Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления об особенностях этиопатогенеза глаукомной оптической нейропатии и методах предупреждения еенеуклонного прогрессирования (обзор литературы) 10
1.1. Проблема первичной открытоугольной глаукомы на современном этапе 10
1.2. Молекулярные механизмы гибели ганглиозных клеток сетчатки при глаукоме, морфология, модуляторы апоптоза 14
1.3. Нейротрофические факторы
1.3.1. Защитные и восстановительные свойства NGF 23
1.3.2. Защитные и восстановительные свойства BDNF 25
1.4. Современные методы лечения нейродегенеративных заболеваний 27
1.4.1. Генная терапия 27
1.4.2. Клеточная терапия как альтернатива фармакологической нейропротекции 28
1.4.3. Экзогенная стимуляция мультипотентных мезенхимальных стволовых
клеток 31
1.5. Ниша стволовых клеток 33
Глава 2. Материалы и методы исследований 35
2.1. Первый этап. Выделение и культивирование ММСК лимба 36
2.1.1. Характеристика использованного донорского материала 36
2.1.2. 2D субкультивирование ММСК лимба 40
2.1.3. Проведение проточной цитофлуориметрии 41
2.2. Второй этап. Стимуляция 2D культуры ММСК лимба 43
2.2.1. Иммуноцитохимическое исследование первичной культуры ММСК 44
2.3. Третий этап. 3D культивирование 46
2.4. Четвертый этап. Определение количественного содержания нейротрофинов в культуральной среде ММСК лимба глаза человека
2.4.1. Определение количественного содержания BDNF 49
2.4.2. Определение количественного содержания NGF 50
2.5. Пятый этап. Определение иммунофенотипа 3D культуры ММСК лимба 51
2.6. Лабораторные материалы и методы исследования
2.6.1. Нормотермическое культивирование 52
2.6.2. Криоконсервация/дефростация 52
2.6.3. Оценка жизнеспособности клеток 53
2.6.4. Перечень использованного лабораторного оборудования, расходных материалов и инструментов 54
2.7. Методы статистической обработки результатов исследований 58
Глава 3. Результаты экспериментальных исследований 59
3.1. Результаты разработки протокола культивирования ММСК лимба 59
3.1.1. 2D субкультивирование ММСК лимба 68
3.1.2. Иммунофенотипирование 2D культуры клеток
3.2. Проведение индукции 2D культуры ММСК лимба 77
3.3. Результаты 3D культивирования 81
3.4. Секреция нейротрофических факторов BDNF и NGF 3D культурой ММСК лимба 97
3.5. Иммунофенотипические характеристики 3D культуры ММСК лимба 102
Заключение 117
Выводы 128
Практические рекомендации 130
Основные обозначения и сокращения 131
Библиография
- Защитные и восстановительные свойства NGF
- 2D субкультивирование ММСК лимба
- Четвертый этап. Определение количественного содержания нейротрофинов в культуральной среде ММСК лимба глаза человека
- Проведение индукции 2D культуры ММСК лимба
Защитные и восстановительные свойства NGF
Ключевым моментом патогенеза нейродегенеративных заболеваний считается патологический апоптоз. Его роль в патогенезе болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона неоднократно подтверждалась клиническими и экспериментальными данными [177]. Привлечение интереса мировой науки к данному биологическому явлению связано с именем J.F.R. Kerr - австралийского патологоанатома, изучавшего последствия перевязки ветвей воротной вены. Им же и был введен термин «апоптоз» в 1972 году [148].
Под апоптозом сегодня понимают запрограммированную гибель клеток, проявляющуюся в уменьшении размера клетки, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении наружной и цитоплазматической мембран без выхода ее содержимого в окружающую среду [37]. Апоптоз играет жизненно важную роль в процессе онтогенетического развития. Во взрослом организме апоптоз наблюдается в различных типах тканей, где выполняет функцию гомеостатической регуляции. Реализация запрограммированной клеточной гибели имеет место и при различных патологических состояниях, так при апоптозе происходит удаление клеток, выживание которых нежелательно для организма, например, злокачественно трансформированных мутантных клеток или клеток, зараженных вирусом.
