Технология производства сухой формы пробиотика БИОД-5 и его применение при послеродовом эндометрите у коров Акимочкин Алексей Иванович

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы 12

1.1. Послеродовой эндометрит у коров и его влияние на их воспроизводительную функцию 12

1.2. Этиология эндометрита 18

1.3. Терапия коров, больных послеродовым эндометритом 31

1.4. Профилактика эндометрита 54

1.5. Антагонистическая активность некоторых штаммов симбионтных микроорганизмов в отношении условно-патогенной микрофлоры при эндометрите 63

1.6. Применение пробиотиков в животноводстве 68

1.6.1. Определение и классификация пробитиков 68

1.6.2. Применение пробиотиков в лечебной практике 70

1.6.3. Механизм действия пробиотиков 72

1.6.4. Характеристика пробиотиков на основе рода Bacillus 73

1.6.5. Характеристика пробиотика Биод-5 77

1.6.6. Характеристика глубинного способа культивирования микроорганизмов 80

1.7. Применение пробиотиков для профилактики и лечения эндометритов 85

2. Собственные исследования 91

2.1. Материал и методы проведенных исследований 91

2.2. Методика получения сухой формы Биод-5 95

2.2.1. Глубинное культивирование B.subtillis ТПИ 13 и B.licheniformis ШИП 95

2.2.2. Получение концентрированной микробной суспензии бацилл... 108

2.2.3. Лиофильное высушивание препарата Биод-5 112

2.3. Заболеваемость коров послеродовым эндометритом и его влияние на их воспроизводительную способность 119

2.4. Бактериологическое исследование 124

2.5. Микрофлора половых органов клинически здоровых коров 139

2.6. Условно-патогенные микроорганизмы при эндометритах у коров 143

2.7. Антагонистическая активность пробиотика Биод-5 152

2.8. Производственные испытания применения пробиотика Биод-5 при эндометритах у коров 156

2.8.1. Отработка дозы и интервала введения препарата Биод-5 157

2.8.2. Испытание профилактического действия Биод-5 158

2.8.2.1. Профилактика послеродового эндометрита у коров с нормальным отелом 159

2.8.2.2. После оперативного отделения задержавшегося последа 160

2.8.3. Терапевтическая эффективность применения пробиотика Биод-5 161

2.8.4. Результаты морфологических и биохимических исследований крови 163

2.9. Оценка экономической эффективности Биод-5 при гинекологических заболеваниях у коров 166

Обсуждение результатов 168

Выводы 173

Практические предложения 176

Список литературы 177

Приложения 213

• Антагонистическая активность некоторых штаммов симбионтных микроорганизмов в отношении условно-патогенной микрофлоры при эндометрите
• Характеристика глубинного способа культивирования микроорганизмов
• Заболеваемость коров послеродовым эндометритом и его влияние на их воспроизводительную способность
• Терапевтическая эффективность применения пробиотика Биод-5

Введение к работе п»ї

Традиционными лекарственными формами для ветеринарных биологических препаратов-пробиотиков на основе живых бактериальных культур являются, в основном, лиофильно высушенные препараты в ампулах и флаконах. � лишь в ограниченных объемах данные препараты выпускаются в виде порошков, таблеток и свечей.

В то же время известный отечественный и зарубежный опыт производства готовых лекарственных средств (ГЛС) показывает, что сухая лиофилизированная форма препаратов занимает одно из ведущих мест на рынке фармацевтической продукции. К числу преимуществ сухой формы лекарственных препаратов можно отнести следующие: точность дозирования, компактность, удобство упаковки, длительность хранения и возможность целевого применения в растворенном виде. Данная лекарственная форма за счет имеющихся средств применения позволяет ветеринарному персоналу малыми силами обслуживать большое количество животных. �менно поэтому сухая форма препарата является наиболее оптимальной в ветеринарно-санитарной практике.

Процесс получения сухой формы препаратов включает большое количество последовательных операций, начиная с отбора штаммоа, изучения его свойств, приготовления посевного материала, отработки технологии культивирования, концентрирования, смешения и подбора режима сушки со стабилизирующими компонентами. Широкое использование сухих форм препаратов объясняется устойчивостью лекарственной субстанции в ее агрегатном состоянии, физико-механическими свойствами исходной субстанции, а также требованиями, длительной сохранностью к готовой лекарственной формы.

