Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1.Биологическая активность фуразано- и фуроксаносодержащих соединений 10
1.2. Акарицидные препараты 16
1.3.Антифунгальные препараты 19
2. Собственные исследования 22
2.1.Материал и методы исследований 22
2.2.Результаты исследований 27
2.2.1. Физико-химические свойства замещенных бензодифуразана 27
2.2.1.1. Физические свойства замещенных бензодифуразана 27
2.2.1.1. Химические свойства бензодифуразанов 31
2.2.2.Биологическая активность замещенных бензодифуразана 33
2.2.2.1.Оценка антибактериальной активности замещенных бензодифуразана 34
2.2.2.2. Оценка антимикотической активности замещенных бензодифуразана 40
2.2.2.3.Оценка акарицидной активности замещенных бензодифуразана 44
2.2.3.Определение параметров острой токсичности некоторых замещенных бензодифуразана 48
2.2.4.Определение раздражающего действия замещенных бензодифуразана 54
2.2.5.Определение кумулятивных свойств бензодифуразана
и хлофузана 59
2.2.6.Определение аллергенных свойств хлофузана 67
2.2.7.Изучение отдаленных последствий действия хлофузана 68
2.2.7.1. Изучение мутагенной активности хлофузана 68
2.2.7.2.Выявление эмбриотоксического действия хлофузана 71
2.2.8.Изучение влияния хлофузана на клинический статус, гематологический и биохимический состав крови животных 79
2.2.8.1. Изучение влияния хлофузана на гематологическийи биохимический состав крови 83
2.2.8.2. Патоморфологические изменения в органах и тканях белых крыс при длительном применении хлофузана 84
2.2.9.Разработка лекарственных форм и изучение терапевтической эффективности хлофузана при кожных болезнях животных 87
2.2.9.1.Изучение растворимости хлофузана 87
2.2.9.2.Разработка лекарственных форм хлофузана 89
2.2.9.3.Терапевтическая эффективность хлофузана при псороптозе кроликов 90
2.2.9.4.Терапевтическая эффективность хлофузана приотодектозе плотоядных 91
2.2.9.5.Терапевтическая эффективность хлофузана примикроспории кошек 92
III.Обсуждение результатов исследований 96
IV.Выводы 102
V.Практические предложения 104
VI.Список литературы 105
Приложения 131
- Акарицидные препараты
- Физико-химические свойства замещенных бензодифуразана
- Оценка антимикотической активности замещенных бензодифуразана
- Изучение мутагенной активности хлофузана
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время одной из актуальных проблем ветеринарии и медицины является широкое распространение кожных заболеваний микотической и саркоптоидозной этиологии (В.В. Дроздов, 1997; М.В. Шустрова, В.А. Арестов, 1999; Л.Н. Скосырских, О.В. Полянская, 1999; А.И. Ятусевич, 1999; Т.В. Соколова, 2001; СМ. Федоров, М.Н. Шеклакова, 2001 и др.). Пораженность акарозами у собак и кошек составляет 32-45% от общего числа больных животных (B.C. Шеховцев, И.А. Машкей и др., 1997; Н.Ф. Фирсов, Г.А. Каратунов, 1999; Л.Н. Скосырских, О.В. Полянская, 1999; Л.Н. Гордиенко, Е.В. Пильщик, 1999 и др.). Пораженность дерматомикозами по отношению к общему поголовью осмотренных животных достигает до 32% (А.М. Титаренко, 2000). Это объясняется целым рядом факторов, такими как, резкое снижение показателей естественной резистентности организма и возникновение иммунодефицитов, развивающихся вследствие нарушения экологического баланса, а также физиологически необоснованного кормления (В.В. Дроздов, 1997; М. Щанкина, Ю. Осийчук, 1999; СМ. Федоров, М.Н. Шеклакова, 2001 и др.).
Несмотря на многообразие лекарственных средств, созданных для борьбы с саркоптоидозами и дерматомикозами, многие из них по различным причинам (высокой токсичности, недостаточной эффективности, дороговизны и другим) не удовлетворяют ветеринарную практику (Ю.А. Нахов, И.Ю. Кутепова, СВ. Ларионов, 2000; Л.Р. Закиева, P.P. Закиев, 2001 и др.). Частое применение препаратов, содержащих антибиотики и другие цитостатики, приводит к образованию устойчивых штаммов возбудителей кожных болезней и развитию вторичных иммунодефицитов.