В ряде работ было показано, что в основе гибели ГКС при глаукоме также лежит процесс апоптоза [108, 149, 202, 211, 214]. Считается, что таким образом здоровый глаз ежедневно теряет 0,014 % популяции ГКС, ежегодно – 5 тысяч ганглиозных клеток [53, 57, 219]. При глаукоме это количество увеличивается вдвое [55, 187]. Учитывая толщину среза гистологического препарата (3-5 мкм) в норме апоптоз может быть зарегистрирован с вероятностью 0,0006 %, а при глаукоме - 0,0012 % [143, 275].
Апоптоз – многофакторный процесс. На первом этапе (инициаторная фаза) происходит инициация и трансдукция проапоптотического сигнала. В качестве индукторов запрограммированной гибели могут выступать самые различные факторы, например, белковые продукты протоонкогенов, молекулы-лиганды мембранных рецепторов, цитотоксические лекарственные препараты, радиация, вирусы и др. [190].
Несмотря на большой объем исследований, вопрос о пусковых механизмах апоптоза при глаукоме все еще остается открытым. В литературе приводятся данные индукции апоптоза при повышении внутриглазного давления: прямая компрессия аксонов ганглиозных клеток искривленными ламинарными перегородками вследствие повышенного внутриглазного давления вызывает снижение ретроградного аксонального транспорта [151, 158, 196]. Это, в свою очередь, приводит к уменьшению доставки к телу ганглиозной клетки сетчатки нейротрофических факторов. Недостаток последних включает пусковой механизм апоптоза и приводит к программной гибели клеток [107, 152].
К физиологическим факторам, способным запускать апоптоз ГКС, относится также оксид азота (NO) - одна из ключевых сигнальных молекул, регулирующих функции сердечно-сосудистой, нервной и иммунной систем организма. Участие NO в апоптозе рассматривается с двух позиций: оксид азота оказывает прямое повреждающее действие на ДНК; опосредованное действие оксида азота.
Токсический эффект NO проявляется, прежде всего, в ингибировании митохондриальных ферментов, что приводит к снижению выработки АТФ, а также ферментов, участвующих в репликации ДНК [28].
Среди прочих факторов индукции апоптоза при глаукоме следует отметить увеличение концентрации продуктов перекисного окисления липидов, свободных радикалов [6] а также активацию микроглии. Hernandez M. определил астроциты в качестве основных типов клеток, участвующих в апоптозе и показал, что они могут быть активированы повышением ВГД [126]. Yan X. с соавторами показали, что активированные астроциты отвечают за производство матричных металлопротеиназ (ММР), а именно ММР-9 [274]. Так было установлено, что апоптоз нейронов в ЦНС связан с увеличенной экскрецией ММР-9 [220, 255].
Вслед за инициаторной фазой апоптоза следует эффекторная, в ходе которой происходит активация каспазной системы клетки. Существует несколько путей развития эффекторной фазы апоптоза, принципиальное отличие которых заключается в механизмах инициации и трансдукции проапоптотического сигнала. В настоящее время описано три пути развития эффекторной фазы апоптоза при глаукоме: митохондриальный, рецепторный и РТ53-опосредованный [4, 10]. Во время эффекторной фазы митохондриального пути апоптоза, как правило, происходит увеличение концентрации Ca2+ в цитоплазме [48]. Основным источником профицита кальциевых ионов в клетке служат межклеточные пространства, матрикс митохондрий и эндоплазматический ретикулум [194]. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция ведет к нарушению проницаемости митохондриальной мембраны, в результате чего происходит свободная миграция различных ионов по обе стороны от нее, что приводит к потере трансмембранного потенциала и расширение пор хондролеммы. Такое состояние мембраны подрывает работу системы сопряжения электронного транспорта и синтеза АТФ, следствием чего является появление супероксид-анионов и свободных радикалов кислорода [51]. Активные и чрезвычайно токсичные формы кислорода способствуют окислению компонентов ДНК и внутренних мембран клетки, ускоряя тем самым гибель клетки [285]. Повышение проницаемости мембран митохондрий и снижение мембранного потенциала приводит к высвобождению белков апоптоза — AIF (апоптоз-индуцирующего фактора), SMAC (вторичный митохондриальный активатор каспаз) и некоторых прокаспаз — из межмембранного пространства. Наряду со специфическими апоптозными белками, в цитоплазму выходит цитохром С, который связывается с SMAC и формирует так называемый апоптозный комплекс, инициирующий активацию каспазного каскада.
