Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современное состояние проблемы создания сосудистых протезов малого диаметра на основе биодеградируемых полимеров (обзор литературы) 17
1.1 Актуальность, мировая потребность, условия рынка и обоснование возможности использования тканеинженерных подходов при создании прочных и биосовместимых сосудистых протезов малого диаметра 17
1.2 Биодеградируемые полимеры и метод электроспиннинга в создании биодеградируемых сосудистых графтов малого диаметра 21
1.3 Феномен клеточной инфильтрации биодеградируемых сосудистых графтов, изготовленных методом электроспиннинга 28
1.4 Увеличение размеров пор и пористости физическими и химическими методами 30
1.5 Пептидные последовательности, имитирующие внеклеточный матрикс, как субстрат для биофункционализации сердечно-сосудистых имплантатов. Методы иммобилизации 33
1.6 Подходы к модификации искусственных каркасов ростовыми факторами и хемоаттрактантными молекулами, пригодными для использования в тканевой инженерии кровеносных сосудов 42
Глава 2 Материалы и методы исследования 55
2.1 Изготовление биодеградируемых сосудистых графтов малого диаметра 55
2.1.1 Изготовление пленочных матриксов с различным долевым соотношением полимеров в растворе 55
2.1.2 Изготовление сосудистых графтов, немодифицированных и модифицированных дифференцировочными молекулами 56
2.2 Протокол модификации RGD- пептидами сосудистых графтов и последующая детекция пептидов на полимерных поверхностях 58
2.2.1 Активация полимерной поверхности сосудистых графтов 58
2.2.2 Коньюгация полимерной поверхности с RGD-пептидами 59
2.2.3 Детекция аминокислот на поверхности сосудистых графтов 59
2.3 Физико-механические испытания сосудистых графтов 60
2.4 Сканирующая электронная микроскопия поверхности сосудистых графтов 61
2.4.1 Сканирующая электронная микроскопия сосудистых графтов до и после модификации поверхности 61
2.4.2 Сканирующая электронная микроскопия эксплантированных образцов графтов 62
2.4.3 Изучение элементного состава кальцификатов в эксплантированных сосудистых графтах 63
2.5 Сравнительная оценка гемосовместимости сосудистых графтов 64
2.6 Оценка биодеградации in vitro трубчатых каркасов и определение кардиотоксичности продуктов деградации 65
2.7 Оценка распределения дифференцировочных молекул в процессе их инкорпорирования в состав сосудистых графтов 67
2.8 Определение in vitro активности RGD- пептидов, ростовых факторов и хемоаттрактантных молекул в составе сосудистых графтов 68
2.8.1 Изучение адгезии и жизнеспособности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, культивируемых на поверхности пленочных матриксов c различным соотношением PHBV и PCL 68
2.8.2 Изучение адгезии и жизнеспособности эндотелиальных клеток пупочной вены человека, культивируемых на поверхности нетканых матриксов с и без RGD 69
2.8.3 Изучение адгезии, жизнеспособности, пролиферации, ангиогенных свойств и секреторной активности клеток гибридомы линии Ea. hy 926, культивируемых на поверхности или в присутствии нетканых матриксов с и без дифференцировочных факторов 70
2.9 Подкожная имплантация пленочных матриксов 74
2.10 Имплантация сосудистых графтов в брюшную часть аорты крыс и оценка проходимости 75
2.11 Гистологическое исследование эксплантированных сосудистых графтов 76
2.12 Иммуногистохимическое исследование эксплантированных сосудистых графтов 78
2.13 Иммунофлуоресцентное исследование эксплантированных сосудистых графтов 79
2.14 Статистические методы 81
Глава 3 Определение оптимальной композиции полимеров для создания каркаса биодеградируемого сосудистого графта 82
3.1 Особенности взаимодействия с клетками in vitro и сроки биодеградации in vivo пленочных матриксов различного полимерного состава 82
3.2 Оценка гемосовместимости нетканых матриксов различного полимерного состава 89
3.3 Оценка биодеградации in vitro трубчатых каркасов на основе PHBV/PCL и определение кардиотоксичности продуктов деградации 93
Глава 4 Разработка протоколов изготовления и модификации биодеградируемых сосудистых графтов малого диаметра с оценкой структуры поверхности и физико-механических свойств 99
4.1 Разработка протоколов изготовления трубчатых биодеградируемых каркасов сосудистых графтов методом электроспиннинга c технологий загрузки дифференцировочных факторов в состав нетканых матриксов в процессе электроспиннинга 99
4.2 Разработка протокола изготовления трубчатых биодеградируемых каркасов сосудистых графтов с послойным инкорпорированием дифференцировочных факторов. Оценка свойств биодеградируемых трубчатых каркасов с изолированным и послойным инкорпорированием ростовых факторов и хемоаттрактантных молекул 111
4.3 Разработка протоколов изготовления трубчатых биодеградируемых каркасов сосудистых графтов методом электроспиннинга c технологий последующей модификации поверхности RGD- пептидами 117
4.4 Сравнительное изучение физико-механических характеристик биодеградируемых сосудистых графтов, модифицированных RGD пептидами 123
Глава 5 Оценка in vitro биосовместимости полимерных нетканых матриксов на основе полигидроксибутирата/валерата и поликапролактона, модифицированных RGD пептидами, ростовыми факторами и хемоаттрактантными молекулами 126
5.1 Оценка in vitro активности ростовых факторов и хемоаттрактантных молекул, инкорпорированных в состав матриксов в процессе двухфазного электроспиннинга 126
5.2 Оценка качества модификации и биосовместимости нетканых матриксов, модифицированных RGD- пептидами 146
Глава 6 Особенности ремоделирования сосудистой ткани in situ на основе функционально активных биодеградируемых графтов малого диаметра в зависимости от приемов модификации поверхности 151
6.1 Изменение физико-механических характеристик биодеградируемых сосудистых графтов в процессе долгосрочной имплантации на фоне ремоделирования сосудистой ткани на месте биодеградируемого трубчатого каркаса 151
6.2 Сравнительные результаты долгосрочной имплантации биодеградируемых сосудистых графтов, модифицированных VEGF (модель придания функциональной активности трубчатому каркасу в процессе его изготовления) или RGD- пептидами (модель химической модификации поверхности готового каркаса) 157
6.3 Результаты имплантации биодеградируемых сосудистых графтов диаметром 2 мм с изолированно и послойно инкорпорированными VEGF, bFGF и SDF-1 и особенности ремоделирования элементов новообразованной сосудистой ткани на их основе 167
6.4 Формирование элементов новообразованной сосудистой ткани в зоне локации сосудистых графтов PHBV/PCL/GF mix диаметром 1,5 мм 178