Поэтому поиск новых эффективных лечебных средств при дерматоми-козах и саркоптоидозах животных является актуальным направлением ветеринарной науки.
Перспективным источником поиска новых фунгицидно-акарицидных препаратов являются замещенные бензодифуразана, а также его фуроксано-производные. По литературным данным некоторые фуроксаносодержащие соединения проявляют выраженную фунгицидную и бактерицидную активность (G. Tappi, P.V.Forri, 1948, 1950, 1951; А.С. Салахова, Л.М Юсупова, И.Ф. Фаляхов и др., 1997, 1999; Т.В. Гарипов, Ж.В. Молодых и др., 2001 и др.). 5,7-дихлор-4-нитро- и 5,7-дихлор-6-нитробензофуроксаны запатентованы как высокоэффективные средства для лечения паразитарных болезней домашних животных (49,112).
Подробное изучение биологической активности и фармако-токсикологических свойств замещенных бензодифуразана позволит выбрать наиболее активные против возбудителей акарозов и дерматомикозов и менее токсичные для животных препараты и рекомендовать их для ветеринарной практики. Кроме того, анализ зависимости биологической активности соединения от его структуры позволит в дальнейшем проводить целенаправленный синтез высокоактивных бактерицидных, фунгицидных и акарицидных соединений.
Цель и задачи исследований. Основная цель исследований — изучение биологической активности, фармако-токсикологических свойств замещенных бензодифуразана и предложение для ветеринарной практики эффективного средства против дерматомикозов и саркоптоидозов животных.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
Изучить физико-химические свойства замещенных бензодифуразана.
Определить биологическую активность замещенных бензодифуразана и выяснить связь между их структурой и активностью, выявить наиболее перспективные соединения.
Определить параметры токсичности, кумулятивные свойства замещенных бензодифуразана, обладающих выраженной биологической
активностью; выбрать наименее токсичное для теплокровных животных соединение.
Изучить влияние наиболее перспективного соединения на клинический статус, гематологический и биохимический состав крови лабораторных животных; определить характер гистоморфологических изменений, возникающих в организме животных после его применения.
Изучить отдаленные последствия действия фуразанопроизводного на организм животных.
Установить лечебную эффективность наиболее перспективного из замещенных бензодифуразана при дерматомикозах и саркоптоидозах животных; разработать лекарственные формы, дозы и схемы его применения.
Научная новизна. Замещенные бензодифуразана — новая группа соединений, обладающих антимикробными, антимикотическими, акарицидны-ми свойствами. Впервые выявлена зависимость их биологической активности от вида и местоположения заместителей в молекуле безодифуразана. Определены параметры токсичности бензодифуразана, хлорбензодифуразана и хлофузана (4- хлор-6,7-фуроксанобензофуразана). Впервые доказано отсутствие отрицательного влияния хлофузана (4- хлор-6,7-фуроксанобензофуразана) на общее состояние, морфо-биохимический состав крови и гистоморфологию тканей животных при однократном и длительном введении; установлено отсутствие отдаленных последствий воздействия препарата на организм (мутагенность, эмбриотоксичность, тератогенность). Разработаны лекарственные формы, дозы и схемы применения хлофузана при дерматомикозах и саркоптоидозах животных.
Практическая ценность. Проведенный в работе анализ зависимости биологической активности фуразанопроизводных соединений от их структу-
ры позволяет проводить синтез, направленный на создание биологически высокоактивных химическиих соединений.
Хлофузан в виде 0,1% спиртового раствора и 0,1% мази эффективен при псороптозе кроликов, отодектозе собак и кошек, дерматомикозах плотоядных.
По результатам исследований разработано «Временное наставление по применению препарата хлофузан при акарозах и дерматомикозах животных» (Утвержденное Главным управлением ветеринарии Кабинета министров Республики Татарстан 2 апреля 2003 г.).