Рецепторный путь реализуется через TNF- и Fas-опосредованный механизм. Как было указано выше, при глаукоме происходит активация микроглии, которая ведет к выработке ряда биологически активных факторов, одними из которых являются трансформирующий фактор роста бета (TGF-), эндотелин-1 и TNF- иницирирующий процесс апоптоза [5]. TNF- и Fas запускают каскад реакций, финальным этапом которого является дефрагментация хромосом и гибель клетки [63].
2D субкультивирование ММСК лимба
Уровень нейротрофинов измеряли методом иммуноферментного анализа с использованием наборов "BDNF ELISA Kit", "NGF ELISA Kit" (Almabion) в среде роста контрольных культур мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток и культур после проведения индукции.
Система основана на твердофазной сэндвич-ферментативной иммуносорбентной количественной методике. На первой стадии к носителю с иммобилизированными антителами к цитокинам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе первой инкубации на твердой фазе образуется специфический комплекс антиген-антитело. Носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют биотилинизированные вторые моноклональные антитела, специфично связывающиеся с антигеном. После удаления излишка вторых антител добавляется стрептовидин-пероксидаза (фермент), который взаимодействует с биотилинизированными антителами, завершая образование четырехкомпонентного «сэндвича». Таким образом, на стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизированных и меченых антител, что послужило поводом для широкого распространения в литературе названия «сэндвич» - метод.
После отмывки – удаления несвязавшегося фермента добавляется субстрат, который создает фермент-субстратный комплекс, дающий окрашивание. Интенсивность полученного окрашенного продукта прямо пропорциональна концентрации нейротрофина, присутствующего в пробе.
Для анализа пробы среды роста ММСК каждой группы двукратно отбирали из культуральных флаконов на 5-е, 7-е, 9-е, 11-е, 14-е, 17-е и 21-е сутки культивирования и замораживали при t= -80С.
Для определения количественного содержания нейротрофинов пробы размораживали непосредственно перед измерением.
При измерении уровня нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) в культуральной среде стандартный дифлюентный раствор помещали в ячейки «бланка» (нулевого контроля). Одновременно стандартный калибровочный раствор с концентрацией 31,2 пг/мл - 2000 пг/мл, опытные и контрольные образцы в объеме 0,1 мл помещали в ячейки планшета. Затем планшет накрывали защитной пленкой и инкубировали в течение 90 минут при 37С. После окончания периода инкубации раствор удаляли, промывали ячейки 5 раз промывочным буфером и вытряхивали оставшуюся жидкость из планшета на фильтровальную бумагу. Далее добавляли коньюгат биотина (биотинилизированные антитела к BDNF) во все ячейки, кроме ячеек «бланка», и перемешивали содержимое планшета. Затем планшет вновь накрывали защитной пленкой и инкубировали в течение 60-ти минут при 37С. Далее раствор удаляли и промывали ячейки 5 раз промывочным буфером. После промывания во все пустые ячейки вносили по 0,1 мл рабочего раствора АБП (комплекс авидин-биотин-пероксидаза) и инкубировали 30 минут при 37С. Следующим этапом проводили 5-ти кратное промывание ячеек, после чего вносили раствор ТМБ, кроме ячеек «бланка». Планшет накрывали защитной пленкой и инкубировали в течение 25 минут при 37С. В конце периода инкубации раствор приобретал голубую окраску. Реакцию останавливали добавлением ингибирующего раствора. Сигналом о завершении реакции служило изменение цвета раствора с голубого на желтый. Планшет перемешивали и анализировали на микропланшетном фотометре Anthos» (Anthos labtec Instruments GmbH, Австрия) ( = 450 нм).