Учитывая отмеченное, представлялось актуальным проведение . исследований, направленных на разработку технологии производства сухой формы пробиотика Биод-5 и оценки его эффективности при послеродовых эндометритах у коров. Одной из важнейших проблем ветеринарной науки и практики в области молочного скотоводства продолжает оставаться проблема сохранения и повышения воспроизводительной функции крупного рогатого скота и связанной с этим молочной и мясной продуктивности. Ее решение сдерживается из-за широкого распространения среди маточного поголовья болезней органов репродуктивной системы, из которых особое место занимают неспецифические воспалительные заболевания матки, в частности, эндометриты, развивающиеся в послеродовой период. Очень часто послеродовые эндометриты принимают массовое распространение в хозяйствах и вызывают длительное или постоянное бесплодие. При этом у коров снижается молочная продуктивность, нарушается воспроизводительная функция, что часто приводит к преждевременной выбраковке молодых высокопродуктивных животных.

Многочисленные и разносторонние исследования отечественных и зарубежных ученых (12-17, 91,92, 102-108, 109-112, 130,131, 143-145, 154-156, 179-191, 219-225, 266-269, 332, 336, 348, 355 и другие) позволили создать теоретическую основу и систему практических приемов борьбы с этим заболеванием.

Однако, несмотря на несомненные достижения современной ветеринарной науки и практики, послеродовые эндометриты продолжают иметь повсеместное распространение, носят массовый характер и остаются главной проблемой в воспроизводстве животных. Согласно имеющимся сообщениям, частота встречаемости данной патологии у крупного рогатого скота составляет от 12 до 60 % и более (60-63, 211), а в крупных хозяйствах достигает 76% от числа отелившихся коров (16, 224). Экономический ущерб в хозяйствах от симптоматического бесплодия на почве эндометрита может быть весьма значительным. �сследованиями установлено, что у переболевших коров увеличивается индекс оплодотворения на 0,64-1,53 и продолжительность бесплодия на 29-42 дня, снижается оплодотворяемость на 17,7-23,3%, выход приплода на 7-11%, и молочная продуктивность на 24% (188).

Развиваются эндометриты, в основном, под влиянием условно-патогенной микрофлоры, попадающей в половые пути как из внешней среды, так и гематогенным и лимфогенным путями до родов или сразу же после них. В настоящее время в акушерско-гинекологической практике широко используют внутриматочные антибактериальные препараты. Так, применение антибиотиков не всегда оказывается эффективным: ни один из них не обладает универсальной способностью подавлять жизнедеятельность всех видов микроорганизмов, вызывающих развитие воспалительных процессов в матке. При этом происходит нарушение микробиоценоза, появляются штаммы микроорганизмов, устойчивые к действию антибиотиков, что отрицательно сказывается на качестве продукции (экологическая безопасность).

Безуспешные попытки контролировать проблему путем чередования схем применения антибиотиков и химиопрепаратов, в том числе нового поколения, не дали желаемого результата, а напротив, усугубили ее. �меющийся опыт применения антибиотиков показал, что в данной ситуации они не обладают должной эффективностью, а штаммы эшерихий, сальмонелл, пастерелл, шигелл, псевдомонад, циркулирующих в хозяйствах, приобрели резистентность к антибиотикам. Высокая вирулентность условно-патогенных микроорганизмов со множественной лекарственной резистентностью, которая выявляется у микроорганизмов, выделяемых в животноводческих хозяйствах, представляет серьезную угрозу не только благополучию крупного рогатого скота промышленного стада, но и здоровью человека.

С учетом отмеченного, проблема профилактики и лечения системных, в том числе гинекологических, заболеваний у животных, причинами которых являются условно-патогенные микроорганизмы, имеет не только экономическое, но и социальное значение. Ужесточение требований к экологической безопасности продукции животноводства заставило ветеринарную медицину мира пересмотреть многие методические подходы к вопросам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болезней, возбудителями которых является условно патогенная микрофлора, и признать необходимость разработки нового поколения экологически безопасных препаратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспечению биологической защиты животных. Наиболее полно этим требованиям могут отвечать пробиотические препараты, в состав которых входят живые бактерии из числа основных представителей нормального биоценоза, такие как лактобациллы, бифидобактерии, непатогенные аэробные спорообразующие бактерии, относящиеся к экзогенной части нормальной микрофлоры различных органов животного и другие. Пробиотические препараты обладают комплексным действием при отсутствии токсичности и побочных эффектов, они не вызывают привыкания микрофлоры. Указанные препараты не оказывают негативного воздействия на качество молока. В современных экономических условиях пробиотики привлекают внимание также сравнительно невысокой стоимостью. Все это открывает возможности для их широкого применения.