Апробация работы. Материалы диссертации обсуждены и получили положительную оценку на: международной научной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета (Казань, 2000), научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2001), международной конференции ветеринарных фармакологов и токсикологов, посвященной 125-летию Н.А.Сошественского (Казань, 2001), IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов РТ (Казань, 2001), итоговой конференции Республиканского конкурса научных работ среди студентов и аспирантов на соискание премии имени Н.И.Лобачевского (Казань, 2002), научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2002).
Настоящая работа проведена в соответствии с тематикой научных исследований Казанской государственной академии ветеринарной медицины (номер госрегистрации 0.1.98.0002094)
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
замещенные бензодифуразана обладают выраженными антимикробными, фунгицидными, акарицидными свойствами;
бензодифуразан и его производные - хлорбензодифуразан и хлофузан малотоксичны, не обладают кумулятивными свойствами;
хлофузан в рекомендуемых концентрациях и кратности применения не оказывает отрицательного влияния на морфо-биохимический состав крови; не обладает мутагенным и эмбриотоксическим действиями;
хлофузан при наружном применении обеспечивает высокий терапевтический эффект при болезнях кожи микозной и акарозной этиологии.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. Работа иллюстрирована двумя рисунками и содержит 34 таблицы. Список литературы включает 168 отечественных и 87 зарубежных источников.
Акарицидные препараты
Для лечения акарозов животных предложено огромное количество препаратов, по своему составу относящихся к самым разным группам химических веществ.
Одной из таких групп являются хлорорганические соединения. Для лечения чесотки овец и непродуктивных животных предложены гексалин, ака-ризол [5, 106, 111, 139, 147]. Против псороптоза кроликов испытан 5%-ный гексаталп [78, 114]. Линдан в 0,3% концентрации применяется при хориопто-зе коз [254], в виде 1% мази используется при саркоптозах плотоядных с ограниченными поражениями кожи [132].
Большинство хлорорганических соединений являются высокотоксичными, обладают кумулятивными свойствами и недостаточной лечебной эффективностью [254, 255].
Широкое применение получили препараты из группы фосфорорганиче-ских соединений. Карбофос в виде 0,5% эмульсии применяется при саркоп-тозе свиней [111, 112]. На основе диазинона разработаны ушные капли «Барс» для лечения отодектоза плотоядных [69]. Неоцидол [40, 54, 206], не-гувон [206], сульфидофос [2], гудронтрикрезол [28] предложены для лечения псороптоза овец и отодектоза лисиц и песцов, фосмет [8, 38, 90, 208, 246], асунтол (кумафос) [243, 254] - для лечения саркоптоза свиней. Кроме того, при псороптозе овец используется эмульсия тифатола (в 0,03-0,05% по ДВ)
[25], для купания в ваннах применяют диазинон [216, 231, 240], хлорфенвин-фос, пропетамфос [216, 240], эктанон [228], ветиол [6]. Для лечения псороп-тоза крупного рогатого скота рекомендован изофен [136], байтикол [22, 185, 245, 227, 121], хлорацетофос [23], для лечения саркоптоза собак - акарол [193].
Следующей группой акарицидов являются препараты на основе серосодержащих соединений. При псороптозе крупного рогатого скота применяется коллоидная сера [154]. Создан ряд препаратов на основе сероорганиче-ских соединений нефтехимического синтеза (сульфоны и сульфоксиды) [4, 10, 11, 29, 57, 59, 71, 149, 157, 158, 162]. При отодектозе лисиц и песцов рекомендованы полисульфидный линимент [41, 43, 168], метилтиофен [4], при псороптозе крупного рогатого скота - плизон [55, 105, 143, 165, 166, 167]. Высокоэффективным акарицидом является тиофен-кетон (СК50 - 0,007%), но это соединение высокотоксично, что ограничивает его применение в практических целях [88,97,98, 99, 100, 101].