При измерении уровня NGF стандартный калибровочный раствор с концентрацией от 0,7 нг/мл до 15 нг/мл, опытные и контрольные пробы помещали в ячейки планшета. Одновременно в ячейки «бланка» помещали стандартный буфер, включенный в состав набора. Планшет накрывали защитной пленкой и инкубировали в течение 30-ти минут при 37С. После инкубации содержимое планшета удаляли, ячейки промывали 5 раз промывочным буфером и вытряхивали остатки раствора на фильтровальную бумагу. Далее во все ячейки добавляли раствор пероксидазного конъюгата, кроме ячеек «бланка» и перемешивали их содержимое. Затем планшет накрывали защитной пленкой и инкубировали в течение 30-ти минут при 37С. Дальнейший анализ совпадал с протоколом для BDNF. 2.5. Пятый этап. Определение иммунофенотипа 3D культуры ММСК лимба
Для иммуноцитохимического исследования отдельно формировали сфероиды в количестве 700-800 штук различной морфологии. Полученные 3D сфероиды изучали на 1-е, 7-е, 14-е, 21-е сутки сфероидогенеза (интактная 3D клеточная культура), а также после проведения неспецифической индукции на 10-е, 14-е и 21-е сутки.
Полученные сфероиды трижды отмывали в растворе PBS, после этого производили фиксацию в 4% растворе параформальдегида в течение 20-ти мин при 4С, затем 3-х кратно отмывали в PBS. Фиксированные клетки 3D культуры инкубировали с первичными антителами к виментину в разведении 1:250, III тубулину – 1:250, Stro-1 –1:100, GFAP –1:250, S100 –1:100, коллагену I типа – 1:100, коллагену V типа –1:100 и коллагену VI типа –1:250 (Abcam, Великобритания) и инкубировали в течение 1 часа. Далее клетки 3-х кратно отмывали в растворе PBS и наносили видоспецифичные вторичные антитела, конъюгированные с флуорохромами AlexaFluor 488, 594 и 647 в разведении 1:250 (Abcam, Великобритания) и инкубировали 1 час при комнатной температуре. После чего сфероиды трехкратно отмывали в PBS, ядра докрашивали флуоресцентным красителем бис-бензимид – Hoechst 33258 (ПанЭко, Россия). Затем полученные сфероиды переносили в специально предназначенную чашку Петри с округлым углублением в центре и анализировали в видимом и ультрафиолетовом световых диапазонах под лазерным конфокальным микроскопом Olympus Fluoview FV10I (Olympus, Япония).
Преимуществами данного метода микроскопии является возможность получения изображения с очень тонкого слоя объекта, т.н. «оптический срез» (slice). На основе серии оптических срезов, можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение, не используя при этом трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов. Современные конфокальные микроскопы обычно имеют несколько фотоприемных каналов, благодаря которым можно получить изображения одновременно в нескольких спектральных областях, т.е. использовать несколько флуорохромов.
Четвертый этап. Определение количественного содержания нейротрофинов в культуральной среде ММСК лимба глаза человека
Из представленной динамики культивирования лимба видно, что на 7-е сутки (рисунок 1) отсутствовала качественная разница в группах сравнения. На 14-е сутки культивирования в группе 2, 3, 5 и 6 изоляция клеток из фрагментов лимба была равнозначной, морфология клеток представлялась идентичной. Однако в группе 1 и 4 отмечался качественно меньший рост клеток (рисунок 2). При дальнейшем культивировании были выявлены значительные различия в 1 и 2 группах. Так на 21-е сутки отмечалось появление округлых, плавающих тел – отделившихся от субстрата клеток (рисунки 3а, 3б, отмечено стрелкой). Данные изменения, возможно, связаны с отсутствием в группе 1 и низким содержанием в группе 2 ЭТС поскольку известно, что в состав сыворотки входят факторы адгезии и вещества, обладающие антитрипсиновой активностью, способствующие прикреплению клеток. Подобные изменения могут свидетельствовать о необходимости замены среды, либо сигнализировать о наличии более серьезной проблемы – неадекватности среды, обусловленной дефицитом питательных веществ. Замена культуральной среды была безрезультатной, наблюдаемые в 1 и 2 группе изменения носили необратимый характер и сохранялись вплоть до 30-х суток культивирования (рисунок 4). В группах 4 и 5, содержащих в качестве основной питательной среды DMEM/F12, но равнозначных по содержанию ЭТС группе 1 и 2 соответственно, подобные изменения не наблюдались.