Глава 7 Изучение процессов кальцификации эксплантированных сосудистых графтов 194
Заключение 210
Выводы 218
Практические рекомендации 220
Список сокращений 221
Список литературы 224
- Биодеградируемые полимеры и метод электроспиннинга в создании биодеградируемых сосудистых графтов малого диаметра
- Особенности взаимодействия с клетками in vitro и сроки биодеградации in vivo пленочных матриксов различного полимерного состава
- Оценка качества модификации и биосовместимости нетканых матриксов, модифицированных RGD- пептидами
- Изучение процессов кальцификации эксплантированных сосудистых графтов
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных причин смертности населения во всем мире [Бокерия Л. А. и др., 2015]. Большое количество случаев ишемической болезни сердца, заболеваний периферических кровеносных сосудов, цереброваскулярных заболеваний обуславливает высокую потребность в сосудистых протезах малого диаметра для хирургического лечения данных процессов. На сегодняшний день клиническим стандартом для проведения шунтирующих операций и реконструкции сосудов малого диаметра являются аутологичные кровеносные сосуды. Однако аутологичные вены и артерии далеко не всегда доступны для проведения операций. В свою очередь, синтетические протезы, такие как Dacron или ePTFE, которые успешно используют для протезирования сосудов большого и среднего диаметра (> 6 мм), демонстрируют низкую проходимость при диаметре меньше 5 мм вследствие тромбоза и гиперплазии неоинтимы. Данные проблемы обусловлены низкой скоростью кровотока в сосудах малого диаметра и низкой тромборезистентностью синтетических сосудистых протезов [Desai M. et al., 2011; Tatterton M. et al., 2012]. Еще одним важным недостатком биостабильных синтетических сосудистых протезов является отсутствие способности к адаптивному росту, что зачастую требует повторного хирургического вмешательства, которое часто приводит к неблагоприятным исходам в отдаленном периоде [Palumbo V. D. et al., 2014; Rocco K. A. et al., 2014]. Особую важность это имеет у детей с пороками сердца, которым в силу возрастного роста часто требуется замена сосудистого протеза.
В клинической практике отсутствуют готовые к применению сосудистые протезы малого диаметра, которые могут быть использованы для проведения шунтирующий операций и замены поврежденных кровеносных соcудов. Решением данной проблемы может стать создание сосуда непосредственно в организме на основе функционально активного биодеградируемого сосудистого графта, обладающего высокой биосовместимостью и способностью к пролонгированной резорбции с возможностью замещения каркаса собственными клетками и тканями пациента, а также возможностью управлять клеточным поведением [Patel H. et al., 2011; Catto V. et al., 2014].
Для регенерации живой ткани каркасы должны иметь структуру, которая действует как шаблон для роста ткани в трех измерениях и стимулирует новый рост в форме, заданной 3D-каркасом. Метод электроспиннинга позволяет изготавливать
матриксы из большого разнообразия материалов, формируя каркасы с высоким соотношением площади поверхности к объему, а также вводить биологически активные компоненты в структуру каркасов в процессе их изготовления [Hasan A. et al., 2014; Woods I. et al., 2014]. Функционально активная полимерная поверхность обладает преимуществами по сравнению со многими другими материалами для использования в качестве искусственного внеклеточного матрикса за счет возможности эффективно управлять клеточным поведением [Севастьянов В. И. и др., 2011; Chen L. et al., 2016].
Одной из важных целей при разработке тканеинженерных сосудистых протезов является снижение тромбообразования, в том числе, посредством скорейшего воссоздания на внутренней поверхности протезов монослоя эндотелиальных клеток [Morgan B., 2016]. В физиологических условиях эндотелий сосудов обладает высокой тромборезистентностью, продуцируя большое количество биологически активных факторов, которые связаны с гомеостазом, фибринолизом, нарушением сосудистого тонуса, проницаемостью сосудов, синтезом факторов роста [Fadini G. P. et al., 2012]. Сформированный на внутренней поверхности сосудистых протезов непрерывный функционально активный эндотелиальный монослой препятствует запуску тромбообразования и гиперплазии неоинтимы, способен значимо улучшить краткосрочную и долгосрочную проходимость создаваемых конструкций. Образование эндотелиального слоя возможно in situ после имплантации протеза в кровоток благодаря привлечению или захвату эндотелиальных прогениторных клеток из кровотока, которые после адгезии на пористой поверхности графта способны пролиферировать и полностью заполнять поверхность, дифференцируясь далее в зрелые эндотелиальные клетки [Lee K. W. et al., 2013].
Эластические волокна и коллаген увеличивают эластичность и
комплаентность сосудистой стенки и влияют на функцию гладкомышечных клеток, поэтому формирование данных структур на месте временного трубчатого каркаса также необходимо [Morgan B., 2016]. В итоге, достижение правильной организации клеток и белков внеклеточного матрикса на месте биодеградируемого сосудистого протеза может способствовать получению стабильного, функционального и зрелого кровеносного сосуда.
В представленной работе было предложено сформировать каркас сосудистого протеза малого диаметра из биосовместимых биодеградируемых полимеров полигидроксибутирата/валерата и поликапролактона с использованием
метода электроспиннинга, позволяющего приблизить структуру поверхности графта к архитектонике естественного внеклеточного матрикса.
Рассмотренные методы биофункционализации трубчатого каркаса нацелены на скорейшее формирование эндотелиального монослоя на внутренней поверхности сосудистого графта и привлечение в толщу стенки графта клеток, способных сформировать полноценную новообразованную ткань посредством дифференцировки в гладкомышечные клетки и синтеза белков внеклеточного матрикса. Подход послойного инкорпорирования в состав биодеградируемого трубчатого каркаса ростовых факторов VEGF, bFGF и хемоаттрактантной молекулы SDF-1a ранее не использовался, однако способен сбалансировать клеточный отклик в процессе формирования in situ элементов новообразованной сосудистой ткани на месте функционально активного биодеградируемого трубчатого каркаса. Таким образом, сосудистый протез малого диаметра с послойным инкорпорированием в состав дифференцировочных молекул может обладать рядом очевидных преимуществ по сравнению с немодифицированными аналогами.