Действующим веществом большого количества препаратов являются соединения из группы синтетических пиретроидов [67, 86, 174]. Механизм действия пиретроидов основан на воздействии на мембраны нервных клеток. Они связываются с липидными структурами мембран, нарушают работу натриевых каналов, в результате чего возникает замедление реполяризации мембраны и паралич паразита [65]. Одним из представителей этой группы является бутокс - препарат на основе дельтаметрина [51], по мнению исследователей он обладает невысокой эффективностью [21, 62, 110, 135]. Для лечения саркоптозов применяется перметрин, который представляет собой 5% концентрат синтетического пиретроида (перметрина), в спирте и касторовом масле [132]. На основе перметрина созданы препараты Ниттифор (0,5 - 0,6% по ДВ), пэкт [153]. Также эффективным средством при саркоптозах является спрегаль - аэрозоль (ДВ- эсдепалетрин) [70, 132, 149]. Па основе ципермет-рина созданы такие препараты как биорекс, который в 0,005% концентрации (по ДВ) эффективен при псороптозе овец [18, 142], цимбуш [68, 113], эмульсия циперметрина (0,05% по ДВ) [126, 197], парасект [229], ципэк [153]. Для лечения псороптоза крупного рогатого скота рекомендован фенвалерат [225, 254], для лечения саркоптоза свиней - стомозан [54, 113,124, 152], псороптоза овец-лепран [104, НО].
Широко применяются препараты на основе авермектинов, получаемых при ферментации почвенного микроорганизма Streptomyces avermitilis. Одним из них является ивермектин [76, 127, 219, 235, 252, 255]. Для лечения саркоптозов применяется ивомек, разработанный на основе ивермектина, в виде подкожных инъекций [3, 63, 64, 123, 171, 234, 236], но применение его противопоказано таким породам собак, как колли, шелти, бобтейлы, грей-хауны [79]. Для наружного применения разработана аверсектиновая мазь, которая эффективна при саркоптоидозах плотоядных [19, 134, 168, 217]. На основе абамектина разработан препарат дуотин (1% раствор по ДВ) [9]. При псороптозе крупного рогатого скота испытаны моксидектин [184, 194, 219, 220, 242], псороптозе овец - дорамектин [68, 176]. На основе дорамектина создан дектомакс-S, применяемый для лечения саркоптоза свиней [239].
Кроме того, для лечения саркоптоидозов животных широко рекомендован амитраз (тактик), относящийся к группе формамидинов [14,16,20, 34, 76, 91, 108, 125, 135, 186, 191, 192, 195, 203,212, 213, 225, 247, 254,255]. Но этот препарат требует осторожного применения, так как он может вызвать гипергликемию (у собак). На основе амитраза созданы такие препараты как амитан (действующие вещества - амитраз и перметрин), ципам (действующие вещества - амитраз и циперметрин), амит (ДВ — амитраз и преднизолон) [33].
Для лечения демодекоза собак в качестве системного средства предложено подкожное или внутривенное введение 2%-го раствора трипановой сини (бензидиновое производное из группы лекарственных красок) на вод ном растворе диметилсульфоксида с натрием гидроцитратом (3%) и новокаином [76]. Для лечения саркоптозов применяется бензилбензоат [42, 44, 45, 70, 135,149].
При ушной чесотке кроликов, песцов и лисиц испытана 5% масляная суспензия гардоны [77]. На основе производных бензофуроксана для лечения отодектоза и дер-матомикозов плотоядных рекомендован нитроксан [116,117,118, 119].
Физико-химические свойства замещенных бензодифуразана
Замещенные бензодифуразана (табл. 1) по внешнему виду представляют собой порошки белого или светло-желтого цвета, нерастворимые в воде, хорошо растворимые в органических растворителях (спирт этиловый, диметил-сульфоксид, толуол, хлороформ и другие). Нуклеофильное замещение
Электроноакцепторный характер фуразанового цикла определяет возможность протекания реакции нуклеофильного замещения. В качестве уходящих групп выступают: атом хлора, метокси- и фениламинная группы.
Так, хлорБДФ при комнатной температуре реагирует с метоксид-ионом, избытком водного аммиака, N-метиламина, диметиламина, диэтиламина, п4иперидина, морфолина и гексаметиленимина [50]:
Метоксигруппа при БДФ-вом базисе становиться подвижной лишь при наличии в соседнем положении нитрогруппы. Реакции метоксинитробензо-дифуразана с анилинами проходят в ДМФА при комнатной температуре. Длительность их зависит от природы заместителя в анилине. Чем более акцепторным является заместитель в анилине, тем медленнее идут взаимодействия, что характерно для реакций нуклеофильного замещения в ароматических и гетероароматических системах.