В группе 3, содержащей MEM и 10 об.% ЭТС на 21-е и 30-е сутки культивирования (рисунки 3г, 4г) отмечался рост клеток с характерной веретеновидной морфологией. Экспансия клеток с подобной морфологией наблюдалась также в группах 4, 5 и 6 (рисунки 3 г-е, 4 г-е).
Для оценки функциональной активности клеток при разработке протокола культивирования ММСК лимба, проводился рутинный морфометрический метод подсчета клеток в камере Горяева на контрольных сроках: 14-е, 21-е и 30-е сутки. Количество полученных клеток, при использовании разных составов сред представлено в таблице 10. Для установления влияния характера питательной среды на функциональную активность клеток провели статистический анализ групп равнозначных по содержанию ЭТС (Таблица 11).
Полученные данные подтвердили результаты динамической микроскопии. По мере увеличения сроков культивирования разница между группами исследования становилась более очевидной. Так, если на 14-е сутки статистически значимых различий выявлено не было, то к концу периода наблюдения (30 сутки) разница была достоверной.
Наибольшая изоляция и экспансия клеток наблюдалась в группе 6, содержащей DMEM/F12 и 10 об.% ЭТС.
Таким образом, ростовая среда на основе DMEM/F12 (1:1) c добавлением 10-% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота позволяла поддерживать рост клеток в культуре с наибольшей пролиферативной активностью.
В дальнейшем культивирование проводилось с использованием данной питательной среды. Полученная культура клеток в условиях 2D культивирования формировала монослой и имели характерную веретеновидную форму.
Одним из признаков ММСК является адгезия к пластику. При переносе фрагментов лимба в культуральный флакон, наблюдалась изоляция отдельных клеток, которые прикреплялись к поверхности культурального сосуда и начинали активно пролиферировать. Появление первых клеток в среднем отмечалась через 14 суток от начала культивирования. На рисунке 5 стрелкой указан участок лимбальной ткани, вокруг которого образуется колония клеток. а – 21-е сутки культивирования; б – 30-е сутки культивирования
Морфологически клетки полученной культуры отличались гетерогенностью. Были отмечены зоны, состоящие из фибробластоподобных и эпителиальных клеток. На рисунке 6 представлено два типа клеток в полученной 2D культуре. Слева хорошо видны вытянутые, веретеновидные клетки – фибробластоподобные. На их фоне, справа, выделяются более мелкие, округлые клетки (указаны стрелкой). Это популяция эпителиальных клеток, сохраняющаяся при культивировании ММСК лимба в небольшом количестве. Рисунок 6. 2D культура клеток, полученная при культивировании аллогенных фрагментов лимба, пассаж 0, отмечается гетерогенность культуры, стрелкой указаны округлые, эпителиоподобные клетки. Световая микроскопия, ув. 100х
При дальнейшем культивировании селективным преимуществом обладали фибробластоподобные клетки (рисунок 7а, б). а – пассаж 2; б – пассаж 4. Отмечается преимущественный рост клеток с «веретенообразной» морфологией Рисунок 7. 2D культура клеток аллогенных фрагментов лимба. Световая микроскопия, ув. 100х
В культуре на протяжении всех полученных пассажей данные фибробластоподобные клетки проявляли способность к миграции и делению, дочерние клетки также обладали «веретенообразной» морфологией, характерной для культивируемых фибробластов.