Клиническая потребность в готовом к использованию функционально активном сосудистом протезе малого диаметра покрывает практически все области сердечно-сосудистой хирургии: сердечную хирургию (лечение ишемической болезни сердца), сосудистую хирургию (восстановление кровотока при ишемии нижних конечностей), нейрохирургию (восстановление кровоснабжения при остром нарушении мозгового кровообращения), детскую хирургию (лечение врожденных пороков сердца) и микрохирургию (травмы кистей), военно-полевую сосудистую хирургию. Поэтому разработка методических подходов к созданию функционально активного биодеградируемого сосудистого протеза малого диаметра может стать основой создания сосудистых протезов нового поколения, способных в условиях организма на своей основе стимулировать образование нового сосуда.
Степень разработанности темы исследования
Проведенные в ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных
проблем сердечно-сосудистых заболеваний» (ФГБНУ «НИИ КПССЗ») серии
исследований по разработке технологии изготовления и модификации
биодеградируемых сосудистых протезов малого диаметра показали
принципиальную возможность получения сосудистых протезов, обладающих функциональной активностью. Однако результаты долгосрочной проходимости
сосудистых графтов, содержащих в своем составе одну дифференцировочную
молекулу, указали на ряд проблем, свидетельствовавших о недостаточной
эффективности данного подхода в плане сохранения и стабилизации структур
новообразованной сосудистой ткани, что в совокупности негативно отразилось на
долгосрочной проходимости графтов. Возникла необходимость в придании
отдельным слоям стенки разрабатываемых сосудистых протезов
дифференцированной функциональной активности с целью разграничения
векторов воздействия инкорпорированных биомолекул на различные типы клеток,
привлекаемые в стенку графта из кровотока и окружающих тканей. При этом,
наличие нескольких дифференцировочных факторов в одном изделии может
оказать протективный эффект в плане сохранения уже сформировавшихся тканевых
и клеточных структур. Необходимость получения экспериментального
подтверждения выдвинутых предположений и послужила основанием для выполнения настоящей работы.
Цель исследования
Разработка и модифицирование биодеградируемых протезов кровеносных сосудов малого диаметра с проведением сравнительной оценки эффективности разработанных конструкций в эксперименте.
Задачи исследования
1. Определить состав полимерной композиции, пригодный выступить в
качестве каркаса сосудистого протеза малого диаметра.
2. Разработать технологию изготовления функционально активного
биодеградируемого сосудистого протеза малого диаметра.
3. Выполнить сравнительное исследование физико-механических
свойств, биосовместимости и сроков биодеградации разработанных конструкций in
vitro.
4. В сравнительном аспекте in vivo оценить проходимость и особенности
формирования элементов новообразованной сосудистой ткани на месте
функционально активного биодеградируемого трубчатого каркаса в зависимости от
использованной модификации.
5. Оценить выраженность тканевой воспалительной реакции,
аневризмообразование и кальцификацию стенки протезов в зависимости от наличия
или отсутствия модификации поверхности.
6. Определить тип сосудистого протеза, в наибольшей степени
отвечающего требованиям клиники.
Научная новизна исследования
1. Впервые разработан протокол изготовления биодеградируемого
сосудистого протеза малого диаметра с послойным инкорпорированием в структуру
каркаса ростовых факторов и хемоаттрактантных молекул.
-
Впервые показано, что структура поверхности, физико-механические характеристики, биосовместимость и функциональная активность сосудистых протезов, изготовленных по предложенному протоколу, в наибольшей степени отвечают требованиям, предъявляемым к тканеинженерным сосудистым протезам.
-
Впервые показана роль синергичного влияния дифференцировочных факторов, послойно инкорпорированных в состав биодеградируемых трубчатых каркасов, в обеспечении проходимости сосудистых протезов и ремоделирования элементов новообразованной сосудистой ткани на базе сосудистых протезов с дифференцировочными молекулами, имплантированных на 12 месяцев в сосудистое русло мелких лабораторных животных.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Разработанная технология создания функционально активного
биодеградируемого сосудистого протеза малого диаметра и результаты
тестирования опытных образцов протеза in vitro и in vivo позволяют рекомендовать
сосудистый протез на основе полигидроксибутирата/валерата и поликапролактона
с послойным инкорпорированием в его структуру VEGF, bFGF и SDF-1a к
полноразмерным доклиническим исследованиям с целью определения
возможности дальнейшего использования в клинике в качестве
персонифицированных сосудистых протезов.
Методология и методы исследования
Методологической основой диссертационного исследования явились труды отечественных и зарубежных авторов в области разработок тканеинженерных сосудистых протезов малого диаметра. Для решения поставленных задач использован комплекс физико-химических, микроскопических, культуральных, гистологических, иммуногистохимических и биологических методов исследования:
-
Метод электроспиннинга.
-
Метод сканирующей электронной микроскопии.
-
Метод световой, флуоресцентной и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
-
Культуральные методы исследования.
-
Имплантация опытных образцов сосудистых протезов в брюшную часть аорты крыс по методу «конец в конец».
-
Метод гистологического исследования.
-
Метод иммуногистохимического исследования.
-
Метод иммунофлуоресцентного исследования.
Положения, выносимые на защиту
-
Оптимальной полимерной композицией для изготовления трубчатого каркаса биодеградируемого сосудистого графта малого диаметра по срокам биодеградации, биосовместимым и тромборезистентным свойствам является 5 % раствор полигидроксибутирата/валерата и 10 % раствор поликапролактона в соотношении 1: 2.
-
Сосудистые протезы малого диаметра на основе полигидроксибутирата/валерата и поликапролактона с послойно инкорпорированными в процессе двухфазного электроспиннинга VEGF, bFGF и SDF-1a обладают оптимальными физико-механическими характеристиками и архитектоникой внутренней поверхности, максимально приближенной к структуре естественного внеклеточного матрикса.
-
Ростовые факторы и хемоаттрактантные молекулы, введенные в состав биодеградируемых сосудистых графтов в процессе двухфазного электроспиннинга, сохраняют свою функциональную активность и значимо повышают биосовместимость разработанных конструкций in vitro в сравнении с другими способами модификации поверхности.