Поэтому наиболее перспективным направлением исследований в акушерско-гинекологической практике является разработка методов комплексной терапии, с применением пробиотиков, оказывающих на условно-патогенные и патогенные микроорганизмы бактерицидное действие, противовоспалительное, а также регенерирующее — на слизистую оболочку матки. Наряду с антагонистической активностью ряд пробиотиков обладают иммуномодулирующими, антиаллергическими и антитоксическими свойствами (99, 100, 142).  

Антагонистическая активность некоторых штаммов симбионтных микроорганизмов в отношении условно-патогенной микрофлоры при эндометрите

При остром катаральном и гнойно-катаральном эндометрите было обнаружено в 42% проб E.coli, Proteus vulgaris, Corynebact. pyogenes. Кроме условно-патогенных микроорганизмов в экссудате из матки коров с симптомами острого катарального или гнойно-катарального эндометрита обнаружены грибы рода Candida, Aspergillus, Penicillinum. Максимальное число тех и других было на 7-ой день после отела, минимальное — на 15-21 день (7, 285). При бактериологических исследованиях воспалительного экссудата из матки 46 больных гнойно-катаральным эндометритом коров (185) выделена 131 культура микроорганизмов. Из них патологическими свойствами обладали 38,9% штаммов кишечной и 9,5% сенной палочки; 44,4% коринебактерий; 23,3% стафилококков; 41,7% микрококков; 85,7% протея; 31,2% смешанных культур. Гемолитические свойства имели 41,7% штаммов эшерихий; 71,4% сенной палочки; 100% коринебактерий; 56,7% стафилококков; 50,0% микрококков; 14,3% протея; 62,5% смешанных культур. По мнению автора, в развитии послеродового эндометрита чаще всего участвуют эшерихий, стафилококки, сенная палочка и микрококки, реже - коринебактерий и протей. Однако последние обладали высокими вирулентными свойствами и вызывали тяжелое течение патологического процесса.

Во Франции и Британии эндометриты у коров вызывала условно-патогенная микрофлора, представленная стрептококками - 62%, гноеродными актиномицетами - 26,0%, кишечной палочкой - 12,0%, в виде монокультур и в различных ассоциациях (319). По данным исследований, 65% коров после отела поражаются коринебактериями, стрептококками, стафилококками и эшерихиями (380). Также сообщают о выделении от больных коров: Corynebact.pyogenes, E.coli, Proteus mirabilis, Proteus sp., Bacteroides melaninogenicus, Citobacter kosen, Klebsiella aerogenes, Klebsiella oxytoca, Clostridium sp., Fusobacterium vanium, F.necroforum, Enterobacter cloacae, Bac.fragilis, Micrococcus sp (362), Actinomyces pyogenes (316), золотистого стрептококка (315). В результате исследований из патологического секрета матки больных эндометритом коров выделили микроорганизмы, которые по биологическим свойствам были отнесены к родам Escherichia (31,3%), Bacillus (31,3%), Staphylococcus (18,7%), Streptococcus (18,7%) (37). Наиболее частыми возбудителями острых послеродовых эндометритов у коров считают кишечную палочку (26,9%), стафилококки (16,8%), стрептококки (16,7%), протей вульгарный (13,4%), диплококки (5,4%), грибы рода кандида (7,4%), грибы из рода мукор (4,6%), грибы из рода аспергилиюс (3,7%), сальмонеллы (3,2%), синегнойную палочку (1,9%), инфицирующих матку в 34,5% случаев порознь или у 65,5% коров при различных ассоциациях (268).

По мнению некоторых исследователей, в настоящее время недооценивается вирусный этиологический фактор гинекологических заболеваний, в том числе энтеровирусов, вирусов паппиломатоза КРС и парагриппа-3 (106,229).