Культура клеток второго, третьего и четвертого пассажей представляли собой достаточно гомогенную и однородную по морфологии популяцию, что свидетельствовало об оптимальных условиях культивирования, позволяющих удерживать клетки от процессов спонтанной дифференцировки. ММСК – подобные клетки формировали конфлуэнтный монослой через три – пять дней после пассирования. Время культивирования от момента пассирования клеток до достижения культурой стадии конфлуэнта составляло три – пять дней, и было практически одинаковым на всех изученных нами пассажах. При увеличении времени культивирования до 7–10-и суток наблюдалось характерное наслаивание клеток друг на друга. 3.1.2. Иммунофенотипирование 2D культуры клеток
Следующим шагом работы была идентификация выделенных и культивируемых клеток, необходимая для определения и подтверждения статуса ММСК. Для характеристики культур были использованы антитела к следующим клеточным маркерам (Таблица 12).
Маркеры для иммунофенотипического анализа 2D культуры клеток (метод проточной цитометрии) Антиген Характеристика Уровень экспрессии CD13 Аминопептидаза N, экспрессируется моноцитами и коммитированными предшественниками миелоидной линии, стойко экспрессируется ьтор недифференцированными ММСК Позитивный CD14 Маркер моноцитов Негативный CD19 Лимфоцитарный антиген, экспрессируемый на поверхности B-лимфоцитов. Негативный CD34 Гликозилированные трансмембранные белки, характерные только для клеток гемопоэтического ряда Негативный CD44 Рецептор гиалуроновой кислоты, найденный у ММСК Позитивный СD73 Экто-5 -нуклеотидаза, связанная с миграцией ММСК Позитивный CD90 Thy1–гликопротеин, относящийся к суперсемейству иммуноглобулинов, экспрессируется в стволовых клетках лимфатического ряда и фибробластах Позитивный CD 105 Рецептор TGF-II; связывается с атителами к SH-2, Играет сигнальную роль в процессах хондрогенной дифференцировки ММСК Позитивный CD 133 Гематопоэтический/ангиобластный маркер Негативный Полученная культура клеток фрагментов лимба экспрессировала маркеры ММСК, установленные международным комитетом по идентификации мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (Dominici M. et al., 2006): CD44/CD73/CD90/CD105, и не экспрессировала маркеры гемопоэтического и лимфоцитарного ряда (Таблица 13). Кроме того, при пассировании культура ММСК становилась более однородной, так было установлено возрастание количества мезенхимоподобных клеток, экспрессирующих CD90 (c 94,27 до 99,98%), CD73 (с 68,22 до 100% от общего количества клеток в культуре), CD105 (с 82,12 до 87,77% от общего количества клеток в культуре) и не экспрессирующих CD14, CD19, CD34 и CD133.
Проведение индукции 2D культуры ММСК лимба
В последние годы наметился интерес исследователей к использованию нейротрофических факторов, особенно фактора роста нервов (NGF) и нейротрофическому фактору головного мозга (BDNF). Известно, что NGF и BDNF обладают выраженным антиапоптотическим действием. Наличие нейропротекторного эффекта при применении данных факторов было показано в ряде экспериментальных работ на животных моделях нейродегенеративных заболеваний, в том числе при глаукоме [27, 71, 78, 145, 154, 192, 193, 236, 254, 255,]. Однако непосредственное введение нейротрофинов, приводит к их быстрому распаду, что требует многократных инъекций для поддержания нейропротекции. Поиск способа, обеспечивающего длительную и достаточную доставку факторов, до сих пор остается камнем преткновения в современной нейропротекции.
В этой связи особый интерес представляет клеточная терапия. Изучение свойств стволовых/прогениторных клеток костного мозга и прежде всего мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК) позволило установить, что человеческие ММСК способны спонтанно секретировать большой спектр биологически активных веществ, в том числе нейротрофины. Скрининг ДНК ММСК лимба посредством ПЦР выявил их способность секретировать НТФ, а именно NGF и BDNF [90]. Имеются сведения по применению ММСК в животных моделях глаукомы, показавших выраженный нейропротекорный эффект данной методики [141, 179, 281, 289]. В настоящее время существуют единичные сообщения о клиническом применении ММСК у пациентов с ГОН. Согласно имеющимся литературным данным, отмечается выраженный нейропротекторный эффект проводимой терапии [117, 186, 268].