-
Послойное введение в состав сосудистых графтов VEGF, bFGF и SDF-1a обеспечивает раннюю эндотелизацию внутренней поверхности и сбалансированное формирование элементов новообразованной сосудистой ткани в стенке графтов, имплантированных в сосудистое русло лабораторных животных.
Степень достоверности и апробация результатов
Достаточное количество экспериментальных наблюдений, дизайн
исследования, использование высокоинформативных и современных методик, комплексный подход к научному анализу с применением современных методов статистической обработки и программного компьютерного обеспечения может
свидетельствовать о высокой достоверности выводов и рекомендаций, сформулированных в диссертационной работе. Выводы, представленные в настоящей работе, не получили критических замечаний и были опубликованы в рецензируемых изданиях.
Апробация работы состоялась 27 апреля 2018 года на заседании проблемной комиссии ФГБНУ «НИИ КПССЗ» в присутствии сотрудников клинических, экспериментальных отделов и лабораторий института.
Основные положения диссертационной работы были представлены и обсуждены на следующих конференциях и симпозиумах: III Всероссийская конференция «Противоречия современной кардиологии: спорные и нерешенные вопросы» (Самара, 2014), XXI Всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2015), 3rd International Conference on Nanotechnology in Medicine (Manchester, UK, 2015), II и III Национальные конгрессы регенеративной медицины (Москва, 2015, 2017), II и III Российские национальные конгрессы с международным участием «Трансплантация и донорство органов» (Москва, 2016, 2017), Международная конференция «Перспективные материалы с иерархической структурой для новых технологий и надежных конструкций (Томск, 2016), BMT-2016 (Basel, Switzerland, 2016), Всероссийская мемориальная конференция с международным участием памяти академика РАМН В.В. Пекарского (Томск, 2017), Всероссийская конференция «Традиции и инновации в кардиологии» (Красноярск, 2017).
Работы, опубликованные по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, из них 21 статья в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных результатов диссертаций, из которых 6 статей опубликованы в зарубежных журналах, 9 работ в журналах, индексируемых в Scopus и Web of Science; 1 монография, 2 патента на изобретение и 3 работы являются материалами конференций.
Объем и структура диссертации
Биодеградируемые полимеры и метод электроспиннинга в создании биодеградируемых сосудистых графтов малого диаметра
На сегодняшний день в сосудистой тканевой инженерии считается перспективным использование биосовместимых и биодеградируемых полимеров в качестве каркаса для создания биоискусственного сосудистого протеза. Среди биодеградируемых полимеров с этой целью наиболее часто используют полигликолевую кислоту (poly (glycolic acid), PGA), полимолочную кислоту (poly (lactic acid), PLA), поли--капролактон (poly(-caprolactone), PCL), полиглицеролсебакат (poly (glycerol sebacate), PGS) и полигидроксиалканоаты (poly (hydroxyalkanoates), РНА) [304], причем сосудистые протезы из этих полимеров или их комбинаций уже проходят фазу тестирования на моделях крупных животных, таких, как овцы и свиньи [247].
Однако у каждого из выше перечисленных полимеров есть свои достоинства и недостатки. Основные свойства, которыми должны обладать изделия для нужд сердечно-сосудистой хирургии, изготавливаемые на основе биодеградируемых полимеров:
- высокая биосовместимость полимеров, возможность выступить в роли носителя клеток (за счет достаточной гидрофильности поверхности носителя и схожести архитектоники его поверхности со структурой естественного внеклеточного матрикса);
- механические свойства, близкие к таковым нативных артерий;
- низкая токсичность продуктов деградации;
- гемосовместимость и атромбогенность;
- низкая иммуногенность и тератогенность;
- скорость биодеградации временного биодеградируемого каркаса in vivo должна соответствовать скорости замещения собственной новообразованной тканью.
В идеале основные характеристики тканеинженерного и нативного сосуда должны совпадать [65, 87, 208].
Важной функцией тканеинженерного сосудистого графта (ТИСГ), интегрированного в кровеносные сосуды, является поддержание нагрузки от кровяного давления и обеспечение циркулирования крови без протекания, что достигается подходящими механическими свойствами и проницаемостью. Экспрессия лигандов для рецепторов клеточной адгезии (интегринов) и кинетика высвобождения биоактивных молекул, инкорпорированных в cостав трубчатых каркасов, должны в разумной степени имитировать окружение нативного ВКМ. Полезно использовать рентабельные и гемосовместимые материалы с регулируемыми свойствами [107]. Хотя точное воспроизведение структуры нативной ткани представляется чрезвычайно затруднительной задачей, поэтому достаточно, чтобы ТИСГ удовлетворял основным критериям [243, 291].
Например, сосудистый протез для имплантации в артериальное русло должен обладать прочностью на разрыв выше 260 кПа, что предотвращает возможность его разрыва на фоне повышения артериального давления [139, 291]. Для физиологического ответа на циклическую нагрузку важна соответствующая эластичность графта [291]. Спроектированный тканеинженерный сосудистый графт должен быть совместим со смежным сосудом реципиента, обеспечивать антитромботический потенциал, минимизировать возможность развития гипертрофии интимы и допускать регенерацию из смежных артериальных тканей [277]. Для изготовления сосудистых протезов in situ используется множество природных и синтетических биодеградируемых полимеров [284]. Природные полимеры обладают высокой биосовместимостью и в организме полностью подвергаются постепенной деградации до нетоксичных веществ, однако они вызывают выраженный иммунный ответ и обладают низкой технологичностью, а их механические свойства далеки от свойств нативных кровеносных сосудов [176, 221, 284].
По сравнению с природными, синтетические биодеградируемые полимеры, как правило, демонстрируют более высокие механические свойства, пригодные для создания сосудистых графтов. Кроме того, такие полимеры могут быть получены в больших количествах, а их производство отличается высокой воспроизводимостью основных характеристик при синтезе различных партий [189, 211]. Биодеградируемые синтетические полимеры обычно не вызывают сильного иммунного ответа, обладают хорошими механическими характеристиками и высокой технологичностью, но их недостатком является низкая биосовместимость, к примеру, отсутствие участков, способствующих клеточной адгезии [284].