Наличие нитрогруппы в структуре фениламинонитроБДФ-на позволяет заменять фениламинную группу на аминную с 30%-ным выходом Электрофильное замещение
Точно также как суммарная электроноакцепторность двух фуразановых циклов предопределяет возможность реакций нуклеофильного замещения в ряду БДФ-на, в этой же мере она затрудняет реакции электрофильного замещения. Так БДФ и хлорБДФ не нитруются различными нитрующими средствами (нитрат калия в серной кислоте, САКС, НОКС и 80%-ная азотная кислота) [50].
Замена объемного акцепторного атома хлора на донорную метокси-группу позволяет гладко провести нитрование и бромирование [50]:
Реакция восстановления При действии на БДФ водорода в момент выделения (цинк в соляной кислоте) происходит восстановительное раскрытие одного цикла и образование 4,5-диаминоБФ-на [189]: Оценка антибактериальной активности замещенных бензодифуразана
Антибактериальная активность препарата включает в себя бактериостати-ческое и бактерицидное действие его по отношению к определенным тест микробам. В качестве тест объектов использованы Escherichia coli и Staphylococcus aureus.
Для определения бактериостатического действия препаратов готовили двукратные разведения их в бульоне Хоттингера, предварительно растворив в диметилсульфоксиде (ДМСО). Контролем служили раствор ДМСО в питательной среде и питательная среда без препарата. В пробирки засевали суточные агаровые культуры используемых бактерий (бактериальная нагрузка - 330 000 микробных тел в 1 мл). Пробирки инкубировали в термостате 24 часа при 37С. Минимальной бактериостатической концентрацией (МБСК) считали ту наименьшую концентрацию, которая задерживает рост бактериальных культур.
Результаты изучения бактериостатической активности производных бензодифуразана приведены в таблице 2. В контрольных пробирках регистрировали наличие роста культуры.
МБСК бензодифуразана в отношении золотистого стафилококка составила 0,1% (табл. 2). Его хлорпроизводное обладает аналогичной активностью (соединение №2). Следовательно, замена атома водорода в молекуле на атом хлора не приводит к увеличению антибактериальной активности. Замена атома хлора на алкиламинные группы (метильная, диметильная, пипериди-новая, морфолиновая - соединения №4, 5, 11, 12) снижает антибактериальную активность соединений (МБСК не менее 0,5%).
При замене атома хлора на аминогруппу бактериостатическая активность увеличивается в 2 раза по сравнению с активностью хлорбензодифура-зана (соединения №2 и №3). Включение нитрогруппы в орто-положение к аминогруппе приводит к снижению антибактериальной активности в 5 раз (соединения №3 и №6). Замена атома водорода в первичной аминогруппе фенильным радикалом (соединение №13) не повышает биологическую активность соединения.
Антибактериальная активность повышается до 0,05% при введении в пара-положение фенильного ядра атома хлора, карбоксильной или сульфаниламидной групп (соединения №14, 16, 17), а в случае введения сульфанил-гуанидиновой группы (соединение №15) - до 0,025%. Такая же активность (МБСК - 0,025%) достигается и при замене первичной аминогруппы на ме-токсильную (соединения №6 и №8). Однако, аналогичная замена у аминобен-зодифуразана приводит к противоположному эффекту - значительному снижению бактериостатического действия (соединения 3 и 7). Такое различие, возможно, обусловлено поляризующим влиянием нитрогруппы на двойную связь, что повышает электрофильность углеродного атома (в орто-положении) — вероятного реакционного центра взаимодействия с ферментами или белками бактерий.
Атом брома имеет такое же направление поляризации, тем не менее при замене нитрогруппы на атом брома (соединение №9) бактериостатиче-ская активность значительно снижается (МБСК - 0,5%.). Вероятно, это обусловлено компенсацией поляризующего влияния атома брома эффектами ме-зомерного сопряжения с я-электронами двойной связи.