Не так давно было выявлено присутствие ММСК, обеспечивающих процессы физиологической и репаративной регенерации роговицы, в глубоких слоях лимба. Согасно литературным данным уровень секреции НТФ значительно выше у ММСК лимба по сравнению с костномозговыми и жировыми [90].
С точки зрения трансплантации стволовых клеток крайне важным является тот факт, что ММСК являются «иммунопривилегированными» клетками, поскольку не экспрессируют на своей поверхности антигенов главного комплекса гистосовместимости HLA-II [96, 201], что открывает возможности использования аллогенного донорского материала [258].
Другим важным направлением современной нейропротекции является создание протоколов культивирования стволовых клеток, направленных на стимуляцию продукции НТФ. В настоящее время в литературе имеется большое количество протоколов стимуляции ММСК костного мозга [218, 225, 226, 227, 272]. При применении индуцированных клеток ММСК некоторые авторы отмечали более выраженное нейропротекторное воздействие в различных моделях нейродегенеративных заболеваний, в том числе при поражении зрительного нерва [173].
Известно, что стволовые клетки сохраняют свою морфологию и уникальные свойства только в условиях ниши [232, 288]. Одним из способов создания искусственной ниши стволовых клеток является 3D культивирование, однако имеющиеся в литературе работы, связанные с использованием ММСК в лечении нейродегенеративных заболеваний, основаны на применении 2D культур клеток.
Отсутствие в литературе сведений о применении трехмерных клеточных конструкций ММСК в нейропротекторной терапии ГОН, а также отсутствие данных об ндукции трехмерных культур послужило выбором цели данного исследования. Для достижения поставленной цели работа была разделена на 5 этапов соответствующих задачам исследования, которые включали в себя создание протокола культивирования ММСК лимба в различных режимах и средах; проведение стимуляции ММСК лимба и изучение иммунофенотипических характеристик полученных клеток в культуре 2D; разработку протокола сфероидообразования из активированных и интактных ММСК лимба и сравнение их морфологических характеристик; оценку секреции нейротрофических факторов BDNF и NGF активированными и интактными сфероидами в процессе 3D культивирования ММСК лимба; изучение иммунофенотипических характеристик сфероидов из ММСК лимба. Первый этап работы был посвящен созданию оптимального протокола культивирования мультипотентных мезенхимных стволовых клеток лимба.
При проведении 2D культивирования клеток, выделенных из аллогенных фрагментов лимба в различных составах сред, оценивали морфологические особенности полученной культуры, а также подсчитывали количество клеток в контрольные сроки наблюдения. На основании полученных данных делали вывод о наиболее оптимальном составе культуральной среды.
В экспериментальных группах, содержащих DMEM/F12, отмечалась тенденция к планомерному увеличению количества клеток с 14-х к 30-м суткам наблюдения. В присутствии 10 об.% ЭТС пролиферация клеток оказалась статистически достоверно выше (р 0,05), чем в присутствии 2 об.% ЭТС и в группе не содержащей ЭТС. В экспериментальных группах, содержащих MEM, тенденция к увеличению количества клеток, была отмечена лишь в группе содержащей 10 об.% ЭТС, однако была статистически ниже чем в группах содержащих DMEM/F12 (р 0,05). В группе MEM с 2 об.% ЭТС, а также в группе MEM без добавления ЭТС отмечалось отсутствие пролиферации клеток.
Результаты фенотипирования полученной культуры клеток продемонстрировали позитивную реакцию с маркерами ММСК: CD44, CD73, CD90, CD105, что свидетельствовало о принадлежности полученной культуры клеток к ММСК. При пассировании культура становилась более однородной. Так, при сравнении экспрессии маркеров культур 4 и 1 пассажа, было установлено возрастание количества мезенхимоподобных клеток, экспрессирующих CD73 (с 68,22 до 100%) CD90 (c 94,27 до 99,98% от общего количества клеток в культуре), CD105 (с 82,12 до 87,77% от общего количества клеток в культуре) и не экспрессирующих CD14, CD19, CD34 и CD133.