В настоящее время комбинирование природных и синтетических полимеров признается оптимальным подходом для выбора биоматериалов с целью изготовления сосудистых графтов, поскольку это позволяет нивелировать недостатки каждого отдельно взятого полимера и обеспечить необходимые свойства конечного изделия и сроки его резорбции в организме [170, 221, 270, 284].
Основным требованием к биодеградируемым каркасам является создание микроструктуры, способной обеспечить структурную поддержку и направленную регенерацию тканей. При этом, процедура изготовления каркаса не должна быть сложной. Метод электроспиннинга является универсальным методом для изготовления нано/микроразмерных волокон, обладающих большим потенциалом к имитации микроархитектоники природного ВКМ [223]. Кроме того, электроспиннинг позволяет менять диаметр нитей как на внутренней, так и на наружной поверхности графтов [141]. Доступны многочисленные обзоры, рассматривающие фундаментальные принципы и использование электроспиннинга, его историческое развитие и различные варианты модификации данной технологии [39, 63, 102, 105, 142, 290, 322]. В процессе электроспиннинга можно смешивать синтетические и природные полимеры, что делает данный метод особенно привлекательным для изготовления ТИСГ. При этом, синтетические полимеры ответственны за высокую прочность и эластичность, а природные полимеры предоставляют лиганды для связывания с интегринами, что способствует адгезии ЭК и их дальнейшей пролиферации. Технология электроспиннинга также предоставляет возможность контролировать и модифицировать состав, диаметр и ориентацию волокон, которые оказывают влияние на размер и распределение пор, что в целом формирует общую архитектонику ТИСГ.
Особое внимание исследователей в области создания ТИСГ из биорезорбируемых полимеров привлечено к поликапролактону - синтетическому полимеру, обладающему высокой эластичностью и прочностью и одобренному в странах Европейского союза и США для медицинского применения. В настоящее время PCL входит в состав многих шовных и стоматологических материалов, а также материалов для тканевой инженерии. Однако спорным является применение поликапролактона в изолированном виде, так как он гидрофобен и обладает малой скоростью гидролиза. Использование PCL в качестве основы для создания сосудистых графтов было изучено в различных форматах: как самостоятельной структуры [79, 78, 194], в виде многослойного покрытия (полигликолевая кислота-поликапролактон-полигликолевая кислота) [180], в форме нанесенного методом электроспиннинга покрытия на каркас из полиглицеролсебаката [329], а также в качестве сополимера с поли (L-лактидом) [252]. Продемонстрировано, что графты из PCL, изготовленные методом электроспиннинга, характеризовались эластичностью, аналогичной нативным артериям. В ходе 18-месячного наблюдения за графтами из PCL, изготовленными методом электроспиннинга и имплантированными в аорту крыс, было выявлено, что в первые 6 месяцев происходит быстрая инфильтрация графта клетками и активная неоваскуляризация, что приводит к формированию организованной сосудистой ткани de novo [79]. При этом, фибробласты и макрофаги, как и в нативных сосудах, располагались в адвентиции, фибробласты дифференцировались в миофибробласты, формируя ВКМ, а макрофаги продуцировали ангиогенные факторы, индуцируя неоваскуляризацию. Однако после 6 месяцев имплантации отмечался четкий регресс в регенерации тканей с уменьшением количества капилляров и фибробластов, появлением кальцификатов и снижением клеточности интимы. Деградация ткани была вызвана исчезновением макрофагов, что привело к снижению неоваскуляризации, приведшей к уменьшению притока кислорода и питательных веществ и сокращению количества миофибробластов. Формирование кальцификатов было связано с процессом хрящевой метаплазии, что инициировалось трансдифференцировкой гладкомышечных клеток (ГМК) в хондроциты в слоях гипертрофии интимы [79]. Таким образом, графты из PCL, разработанные de Valence и коллегами, продемонстрировали недостаточную регенерацию кровеносных сосудов при длительной имплантации in vivo (18 месяцев), что явилось неожиданностью после получения перспективных результатов в предыдущем 6-месячном эксперименте, выполненном E. Pektok и группой исследователей, в котором графты из PCL, изготовленные методом электроспиннинга и имплантированные в брюшную часть аорты крыс на 6 месяцев, показали хорошую проходимость, структурную целостность, быструю эндотелизацию, формирование ВКМ и деградацию полимерных волокон PCL [79, 231]. В 2001 году Shin oka с коллегами выполнил первую трансплантацию ТИСГ четырехлетнему ребенку [269]. В данном случае сосудистый графт состоял полигликолидной сетки с покрытием сополимером 50:50 L-лактида и -капролактона. Предварительно графт был заселен in vitro аутологичными ЭК, выделенными из периферической вены. После 7 месяцев имплантации не было зарегистрировано ни одного случая стеноза графтов. Случаев аневризм также не отмечено.
Особенности взаимодействия с клетками in vitro и сроки биодеградации in vivo пленочных матриксов различного полимерного состава
Наиболее перспективными для создания сосудов малого диаметра являются биодеградируемые полимеры, такие как полиоксиалканоаты и поликапролактон. Отличительная особенность этих полимеров - способность постепенно замещаться новообразованной тканью, претерпевая деградацию и разлагаясь в организме до простейших нетоксичных веществ (в идеале – углекислый газ и вода). На основе данных полимеров создаются шовные материалы, трансплантаты для восстановления хрящевой, костной ткани и кожи [4, 202, 204, 237]. Ведутся разработки по созданию сосудистых протезов [121, 231]. Выбор полимера обусловлен сроком его биодеградации, который должен быть достаточным для завершения регенерации или воссоздания органа. Так, для создания сосудистого графта пригодны гемосовместимые биополимеры, скорость биодеградации которых не должна быть меньше 3 лет. Именно за это время на месте биорезорбируемого сосудистого графта формируются основные структурные элементы нового собственного сосуда. При этом, материал, на основе которого создаются конструкции, предназначенные для имплантации в сосудистое русло, помимо достаточных прочностных характеристик должен обладать высокой гемосовместимостью, биологической совместимостью с клетками и тканями организма, а также низкой токсичностью продуктов собственной резорбции.