Также необходимо учитывать благополучие хозяйств по Ку-лихорадке и роль риккетсий в патологии половых органов. В неблагополучных по Ку-лихорадке хозяйствах эндометриты регистрируются у 70-80% отелившихся коров, в благополучных - только у 40%. У коров, зараженных риккетсией Бернера, уже в первые дни после отела авторы выявляли эндометриты, в последующим осложняющиеся золотистым стафилококком (40,0%), стрептококками (36,0%), протеем (67,0%), синегнойной палочкой (13,2%), кишечной палочкой (88,5%), белым стафилококком (16,0%) (195). Немецкие ученые доказали, что причиной заболевания послеродовым эндометритом может служить Chlamydia psittaci (382).

По мнению отдельных исследователей, условно-патогенные микроорганизмы являются хоть и главным, но не единственным фактором, обусловливающим возникновение эндометритов. Так, в опыте не удалось заразить коров условно-патогенными бактериями, при благоприятных условиях кормления и содержания (285). Многочисленными научными исследованиями и практическими наблюдениями установлено, что в условиях хозяйств имеет широкое распространение патология родов и послеродового периода, которая способствует возникновению послеродовых эндометритов у коров (88-90). По данным автора, из учтенных им 5739 коров с задержанием последа переболели эндометритами 47,8%. Из них 20.9% остались бесплодными.

Одной из причин возникновения эндометрита у коров считается низкая сократительная деятельность матки (22). Имеются данные, что эндометриты возникают на почве задержания последа, травм, задержания лохий при выраженной атонии и субинволюции матки, абортов и патологических родов в 65-90,8% случаев (127, 147, 172, 211, 264, 283, 287). Другие исследователи считают основными причинами развития послеродовых эндометритов все акушерские патологии, связанные с родовспоможениями, которые, как правило, сопровождаются травмированием половых путей (293). Также отмечено, что неправильное и несвоевременное лечение при задержании последа и выпадении матки приводит к возникновению эндометрита (66, 67, 153).

По данным зарубежных исследователей (299, 325), острые метриты часто развиваются при затруднительных родах, эмбриотонии, задержаниях последа, дистонии матки, загибе матки, разрывах и ранениях во время акушерских манипуляций. Также выявлена положительная корреляция между субинволюцией матки и развитием эндометритов (381). Помимо этого, другие исследователи в своих работах приводят множество факторов, способствующих развитию эндометрита. Это задержка плаценты, антисанитарное состояние окружающей среды, нарушенный эндокринный баланс (в том числе высокая концентрация простагландина в крови), неправильное кормление, стрессы, гипокальцимия, кетоз, мертворожденные, аборты, атонии и выпадение матки (349).

Характеристика глубинного способа культивирования микроорганизмов

Метод глубинного выращивания микроорганизмов был предложен вначале для культур аэробных грибов, в дальнейшем он стал использоваться для выращивания других микроорганизмов с целью производства антибиотиков, витаминов, ферментов, вакцин, антигенов и других биопрепаратов. Этот метод впервые применили в 1933 году Клюйвер и Пергин как способ встряхивания колб с жидкой средой на качалках с принудительной подачей стерильного воздуха.

Все возрастающее значение получения культур микроорганизмов в больших количествах побудило интерес к созданию промышленных установок большой емкости с принудительной аэрацией культуры,микробов и автоматической регуляцией всех технологических процессов. Такие установки или реакторы назывались еще ферментерами, так как в них выращивались микроорганизмы с использованием их ферментативных свойств при получении антибиотиков, ферментов и других веществ микробного синтеза.

Глубинный метод выращивания в промышленных условиях патогенных микроорганизмов впервые был применен Н.Е.Лебедевым в 1950 году. Внедрение его в промышленное производство явилось большим достижением в микробиологии, давшим возможность получить большое количество бактериальной массы за короткое время. С применением интенсивной аэрации скорость размножения микроорганизмов бывает еще выше. Так, на синтетических средах накопление микроорганизмов бактерий кишечной группы за 14 часов культивирования с применением принудительной аэрации составляет 25 млрд/мл, на мясных средах 50-60 млрд/мл, в то время как при культивировании этих же микробов и на тех же средах без аэрации, то есть в стационарных (состоянии покоя)условиях, количество микробов не превышает 1-2 млрд/мл. такая большая, разница в накоплении биомассы объясняется тем, что при аэрации практически отсутствует начальная стационарная фаза, фаза отрицательного ускорения размножения становится, более продолжительной. В условиях аэрации бактерии сразу начинают интенсивно размножаться, переходя в логарифмическую фазу.