Гидроксинитробензодифуразан обладает самой высокой бактериоста-тической активностью среди замещенных бензодифуразана. МБСК этого соединения по отношению к St. aureus составляет 0,000156%, по отношению к Е. coli - 0,0003125%. Увеличение антибактериальной активности этого соединения связано с повышением электрофильности углеродного атома при гидроксильной группе, но объяснять столь резкое изменение только этим фактором явно не достаточно. Более важным фактором, по-видимому, является повышенная по сравнению с фенолом кислотность гидроксильной группы, обусловленная сильным совместным влиянием трех электроноакцепто-ров: нитрогруппы и двух фуразановых циклов.
Оценка антимикотической активности замещенных бензодифуразана
Для определения фунгистатического действия замещенных бензодифуразана готовили двукратные разведения препаратов в жидкой среде Сабуро, в которую засевали культуру Aspergillus niger BKMF-1119. Пробирки выдерживали в термостате при 27С в течение 14 суток. Чувствительность к препаратам определяли их минимальной концентрацией (МФСК), при которой рост гриба не наблюдается (табл. 4).Фунгистатическая активность производных фуроксанобензофуразана (табл. 4, соединение №18) значительно выше, чем у дезоксидных замещенных бензодифуразана. Фуроксанобензофуразан задерживает рост Aspergillus niger в 0,05% концентрации. Введение нитрогруппы в орто-положение к фуразану приводит к снижению фунгистатической активности в 2,5 раза (МФСК - 0,125%), введение метоксильной группы - в 5 раз (МФСК - 0,25%). В то же время введение атома хлора в молекулу фуроксанобензофуразана повышает антимикотическую активность в 4 раза (МФСК - 0,0125%).
Таким образом, среди изученных препаратов самой высокой фунгистатической активностью по отношению к Aspergillus niger обладает 4-хлор-6,7-фуроксанобензофуразан (МФСК - 0,0125%). У этого соединения были изучены фунгистатические и фунгицидные свойства по отношению к возбудителям дерматомикозов животных и человека.
Для изучения фунгистатической активности готовили двукратные разведения исследуемого препарата в среде Сабуро, предварительно растворив его в ДМСО. Затем в чашки засевали трехнедельную культуру гриба и инкубировали в термостате 14 суток при 30С. В качестве тест культур были выбраны Tnchophiton rubrum, Trichophiton gipseum и Microsporum lanosum, как наиболее часто встречающиеся возбудители трихофитии и микроспории животных и человека [35].
Микроскопические грибы рода Trichophiton более чувствительны к хлофузану, чем Microsporum lanosum и Aspergillus niger.
Для определения фунгицидной активности хлофузана кусочки среды с трехнедельной тест культурой погружали в растворы препарата на 5, 15, 30 минут, 1, 2 часа. После этого высевали их на свежую питательную среду, предварительно промыв в растворителе (ДМСО) и физиологическом растворе. Чашки после посева инкубировали в т рмостате 30 суток при 30С [4J. Результаты этого эксперимента представлены в таблице 6 задержка роста по времени, гриб незначительно распространяется на среду или растет только на инокулятах; «-» - рост культуры отсутствует, гриб лизируется и исчезает с поверхности инокулятов или остается на них в виде не прорастающей пленки. Следовательно, хлофузан in vitro проявляет стабильную фунгицидную активность при 30 минутной экспозиции. Минимальная фунгицидная концентрация при указанной экспозиции составила для Т. gypseum и Т. rubrum 0,0156%, а для М. lanosum - 0,0625%. Оценка акарицидной активности замещенных бензодифуразана
Для изучения акарицидной активности замещенных бензодифуразана in vitro клещей вида Psoroptes cuniculi подвергали воздействию суспензии исследуемых соединений на стеароксе в различных концентрациях. Наблюдение за клещами вели под микроскопом тотчас же после воздействия препарата и через 10, 30 минут, 1, 2, 4 и 24 часа. Контрольных клещей подвергали воздействию 0,5% раствора эмульгатора. При этом учитывали количество живых и мертвых клещей. Мертвыми считали тех клещей, которые не реагировали на механический и тепловой раздражители. Показателем акарицидной активности является СК5о (табл. 7).