Полигидроксиалканоаты (PHA) - линейные полимеры, получаемые микробиологическим путем при бактериальной ферментации сахаров или липидов. В силу особенностей биосинтеза материалов этой группы существует возможность получения широкого спектра значений скорости деградации и механических параметров, что позволяет применять полиоксиалканоаты в различных областях медицинской науки и практики [23]. Биосовместимость PHA основывается на том, что мономер, образующий данный полимер – (R- оксимасляная кислота), является естественным продуктом обмена высших животных и человека и присутствует в крови последних. Концентрация данной оксикислоты в 100 мл крови человека варьирует от 3 до 10 мг. Эту кислоту активно используют в терапевтических целях для восстановления уровня белков в организме, в качестве источника энергии и увлажнения тканей (в глазной хирургии) [151, 153]. При исследовании группы доноров установлено, что PHB содержится в плазме человека, при этом концентрации его варьировала от 0,6 до 18,2 мг/л, причем до 30,0 % от общего пула PHB плазмы связано с липопротеинами и альбумином [246]. Мономерный компонент оксимасляной кислоты является естественным продуктом обмена веществ и присутствует в тканях внутренних органов – в мозге, печени, почках, селезенке, мышцах.
Известны анестезирующий и седативный эффекты данной кислоты, что активно используется в медицинской практике [94, 297]. В ряде экспериментов отечественных ученых была изучена и оценена гемосовместимость PHA. Доказано, что образцы PHA обладали хорошей гемосовместимостью на стадии клеточного ответа [4, 10, 19]. Однако основным недостатком полигидроксиалканоатов является жесткость и хрупкость, что обуславливает необходимость их использования в сочетании с другими полимерами.
В роли пластифицирующего полимера может выступить поликапролактон. Поликапролактон (PCL) - полимер, обладающий малой скоростью гидролиза эфирной связи (от 3 лет и более), поэтому способен обеспечить сохранность биодеградируемого каркаса до того момента, пока на его месте не сформируется собственный новый сосуд. Однако выраженная гидрофобность поликапролактона затрудняет адгезию и пролиферацию клеточных элементов на поверхности тканеинженерных конструкций, изготовленных из чистого PCL. Продукты гидролиза поликапролактона утилизируются макрофагами и глиальными клетками с возможным возникновением воспалительной реакции, однако в случае его совместного использования с более биосовместимыми полимерами эти недостатки можно нивелировать. Способность PCL образовывать прочные и эластичные нити, волокна и пленки связана с большими размерами и характерным линейным цепным строением молекул, что в свою очередь позволяет создавать конструкции пластичные и механически прочные одновременно [3]. В настоящее время существует ряд экспериментальных работ, доказывающих пригодность поликапролактона выступить в качестве основы для создания сосудистых графтов [121].
Свойства полимерных композитов выгодно отличаются от свойств мономеров. Совместное использование полиоксиалканоатов, поликапролактона и прочих биосовместимых и биодеградируемых полимеров создает возможность получения материалов, обладающих новым комплексом свойств, то есть, меняются биосовместимость по отношению к клеткам организма, скорость биодеградации, физико-механические свойства, пористость структуры и связанная с этим кинетика выделения биологически активных веществ. Об успешности работ в данном направлении заявляют многие исследователи, доказывая преимущества сополимерных композиций как тканеинженерных конструкций в целом, так и сосудистых графтов в частности [45, 100].
Поэтому для дальнейших разработок нами были выбраны 2 полимера, использование которых может явиться оптимальным решением при создании полимерного трубчатого каркаса – основы будущего сосудистого графта малого диаметра: поликапролактон и полигидроксибутират/валерат (PHBV).
Использование композиции биодеградируемых полимеров и их молекулярная масса способны значимо изменить сроки биодеградации конечного изделия, изготовленного из данной композиции. Поэтому молекулярная масса полимера и долевое соотношение полимеров в растворе - важные параметры, от которых напрямую зависит срок службы в организме конечного изделия. При разработке биодеградируемых сосудистых протезов, на основе которых с течением времени должен сформироваться собственный новый сосуд, срок резорбции биодеградируемого трубчатого каркаса предположительно должен быть не менее 3-5 лет.
Для изучения биосовместимости in vitro и сроков биодеградации in vivo из комбинации PHBV/PCL были изготовлены 2 разновидности пленочных матриксов (ПМ): ПМ № 1 - композиция 5 % PHBV и 10 % PCL; ПМ № 2 – композиция 7,5 % PHBV и 10 % PCL. Дополнительно в качестве контроля для сравнения клеточной адгезии и жизнеспособности в экспериментах in vitro изготовлен пленочный матрикс из 10,0 % раствора PCL. Изучены адгезия и жизнеспособность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крыс (ММСК КМ) после культивирования на ПМ № 1, ПМ № 2 и PCL в течение 7 суток.
Для изучения скорости биодеградации матриксов PHBV/PCL с различным долевым соотношением PHBV матриксы ПМ № 1 и ПМ № 2 имплантировали подкожно 45 крысам линии Wistar с выведением животных из эксперимента и оценкой гистологической картины через 1, 2, 3, 4 недели в течение первого месяца после имплантации, а затем ежемесячно вплоть до 12 месяцев (n = 3 на точку вывода).
Перед культивированием на матриксах количество жизнеспособных ММСК КМ 4 пассажа составило 99,6 %. При этом, 89,3 % клеток были CD 90+, CD 45–, CD 106-, CD 11b-, что соответствовало общепринятому фенотипу ММСК. Количество клеток на ПМ № 1 и ПМ № 2 через 7 дней культивирования достоверно не различалось между собой и составило 361,3±7,7 кл/мм2 и 404,8±5,5 кл/мм2, соответственно. При этом абсолютное количество ММСК КМ на пленочных матриксах PCL было почти в 4 раза меньше (98,4±36,9 кл/мм2), чем на матриксах с добавлением PHBV (p 0,01).
При оценке жизнеспособности ММСК КМ, культивированных в течение 7 дней на ПМ № 1, ПМ № 2 и PCL, оказалось, что введение PHBV в полимерную композицию способствовало увеличению относительного количества жизнеспособных клеток и сокращению доли клеток, пребывавших в состоянии раннего апоптоза, в 2 и 1,67 раза, соответственно (таблица 1).
Оценка качества модификации и биосовместимости нетканых матриксов, модифицированных RGD- пептидами
Последовательность аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD) представляет собой сайт клеточной адгезии, присутствующий на многих белках ВКМ, и является одним из ключевых лигандов для интегриновых рецепторов, которые отвечают за клеточную жизнеспособность, пролиферацию и дифференцировку [144, 298].