Для выращивания микроорганизмов в промышленных условиях в настоящее время применяют реакторы с барбатерами и металлическими мешалками для дисперигирования воздуха. Размешивание питательной среды и ее аэрацию следует рассматривать как единый процесс , так как равномерно аэрировать всю культуральную жидкость в больших емкостях, не прибегая к размешиванию, невозможно.

Значительный интерес представляет вопрос о связи между интенсивностью потребления кислорода микроорганизмами и его содержанием в среде. Известно, что кислород плохо растворяется в воде. Вода при 20С содержат только 0, 0009% кислорода, при 37С в воде, соприкасающейся с воздухом, содержится 0,0007% кислорода. В связи с этим в питательную среду поступление кислорода должно быть очень интенсивным. Скорость поступления кислорода в любую часть культуральной жидкости должна быть не менее скорости его потребления. В противном случае произойдет местное или временное обеднение среды кислородом, что вызовет повреждение микробных клеток.

На общую скорость потребления кислорода могут влиять количество углеводов, азота, минеральных солей и факторов роста, а также продуктов метаболизма.

Изучение развития бактерий различных групп показало, что в процессе глубинного выращивания имеются существенные различия в степени потребления углеродных и азотистых веществ. Они интенсивно потребляются при аэрации культуральной жидкости, поэтому, чтобы процесс роста и размножения не прекращался быстро, нужно в процессе культивирования дополнительно вводить углеродные и азотистые соединения, а при необходимости и другие стимуляторы роста микроорганизмов. Добавление питательных веществ, особенно углеводных (глюкоза) и биологических стимуляторов, усиливает интенсивность размножения, что и приводит к увеличению концентрации микроорганизмов в момент съема их биомассы.

Одним из факторов, влияющих на интенсивность размножения бактерий, является величина рН среды культивирования. Учитывая отмеченное ее коррекция в процессе выращивания микроорганизмов является обязательной. Глубинный способ культивирования в биопромышленности является основным при производстве большинства, биопрепаратов. Он осуществляется, как правило, в реакторах (ферментерах) большой емкости.

Процесс глубинного выращивания микроорганизмов, в реакторах складывается из следующих этапов: подготовка реактора к посеву; отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними; приготовление матровой культуры для засева питательной среды; посев матровой культуры в реактор с питательной средой для получения производственной расплодки микроорганизмов; выращивание микроорганизмов и контроль, за ходом процесса культивирования.

В технологическом процессе производства микробиологических продуктов одной из основных операций является стадия высушивания, которая в значительной степени определяет качество как исходного готового продукта (биологические и физико-химические свойства), так и препарата в целом, особенно при его хранении.

Живые микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности относятся к числу наиболее сложных гетерогенных объектов сушки, особенности тепло массопереноса в которых обусловлены не только структурно-механическими свойствами материала, но и влиянием комплекса физико-химических и биохимических превращений, сопутствующих процессу сушки (замораживание, удаление влаги, высушивание и т.д.).

Выбор метода тепловой сушки и соответствующее аппаратурное оформление зависит от свойств исходных материалов, которые обычно имеют вид влажной пасты или густой суспензии. К важнейшим свойствам материала, влияющим на выбор метода сушки, относят физико-химические (влажность, плотность, состав), биологические (термоустойчивость, ксеро-чувствительность), структурные и теплофизические свойства (142, 236). В то же время необходимо отметить, что сушка микробиологических продуктов для получения готовой лекарственной формы будет являться только промежуточной стадией, на которой, в первую очередь, должны быть максимально сохранены все биологические свойства нативной культуры, полученной при культивировании. Немаловажными, а, может быть, и первостепенными в отдельных случаях могут являться требования, предъявляемые к сухому продукту с точки зрения его физико-химических параметров, что будет определять характер операции при его последующей переработке (измельчения, смешения и т.д.).

Заболеваемость коров послеродовым эндометритом и его влияние на их воспроизводительную способность

Для бактериологического исследования брали пробы слизи в количестве 2 мл из цервикального канала коров по методике Н.Н. Михайлова с соавт. (1967) в стерильные пробирки и доставляли на кафедру биотехнологии в течение 3-х часов.

