обезжиренный, молоко сухое обезжиренное, воду для молока, желатин, воду для желатина, сахар, плодово-ягодный наполнитель (плоды киви и вишни).
Творог, используемый для приготовления модельных образцов, имел характеристики, соответствующие требованиям ГОСТ 31453-2013 «Творог. Технические условия» [92]: 168 органолептические - внешний вид и консистенция: мягкая, рассып чатая, с наличием частиц молочного белка, с незначительным выделением сыворотки; цвет: белый, равномерный по всей массе; запах и вкус: чистые, кисломолочные, без посторонних привкусов и запахов; физико-химические - кислотность - не более 240 Т, массовая доля влаги - не более 80 % .
Предложена технология производства муссов с плодово-ягодным сырьем. Технологическая схема включает следующие операции: – приемка и хранение сырья; – подготовка сырья к производству; – смешивание подготовленных рецептурных компонентов (творога и подготовленного сухого молока); – охлаждение полученной смеси и взбивание; – добавление в полученную массу подготовленного желатина, сахарной пудры, растительного наполнителя и взбивание в течение 15 секунд, диспергирование в течение 5–7 минут, пастеризация при 75–80 С в течение 5–7 минут, охлаждение до 23–27 С, дополнительное взбивание при этой температуре в течение 5 минут при 1500 об/мин, расфасовка при температуре 23–27 С и охлаждение до 2–6 С. – фасовка, упаковка, маркировка; – хранение. Сырье принимают по количеству и качеству по документам в соответствующем порядке, установленном ОТК предприятия.
Подготовка сырья к производству заключается в том, что все сухие компоненты (сахар-песок, сухое обезжиренное молоко) просеивают через сито и пропускают через металломагнитные уловители во избежание попадания в готовый продукт посторонних примесей. Сахар-песок измельчают до сахарной пудры. Плодово-ягодное сырье подвергают мойке в холодной проточной воде с температурой 18–22 С и очистке. Перед использованием обезжиренный творог измельчают (протирают) до преобладающего размера частиц не более 0,250 мм при температуре (18±3) С. Затем подготовленный творог соединяют с восстановленным обезжиренным пастеризованным молоком; полученную основу охлаждают до температуры 2–4 С и взбивают при числе оборотов рабочего органа не менее 2250 об/мин. Во взбитую творожную массу вводят тонкой струйкой подготовленный желатин, сахарную пудру, растительный наполнитель и взбивают еще в течение 15–20 секунд. Так как смесь для взбивания дополнительно содержит плодово-ягодные наполнители, полученную смесь нагревают до 35–48 С в течение 5–7 минут, пастеризуют при 75–80 С в течение 5–7 минут, затем охлаждают до 23–25 С при непрерывном перемешивании и расфасовывают при этой же температуре, расфасованный продукт охлаждают до 2–6 С. В процессе охлаждения в течение 2–4 часов происходит формирование структуры продукта. Фасуют продукт в полимерную упаковку. Микробиологическая безопасность готового продукта достигается путем использования тепловой обработки 75–80 С 5–7 минут и внесения сахара. Проведены товароведные исследования показателей качества готовых творожных муссов с киви и вишней по органолептическим, физико-химическим и микробиологическим показателям и разработаны регламентируемые показатели качества.
По органолептическим показателям продукт должен соответствовать требованиям, указанным в таблице 4.2.
Муссы имеют приятный вкус и запах, соответствующий внесенному плодово-ягодному сырью, без посторонних привкусов и запахов. Консистенция имеет однородную структуру, хорошо взбитую, слегка мажущуюся.