Положительный эффект RGD- пептидов на жизнеспособность клеток на пленках из PCL был впервые показан Gabriel с соавторами [88]. Ковалентная иммобилизация RGD-пептидов на поверхностях PCL привела в 11-кратному повышению адгезии эндотелиальных клеток в сравнении с необработанным PCL [88]. Данные результаты были далее подтверждены на других клеточных линиях [72]. RGD- пептиды улучшали гемосовместимость, инфильтрацию клетками, формирование гладкомышечного слоя и проходимость сосудистых графтов из PCL, изготовленных методом электроспиннинга и имплантированных в сонные артерии кролика на 2 и 4 недели [116]. Эти результаты были далее подтверждены на сосудистых графтах из PCL, изготовленных методом солевого выщелачивания [171]. Более того, было показано, что эндотелизация именно in situ, а не in vitro обеспечивала проходимость графта [171]. Наконец, Pontailler с соавторами показали, что эндотелиальный монослой и непрерывный слой ГМК формируется спустя 6 недель после имплантации на внутренней поверхности сосудистых графтов из поли(3-гидроксибутирата-ко-3-гидроксивалерата-ко-4 гидроксивалерата), модифицированных RGD-пептидами и имплантированных в нижнюю полую вену крыс [239]. В сравнении с белками, биоактивные пептиды более стабильны и имеют более простую структуру. Поэтому модификация RGD пептидами трубчатых каркасов PHBV/PCL была использована нами в качестве эффективного и широко известного подхода модификации полимерных поверхностей с целью последующей сравнительной оценки эффективности данного подхода c оригинальным подходом модификации полимерных графтов PHBV/PCL ростовыми факторами и хемоаттрактантными молекулами, предложенном в настоящем исследовании.
С целью оценки качества модификации поверхности PHBV/PCL пептидами RGD был проведен ряд биохимических и колориметрических тестов, подтверждающих присутствие RGD на поверхности нетканых матриксов. Первичные аминогруппы были доставлены на внутреннюю поверхность графтов PHBV/PCL посредством реакции аминолиза с ЭДА. Обработка оранжем II позволила обнаружить все первичные амины на немодифицированных графтах, после аминолиза и после линкерной реакции с RGD-пептидами. Была выявлена ожидаемая и статистически значимая разница между модифицированными и немодифицированными образцами полимеров. Нингидриновый тест подтвердил тренд к повышению концентрации аминогрупп от немодифицированных к RGD-модифицированным образцам, причем корреляция результатов обоих тестов была значимой и сильной. Таким образом, колориметрические тесты показали внедрение аминогрупп в полимер и позволили провести их количественную оценку (рисунок 35).
Результаты тонкослойной хроматографии продемонстрировали разделение образца на пятно с наиболее высоким и средним значениями коэффициента удержания (Rf), сходными с таковыми для аргинина/аспарагиновой кислоты, что доказало наличие в пептиде на полимерной поверхности именно этих двух аминокислот и подтвердило успешную модификацию RGD-пептидами внутренней поверхности графтов PHBV/PCL.
Известно, что эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) не способны прикрепляться к полимерным поверхностям без фидерного слоя, в роли которого выступают белки ВКМ (фибронектин, коллаген), содержащие сайты для клеточной адгезии. Поэтому именно с использованием данной культуры проводилась оценка активности RGD- пептидов после их карбодиимидного связывания с поверхностью PHBV/PCL. В экспериментах in vitro сравнивали выраженность клеточной адгезии, жизнеспособность и изменение морфологии HUVEC, культивируемых в течение 6 суток на внутренней поверхности нетканых матриксов PHBV/PCL, модифицированных RGD-пептидами. В качестве контрольной группы выступили немодифицированные PHBV/PCL (рисунок 36).
Через 6 суток культивирования выявлено крайне малое количество HUVEC на немодифицированных матриксах PHBV/PCL. В то же время, модификация полимерных поверхностей RGD- пептидами статистически значимо повышала клеточную адгезию и жизнеспособность. Общее число клеток на каркасах PHBV/PCL/RGD было в 9,7 раз выше в сравнении с их аналогами без RGD-пептидов при схожем числе мертвых клеток (рисунок 37).
Таким образом, модификация RGD-пептидами сосудистых графтов PHBV/PCL повышает адгезию и жизнеспособность эндотелиальных клеток, культивируемых на поверхности данных матриксов.
Изучение процессов кальцификации эксплантированных сосудистых графтов
Отложения аморфно-кристаллического кальция в стенке графтов PHBV/PCL диаметром 1,5 мм вне зависимости от наличия или отсутствия модификации начали определяться спустя 3 месяца имплантации. Так, в 46,7 % проходимых графтов PHBV/PCL (7 из 15) под неоинтимой, обнаружены очаги аморфно-кристаллического кальция: от единичных очагов до отложений протяженностью до окружности. При этом, один небольшой очаг выявлен только в 6,7 % (1 из 15), тогда как протяженные отложения от 1/6 до окружности выявлены в 40,0 % графтов (6 из 15). Отложения мелкокристаллического кальция в виде одного мелкого очага, расположенного под неоинтимой, определены в 20,0 % графтов PHBV/PCL/GF mix (3 из 15). В 80,0 % графтов (12 из 15) кальций не обнаружен (рисунок 59).
Чтобы выяснить возможный путь распространения кальцификации по графту, все графты с кальцием дополнительно были поделены на 2 группы: с преимущественным отложением кальция в зоне анастомозов с распространением к центральной части стенки графта и с равномерным отложением Са по всей длине графта, включая анастомозы. Выявлен лишь один графт (6,7 %; 1 из 15) с преимущественным содержанием кальция в зоне анастомоза, тогда как в 40,0 % графтов (6 из 15) распределение Са в графтах носило равномерный характер по всей длине. В оставшихся четырех проходимых (26,7%) и четырех тромбированных (26,7 %) графтах кальций не определялся.
Через 6 месяцев имплантации во всех тромбированных (20,0 % от общего числа; 3 из 15) и в 20,0 % проходимых графтах PHBV/PCL (3 из 15) кальций отсутствовал.