Забор проб осуществлялся следующим образом: полистероловую пипетку для искусственного осеменения коров соединяли со шприцем 5 мл с помощью канюли от кровопускательной иглы и резиновой трубки длиной 2 -3 см. В шприц набирали 2 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Влагалище раскрывали зеркалом, снабженным осветителем, пипетку вводили в канал шейки матки на глубину 2- 3 см, впрыскивали раствор и обратно насасывали цервикальную слизь (пипетка при введении в цервикальный канал и выведении из него не должна соприкасаться со слизистой оболочкой влагалища). Над пламенем спиртовки пробу сливали из шприца в пробирку. Пробирки с пробами помещали в термос со льдом и отправляли в лабораторию.

В лаборатории кафедры слизь суспендировали в 0.9% растворе натрия хлорида в соотношении 1:10, из расчета 1 мл слизи и 9 мл раствора.

Из исследуемого материала готовили 3 разведения: 10" , 10" , 10" . Разведения готовили в 3 пробирках. В первую пробирку наливали 9.9 мл 0.9 %-ного раствора натрия хлорида для приготовления разведения 10" . Во вторую и третью пробирки наливали по 4.5 мл 0.9 %-ного раствора натрия хлорида для приготовления разведений 10" и 10" . Из пробирки с разведением 10"1 вносили 0.1 мл суспензии материала в первую пробирку, получая разведение 10 3. Из первой пробирки переносили 0.5 мл суспензии 10" во вторую пробирку, получая разведение 10 , затем 0.5 мл суспензии Ю-5 вносили в третью пробирку, получая разведение 10 7. Схема бактериологического исследования I этап исследований - Приготовление и окрашивание мазка — отпечатка патологического материала. Приготовление разведений исследуемого материала от 10" до 10" . Посев на агаровые питательные среды. Инкубация посевов при температуре 37С 24 - 48 часов. II этап исследований - Количественный учет колоний. Отбор изолированных колоний и посев их на среду Олькельницкого для первичной идентификации микроорганизмов и на скошенный ПА для получения чистой культуры и дальнейшего определения биохимических свойств. Инкубация посевов при температуре 37 С 20-24 часа. Приготовление мазков — отпечатков с каждой отобранной колонии и окрашивание по Грамму или Ожешко для определения морфологических свойств микроорганизмов. III этап исследований - Учет результатов первичной идентификации бактерий. Определение биохимических свойств микроорганизмов постановка реакций с СИБ. IV этап исследований - Заключение о родовой и видовой принадлежности микроорганизмов. Постановка реакции на антибиотикочувствительность диско-диффузионным методом. V этап исследований — Оценка чувствительности к антибактериальным препаратам. Обобщение полученных результатов. Посев материала на питательные среды Для выделения чистой культуры и количественной характеристики аэробной микрофлоры производили дозированный посев, исследуемого материала на селективно-дифференциальные диагностические питательные среды из разведений 10 3, 10 5, 10 7. Для каждого разведения использовали пять чашек Петри. Работу выполняли с соблюдением правил асептики, со сменой пипеток при переходе к каждому новому разведению, каждую взвесь хорошо перемешивали. Перед работой для предотвращения образования конденсационной влаги среды подсушивали при температуре 60С 20 минут. На ПА высевали по 0,5 мл суспензии материала из разведений 10"3 , 10" и 10 с последующим растиранием шпателем. На дифференциально-диагностическую среду Эндо для выделения энтеробактерий высевали по 0,5 мл суспензии материала из разведений 10" 10 и 10" с последующим растиранием шпателем. На селективную среду Плоскирева для выделения сальмонел и шигелл посев производили бактериологической петлей из разведения материала 10" и дозированный посев пипеткой в объеме 0,5 мл из разведения 10" . На висмут-сульфит агар посев производили бактериологической петлей из разведения материала 10" ! и дозированный посев пипеткой в объеме 0,5 мл из разведения 10 3. На 5 %-ный кровяной агар для выявления гемолитических форм микроорганизмов посев суспензии материала проводили в объеме 0,5 мл из разведений 10 3 и 10"7 с последующим растиранием шпателем. Для индикации лактобактерий посев производили из разведения 10" в объеме 0.05 мл на жидкую среду МРС-2. Культивирование лактобактерий происходило в анаэробных условиях. Все посевы инкубировали в термостате при +37С. Для индикации бифидобактерий делали посев суспензии материала в объеме 1 мл из разведения 10" на жидкую среду Блаурокка. При посеве для создания анаэробных условий культивирования бактерий на среде Блаурокка и МРС-2пипетку с микробной взвесью опускали на дно пробирки и осторожно выливали содержимое, стараясь не допускать появления пузырьков воздуха в пробирке. Для сред Плоскирева и Эндо экспозиция составляла 18-24 часа. Для висмут-сульфит агара — 48 часов, для 5 %-ного кровяного агара — 24 и 48 часов; для сред Блаурокка и МРС-2 - 3-4 суток. Рост колоний на ПА учитывали через каждые 24 часа в течение 3-ех суток. Методы высева микроорганизмов При пересеве клеток микроорганизмов с одной среды на другую все манипуляции проводили вблизи пламени горелки, быстро, для предотвращения контаминирования культуры посторонними микроорганизмами. При взятии материала пробирки удерживали в наклонном положении, чтобы гарантировать стерильность культуры. При высеве микроорганизмов способом «посев штрихом» на плотную скошенную питательную среду бактериологической петлёй с культурой по поверхности среды проводили прямую или волнообразную черту (лёгким движением, не разрезая среды).