Установлено, что большинство исследованных препаратов обладает выраженным акарицидным действием (табл. 7). Так, СК5о для бензодифуразана составляет 0,01%, его хлорпроизводного - 0,014%. Замена атома хлора на аминогруппу приводит к снижению акарицидной активности в 2 раза (СК5о -0,028%). При введении в молекулу бензодифуразана диметиламинной группы акарицидная активность снижается в 9 раз
Акарицидные свойства фуроксанобензофуразана и его хлорзамещенного на порядок превосходят таковые для соответствующих бензодифуразаниль-ных производных. Так, фуроксанобензофуразан активнее бензодифуразана в 2,8 раза, а 4-хлор-6,7-фуроксанофуразан превосходит акарицидную активность хлорбензодифуразана в 3,14 раза. Что касается метоксильных производных, то здесь наблюдается обратная картина. Метоксибензодифуразан активнее соответствующего фуроксаносодержащего (4-метокси-6,7-фуроксанобензофуразан) в 1,9 раз.
Нитропроизводные бензодифуразана, а также 4-нитро-6,7-фуроксанобензофуразан обладают более слабым акарицидным действием, чем другие исследованные соединения. Исключением является лишь амино-нитробензодифуразан (СК50- 0,17%).
Установлена зависимость времени гибели клещей от концентрации препарата. Так, 4-хлор-6,7-фуроксанобензофуразан (хлофузан) в 0,0125-0,025% концентрации вызывал гибель клещей в течение 10 минут, а в 0,0032-0,0063% концентрации - через 30 минут. После контакта с исследованными веществами клещи сначала теряют способность передвигаться при сохраненной реакции на механический и термический раздражители (в первую очередь поражаются 3-4 пары конечностей, затем 1-2 пары), а затем гибнут.
Таким образом, замещенные бензодифуразана обладают выраженным акарицидным действием. Среди изученных соединений самой высокой ака-рицидной активностью обладают фуроксанобензофуразан (СК5о - 0,0032%) и 4-хлор-6,7-фуроксанобензофуразан (СК50 - 0,0041%).
Подводя итог изучению биологической активности замещенных бензодифуразана, можно констатировать, что среди исследованных соединений выделены пять, которые обладают одновременно выраженным бактериоста-тическим, фунгистатическим и акарицидным действием. Это бензодифура-зан, хлорбензодифуразан, аминобензодифуразан, фуроксанобензофуразан, 4-хлор-6,7-фуроксанобензофуразан.
Изучение мутагенной активности хлофузана
Как известно, целый ряд химических веществ, а также лекарственных препаратов могут вызвать отдаленные нежелательные последствия действия в виде эмбриотоксических, тератогенных [1, 108, 114, 130, 143, 158], бласто-могенных эффектов, а также оказывать цитотоксическое, цитостатическое и мутагенное действие [80, 83, 119, 169, 187, 240]. Чтобы предсказать и предотвратить возможные нежелательные последствия, проведены специальные исследования по изучению мутагенной активности хлофузана, а также по определению его эмбриотоксического и тератогенного действия. Изучение мутагенной активности хлофузана
Мутагенную активность хлофузана, согласно методике, изучали в два этапа. На первом этапе исследований определяли токсичность препарата для используемого штамма Salmonella thiphimurium, а именно минимальную концентрацию, при которой полностью подавляется рост бактерии.
Для изучаемого препарата эта концентрация составила 200 мкг/мл. На втором этапе проводили полуколичественное определение генных мутаций с внесением растворов препарата в слой полужидкого агара с метаболической активацией in vitro. Сущность этого метода заключается в том, что тестовые бактерии, Salmonella thiphimurium, культивируются на специальной среде, на которой могут расти лишь микроорганизмы, у которых произошла мутация от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Без внешних воздействий такие мутации происходят с низкой частотой. Если в среду культивирования ввести химический мутаген, то частота мутаций значительно увеличивается, что регистрируется по числу колоний микроорганизмов, выросших на данной селективной среде.
В селективный полуобогащенный 0,6%-ный агар в количестве 3 мл вносили 0,1 мл бактериальной суспензии, 0,1 мл раствора хлофузана в различных концентрациях, 0,5 мл микросомальной активирующей смеси (МАС) на дистиллированной воде, размешивали содержимое пробирки и выливали его на слой нижнего минимального агара на чашки Петри.