В оставшихся 60,0 % (9 из 15) немодифицированных графтов выявлены отложения кристаллического кальция, который в виде полулунный или округлых очагов распространялся на 1/10 – 1/2 стенки по окружности. При этом, превалирование Са в зоне анастомоза и вокруг шовного материала обнаружено в 13,3 % (2 из 15), а на всем протяжении без особой разницы в зональности – в 46,7 % графтов PHBV/PCL (7 из 15).
В 20,0 % эксплантированных графтов PHBV/PCL/GF mix (3 из 15) кальций не обнаружен. В оставшихся 80,0 % графтов кальцификация стенки и зон анастомозов варьировала по степени выраженности и распространенности: более выраженная кальцификация в зонах анастомозов выявлена в 13,3 % графтов PHBV/PCL/GF mix (2 из 15), причем, с отложением кристаллов Са вокруг шовного материала. В 66,7 % графтов (10 из 15) кальций определен на всем протяжении графтов и в зонах анастомозов. При этом, один небольшой очаг Са в стенке выявлен в 46,7 % графтов (7 из 15), два и более очага, либо распространение кристаллического кальция до 1/8 окружности отмечено в 33,3 % графтов PHBV/PCL/GF mix (5 из 15). Таким образом, через 6 месяцев среди модифицированных превалировали графты с одиночными очагами Са.
При изучении кальцификации графтов PHBV/PCL через 12 месяцев имплантации выявлено, что Са по-прежнему отсутствовал только в тромбированных графтах (рисунок 60).
Во всех проходимых графтах обнаружен крупнокристаллический кальций (Рисунок 49): в 13,3 % графтов (2 из 15) - один большой очаг кристаллического кальция под неоинтимой, в 53,3 % графтов (8 из 15) - отложения кристаллического кальция в виде широкого полулуния от 1/8 до окружности, либо множественными отдельными очагами по всей окружности под неоинтимой. Преимущественное отложение Са в зонах анастомозов выявлено в 26,7 % графтов (4 из 15), в 40,0 % графтов (6 из 15) - большое количество кальция на всем протяжении графтов, включая анастомозы.
Спустя 12 месяцев имплантации кальцификация стенки 26,7 % проходимых графтов PHBV/PCL/GF mix (4 из 15) и 6,67 % графтов PHBV/PCL/GF mix с тромбом (1 из 15) отсутствовала. При этом, в двух проходимых графтах без кальцификации стенки Са обнаружен только вокруг шовного материала в зонах анастомозов (рисунок 61).
В оставшихся 66,7 % проходимых графтах PHBV/PCL/GF mix (10 из 15) обнаружен кристаллический Са, располагавшийся под неоинтимой. Размеры и протяженность кальциевых отложений значимо варьировали от единичных незначительных очагов до распространения кальция по всей окружности графтов на всем протяжении: один небольшой очаг – в 26,7 % (4 из 15), с несколькими и сплошными отложениями – в 40,0 % графтов PHBV/PCL/GF mix (6 из 15).
При выполнении послойных срезов в 26,7 % графтов PHBV/PCL/GF mix (4 из 15) выявлена закономерность распространения кальция из зоны анастомозов, где кальциевые отложения были больше по площади, а в процессе распространения к центру графта приобретали вид одиночных небольших очагов, расположенных под неоинтимой. В 40,0 % графтов PHBV/PCL/GF mix определить вектор распространения Са в толщу графта не представлялось возможным: отложения кальция были практически идентичны в разных участках графтов, варьируя по распространенности от одиночных очагов до незначительных отложений аморфного Са по всей окружности графтов.
В ходе эксперимента кальцификация выявлена только в проходимых графтах, имплантированных в сосудистое русло лабораторных животных. Соответственно, кровь, как биологическая среда, насыщенная клетками и кальцием, и сохранный кровоток поддерживали и/или провоцировали развитие процессов кальцификации, на что указало отсутствие кальциевых отложений в тромбированных немодифицированных и модифицированных графтах PHBV/PCL, имплантированных на разные сроки.
Чтобы подтвердить предположение о главенствующей роли крови, как биологической среды, и кровотока, способного оказывать механотрансдукцию, в пусковых механизмах развития кальцификации протезов после имплантации в сосудистое русло были проведены дополнительные исследования на предмет обнаружения кальция в образцах нетканых матриксов, имплантированных подкожно сроком на 12 месяцев. Для этого выполнено дополнительное исследование на кальцификацию эксплантированных образцов нетканых матриксов PHBV/PCL с инкорпорированными VEGF, или bFGF, или SDF-1a, имплантированных подкожно (рисунок 62).
Также для оценки возможного влияния варианта модификации биодеградируемых сосудистых графтов на их кальцификацию, срезы сосудистых графтов диаметром 2 мм PHBV/PCL/VEGF, PHBV/PCL/bFGF, PHBV/PCL/SDF-1a и сроком имплантации 12 месяцев были дополнительно окрашены ализариновым красным и Dapi и подвергнуты флуоресцентной микроскопии (рисунок 63).
Выявлено, что отложения кальция отсутствовали в образцах нетканых матриксов, имплантированных подкожно сроком на 12 месяцев. Во всех эксплантированных образцах сосудистых графтов PHBV/PCL диаметром 2 мм вне зависимости от варианта модификации выявлены кристаллы кальция, располагавшиеся под неоинтимой и вокруг шовного материала.
Процесс патологической кальцификации мягких тканей организма заключается в формировании трудно растворимых фосфатов кальция [233, 319]. В составе патологических кальцификатов выделяют несколько форм фосфатов кальция, различающиеся соотношением Са/Р: гидроксиапатит (ГАП) с соотношением 1,67, кальций дефицитный (нестехиометрический) гидроксилапатит (нГАП) - 1,5-1,67, дикальциевый фосфат дигидрат (ДКФД) - 1, октакальциевый фосфат (ОКФ) - 1,33 и аморфный фосфат кальция (АФК) - 1,2-2,2 ГАП является наиболее стабильной, не способной к гидролизу формой фосфата кальция при физиологической рН-7,4. В свою очередь, для аморфного фосфата кальция характерно спонтанное образование и гидролиз под действием регуляторов фосфорно-кальциевого обмена [312]. АФК, ДКФД и ОКФ относят к предшественникам ГАП. При определенных условиях АФК трансформируется в ДКФД, с возможностью обратного гидролиза в АФК. Подобные переходы возможны и для ДКФД с ОКФ. Завершающим и необратимым этапом является трансформация ОКФ в ГАП [140, 233].