Если культуру высевали способом «посев уколом», то в столбик питательной среды иглу или петлю с культурой вводили в центральную часть, в толщу среды до дна пробирки.

Посев из жидкой среды производили дозированно пипеткой. Пробирки держали, слегка наклонив, чтобы их края и пробки оставались сухими. Перед тем как закрыть пробирки, пробки и края пробирок обжигали в пламени горелки. При посеве на плотные питательные среды посевной материал по их поверхности после растирали шпателем. В жидкой среде петлю несколько раз ополаскивали.

Терапевтическая эффективность применения пробиотика Биод-5

Интенсификация технологических процессов в молочном скотоводстве, без которой невозможен рост рентабельности отрасли до настоящего времени имеет широкое распространение акушерско-гинекологических заболеваний, в частности, послеродовые эндометриты у коров.

Эндометриты у молочных коров являются одной из основных причин симптоматического бесплодия, способствующего недополучению приплода и росту производства молока. За последние годы проведено много важных научно-практических исследований, касающихся разработки более эффективных средств и методов для профилактики и лечения эндометритов, однако существенного снижения заболеваемости не достигнуто.

Несмотря на успехи различных методов фармакотерапии имеют место и ее побочные результаты как резкий рост в природе резистентных штаммов микроорганизмов, так и нарушение нормальной микрофлоры организма, не высокая лечебно-профилактическая эффективность ограниченного антимикробного действия и угнетения защитных сил организма, в частности, реактивности отдельных органов (матки и др.) и в целом иммунной системы животных.

В связи с этим большой практический интерес представляет изыскание наиболее эффективных методов и лекарственных средств, обладающих комплексным антимикробным действием, одновременно несколькими позитивными свойствами саногенеза, отсутствием токсичности и побочных эффектов, не снижающих качество молока. Всем этим требованиям можно считать удовлетворяют препараты из группы пробиотиков.

На первом этапе работы нами были проведены исследования по изучению микрофлоры матки клинически здоровых коров. В результате исследования 15 проб цервикальной слизи, взятых от клинически здоровых коров на разных сроках стельности и послеродового периода, были выявлены микроорганизмы рода Bacillus subtilis в 10 пробах, что составляет 66,7% от их общего количества. Микроорганизмы вида Bacillus subtilis были представлены в цервикальной слизи и их присутствие не зависело от физиологического состояния коровы.

Полученные данные согласовываются с данными Beller (1925), К.П.Чепурова (1950), И.Ф.Заянчковского (1957), Н.В.Румянцева (1958), А.К.Сеглиня (1971), И.Н.Зюбина, М.Ф.Зюбиной (1982), D.E.Noakes (1982), (1983), B.L.Williams et all (1988), Д.В.Губанова (2000), которые сообщают о выделении различных микроорганизмов, в том числе и Bacillus subtilis из маточной слизи здоровых коров. Однако большинство указанных авторов считают, что это явление обусловлено случайным обсеменением матки и цервикального канала в процессе родов.