Чашку оставляли при комнатной температуре на 40 минут и после поленого застывания переносили в термостат (37С).
В контроле в слой верхнего агара вместе с суспензией тест бактерий добавляли неполную МАС и 0,1 мл растворителя. В качестве позитивного контроля использовали 0,1 мл раствора нитрозометилмочевины (100 мкг/мл).
Учет результатов проводили через 48 часов инкубации, подсчитывая число колоний ревертантов. Опыт проводили в трех-пятикратной повторносте.
Анализ результатов, отраженных в таблице, позволяет заметить, что при концентрациях хлофузана в минимально-глюкозной среде выше 0,5 мкг/мл наблюдается более низкое число мутантов в сравнении с контролем, что связано с превалированием токсичности препарата. При снижении концентрации число колоний ревертантов начинает расти с пиком при концентрации 0,1 мкг/мл. При дальнейшем снижении концентрации снижается и мутагенная активность. Эта зависимость хорошо прослеживается на графике (рис. 2).Анализ полученных результатов показал, что количество мутаций в опытных и контрольных чашках не различается более чем в 2,5 раза, а следовательно мутагенный эффект не выявлен.
Таким образом, хлофузан на использованной мутационной модели не проявляет мутагенного действия. Изучение эмбриотоксического действия хлофузана
Эмбриотоксические свойства препарата включают в себя эмбриоле-тальное и тератогенное действия его на организм животного.
Согласно методике эмбриотоксическое действие хлофузана определяли в два этапа. На первом этапе исследований выявляли эмбриолетальное и тератогенное действие терапевтической и высшей дозы 0,1% раствора хлофузана в ДМСО на 30 беременных самках белых беспородных крыс. В качестве высшей принимали максимальную дозу, при которой не отмечается гибель и развитие видимых признаков интоксикации животных при длительном введении препарата. Для хлофузана высшая доза составляет 1/25 от установленной ранее LD5o или 64 мг/кг. Терапевтическая доза для различных животных не превышает 1/50 от LD50 или 32 мг/кг.
Крысам четырех опытных групп (по 5 особей в каждой) наносили 0,1% раствор хлофузана накожно. Различным группам животных вводили препарат с 1-го по 6-й день, с 6-го по 16-й день и с 16-го по 19-й день беременности. При этом с 6-го по 16-й день беременности хлофузан наносили в высшей и терапевтической дозах, а в остальные сроки - в высшей дозе.
Крысам 1-й контрольной группы вводили растворитель (ДМСО) в соответствующей дозе, а 2-я группа состояла из интактных беременных самок.
В течение беременности клиническое состояние животных опытных групп не отличалось от таковых контрольной группы. Животные охотно поедали корм, адекватно реагировали на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители. Частота и глубина дыхательных движений, состояние кожного покрова, слизистых оболочек крыс опытных и контрольных групп также не отличались.
Результаты оценивали после эвтаназии и вскрытия самок на 20-й день беременности. При этом подсчитывали количество желтых тел в яичниках, мест имплантации в матке и количество живых, мертвых и резорбированных плодов. Плоды осматривали на наличие кровоизлияний и анатомических аномалий, взвешивали и определяли их кранио-каудальные размеры (табл. 25).
Показателем эмбриолетальности служили пред- и постимплантационная эмбриональная смертность, показателем тератогенности - морфологические (анатомические) пороки развития, а также общая задержка развития плодов.
При анализе результатов таблицы 25 выявлено, что введение 0,1% раствора хлофузана в высшей дозе (64 мг/кг) с шестого по шестнадцатый дни беременности приводит к достоверному снижению (Р 0,001) количества плодов у белых крыс по сравнению с контролем. Масса и кранио-каудальные размеры плодов этой группы также ниже, чем аналогичные показатели у крыс контрольной группы.
Введение раствора хлофузана в высшей дозе в первые шесть дней беременности не оказало отрицательного влияния на рост и развитие плодов. Их количество, а также масса и размеры были даже незначительно выше, чем у крыс контрольной группы (изменение не достоверно). Аналогичная картина наблюдается и при введении хлофузана в высшей дозе в последнюю треть беременности.