Проведенное нами исследование позволяет сделать вывод, что Bacillus subtilis является симбионтным микроорганизмом цервикального канала у большинства клинически здоровых коров. В связи с этим возникла необходимость изучения антагонистических свойств препарата Биод-5 по отношению к условно-патогенным микроорганизмам при эндометритах. С этой целью было проведено исследование микрофлоры матки коров, больных клинической формой эндометрита для выделения штаммов условно-патогенных микроорганизмов. В результате исследования 10 проб биоматериала были выделены следующие микроорганизмы (в порядке убывания частоты встречаемости): E.coli, Lactobacillus, Proteus vulgaris, Klebsiella pheumonae, Staph.aureus, Str.faeccalis, Bacterius enteriditis, Str.vaginitis, Proteus mirabilis, Enterobacter, Acidobacter vaginalis (палочка Додерлейна), Str.mastitidis, Salmonella. Указанные микроорганизмы в 100% исследованных проб были представлены в виде ассоциаций нескольких аэробных микроорганизмов. Морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические свойства выделенных микроорганизмов в целом не отличались от свойств описанных в литературе штаммов, однако свойства значительно различались у разных штаммов в пределах одного и того же вида. Полученные данные согласовываются с сообщениями Н.Ф.Мышкина (1943), П.А.Волоскова (1950), (1965), Marbach R. (1955), Benesch (1957), Я.Г.Губаревича, А.С.Терещенкова (1969), Н.Н.Михайлова и соавт. (1970), Н.Н.Михайлова, Б.Муртазина (1971), А.К.Сеглиня (1971), Archibald J. et all (1973), Н.Н.Михайлова (1976), Н.Н.Михайлова, ИЛ.Чистякова (1978), И.Н.Зюбина, М.Ф.Зюбиной (1982), K.N.Bretzlaff et all (1982), D.E.Noakes et all (1989), Б.Муртазина, Г.С.Пулатова (1995), Д.В.Губанова (2000) и др. Полученные нами штаммы патологических микроорганизмов были использованы для изучения антагонистической активности препарата Биод-5. Результаты исследования позволили сделать вывод, что препарат Биод-5 по силе своего антагонистического действия на патогенные микроорганизмы приближается к действию наиболее активных антибиотиков. Проведенные исследования специфической активности Биод — 5, проведенные in vitro, показали, что препарат высокоэффективен в отношении широкого круга патогенных и потенциально-патогенных микроорганизмов, вызывающих развитие эндометритов. Таким образом, активность Биод - 5 in vitro в отношении перечисленных бактерий полностью коррелирует с высокой эффективностью препарата in vivo, что подтверждается данными микробиологических исследований материала от больных животных. Результаты исследования согласуются также с данными З.А.Ваксмана (1947), Б.Е.Айзенмана (1973), В.И.Никитенко (1991), П.И.Жданова (1994), В.В.Подберезного и соавт. (1996) об исключительно высоких антагонистических свойствах Bacillus subtilis.

Одновременно была исследована антибиотикочувствительность препарата Биод-5 и условно-патогенных микроорганизмов. При этом установлено, что чувствительность различных штаммов к антибиотикам в пределах одного и того же вида существенно различается.

Похожие диссертации на Технология производства сухой формы пробиотика БИОД-5 и его применение при послеродовом эндометрите у коров

Разработка и усовершенствование методов фармакопрофилактики и терапии послеродового эндометрита у коров с применением экологически безопасных препаратовКремнёв Олег Владимирович

Разработка и применение новых лечебных препаратов при эндометритах, маститах коров и желудочно-кишечных заболеваниях телятБуланкин, Алексей Леонтьевич

Применение озонированного оливкового масла при послеродовом эндометрите у коров-первотелокЧучалин Сергей Федорович

Применение сапропелей для диагностики, лечения и профилактики эндометритов у коров Василькова Юлия Владимировна

Применение электромагнитного поля УВЧ для терапии и профилактики эндометрита у коровИноземцев, Валерий Павлович

Применение синтетического биокорректора тимогена при лечении коров с острым послеродовым эндометритомЖукова Елена Станиславовна

Применение биосана СВ и биогеля 10 при лечении коров, больных послеродовым эндометритомФилатов, Андрей Викторович

Применение низкоинтенсивного лазерного излучения для профилактики и лечения острого послеродового эндометрита у коровГрига Эдуард Эдуардович

Применение дипровита и липамида для профилактики задержания последа и послеродового эндометрита у коровСапожков, Владимир Семенович

Применение озонированного изотонического раствора натрия хлорида при профилактике и терапии послеродового эндометрита у коровПлетенев Николай Владимирович