Содержание к диссертации
Введение
РОЗДІЛ 1. Огляд літератури 9
1.1. Вітамін Е і селен у птахівництві (застосування, дози,
джерела в кормах та рекомендовані добавки) 9
1.2. Фармакологічна та токсична дія вітаміну Е і селену на організм тварин і птиці 15
1.3. Антиоксидантна функція вітаміну Е і селену 24
1.4. Біотрансформація вітаміну Е і селену в організмі птиці 27
1.5. Методи визначення вітаміну Е і селену в біологічному матеріалі та кормах 33
1.6. Узагальнення до огляду літератури 39
РОЗДІЛ 2. Матеріали та методи досліджень 42
РОЗДІЛ 3. Результати власних досліджень 49
3.1. Фармакодинаміка альфа-токоферолу ацетату і
селеніту натрію у промислових курей-несучок за умови
тривалого сумісного надходження з кормом 49
3.2. Дослідження токсикокінетики альфа-токоферолу ацетату і селеніту натрію у промислових курей-несучок за умови тривалого сумісного надходження з кормом 63
3.2.1. Розробка методики визначення альфа-токоферолу в
біологічному матеріалі 63
3.2.2. Розподіл альфа-токоферолу в організмі курей-несучок 72
3.2.3. Розподіл селену в організмі курей-несучок 80
3.3. Фармакодинаміка альфа-токоферолу ацетату та селеніту натрію у курей-несучок репродуктивного поголів’я за умови тривалого сумісного надходження з кормом і вивчення змін морфологічної структури печінки та селезінки 89
3.4. Токсикокінетика альфа-токоферолу ацетату і селеніту натрію у курей репродуктивного поголів’я за умови тривалого сумісного надходження з кормом 98
3.4.1. Дослідження розподілу альфа-токоферолу в організмі курей-несучок репродуктивного поголів’я 98
3.4.2. Дослідження розподілу селену в організмі курей-несучок репродуктивного поголів’я 100
3.5. Вивчення ембріотоксичного впливу альфа-токоферолу ацетату і селеніту натрію за умови тривалого надходження їх у надлишкових дозах в організм курей-несучок 104
3.6. Токсикокінетика альфа-токоферолу ацетату і селеніту натрію у добових курчат, отриманих від курей репродуктивного поголів’я, в організм якого надходили різні дози альфа-токоферолу ацетату і селеніту натрію 114
3.6.1. Розподіл альфа-токоферолу в організмі добових курчат 114
3.6.2. Розподіл селену в організмі добових курчат 114
РОЗДІЛ 4. Обговорення результатів досліджень 117
Висновки 131
Список літератури
- Фармакологічна та токсична дія вітаміну Е і селену на організм тварин і птиці
- Методи визначення вітаміну Е і селену в біологічному матеріалі та кормах
- Дослідження токсикокінетики альфа-токоферолу ацетату і селеніту натрію у промислових курей-несучок за умови тривалого сумісного надходження з кормом
- Токсикокінетика альфа-токоферолу ацетату і селеніту натрію у добових курчат, отриманих від курей репродуктивного поголів’я, в організм якого надходили різні дози альфа-токоферолу ацетату і селеніту натрію
Фармакологічна та токсична дія вітаміну Е і селену на організм тварин і птиці
Незважаючи на широке вивчення функцій токоферолу в організмі тварин [22, 69, 70, 71, 72], єдиної теорії біологічної дії вітаміну Е немає. Найбільше поширення отримала антиоксидантна теорія [73], про яку докладніше йтиметься в розділі 1.3. У її основу покладена здатність токоферолу до інгібування вільнорадикальних процесів. З цієї позиції вдається інтерпретувати велику кількість експериментальних фактів. Також доведений антиоксидантний синергізм вітаміну Е і селену [10, 32, 74].
Разом з тим антиоксидантна теорія не дає конкретного механізму дії токоферолу в біологічних мембранах [75, 76, 77], адже вітамін Е може виконувати й інші функції, які не пов язані безпосередньо з інгібуванням процесів ПОЛ. В цьому випадку токоферол неможливо замінити його аналогами або іншими антиоксидантами.
На сьогодні зібрано значний експериментальний матеріал, що свідчить про важливу роль токоферолів у підтримці структурно-функціональної стійкості мембранних утворень клітини. Вітамін Е здатний зв язуватися як зі штучними бішарами, так і з різними біологічними мембранами, в тому числі з мембранами еритроцитів, лізосом, мікросом і т.д. Ця взаємодія призводить до зміни фізико-хімічних властивостей мембран, які проявляються в обмеженні молекулярної рухливості, а також мікров язкості ліпідного бішару, наслідком чого є модифікація пасивної проникності мембран. Виявлено, що додавання токоферолу інгібує Са2+-залежний вихід ферментів і спричиняє фузогенний ефект, сприяючи злиттю еритроцитів, а недостатність токоферолу призводить до підвищення проникності мембран лізосом, що може викликати аутоліз клітини [78, 79, 80, 81]. Дія токоферолу на структуру і функції ліпідного бішару може бути опосередкована трьома різними механізмами: безпосереднім впливом на структуру та фізичні властивості ліпідів мембрани, регуляцією ПОЛ у мембранах, а також взаємодією з вільними жирними кислотами і лізофосфоліпідами – продуктами гідролізу ліпідів фосфоліпазами, які здатні модифікувати структуру мембран [82, 83].
Вплив вітаміну Е на функції природних мембран зумовлений його взаємодією не тільки з ліпідами, але й з білками мембран [84], в тому числі з токоферолзв язуючими білками (ТЗБ).
Етінгоф Р.Н. [85] припускає, що ділянки з неспецифічним зв язуванням вітаміну Е також можуть приймати участь у процесах його функціонування, впливаючи на транспорт та катаболізм даної речовини.
Вплив токоферолу на функції клітини зумовлений його взаємодією не тільки з плазматичними мембранами, а й з іншими органелами клітини, що також містять ТЗБ, зв язуючись з якими цей вітамін може виконувати свої функції. Однією з клітинних органел, з якою токоферол може взаємодіяти специфічно є ядро. Вітамін Е в комплексі з ядерними ТЗБ може приймати участь у процесах функціонування клітинного ядра, зокрема, впливати на процеси реалізації генетичної інформації [81].
Виявлено вплив токоферолу на синтез РНК в цілому організмі при перфузії серця, а також у гомогенаті печінки [75]. Додавання цього вітаміну значно зменшує синтез РНК і білку в епітеліальних ракових клітинах [86]. Токоферол може впливати і на експресію окремих генів, зокрема, генів гладком язових клітин і моноцитів (макрофагів), -токоферол транспортних білків, -тропоміозину, фактору росту сполучної тканини, -1 колагену печінки, колагенази фібробластів шкіри людини, трансформуючого фактору росту -1, а токоферол-сукцинат може модулювати експресію генів c-myc, N-myc, H-ras i c-jun [75, 76, 87, 88, 89].
Відомо, що 30-40 % введеного in vivo токоферолу надходить у мітохондрії, справляючи стабілізуючий вплив на їх структуру і функції [69, 77, 78]. Вплив вітаміну Е на функціонування мітохондрій в значній мірі зумовлений його здатністю виступати в якості антиоксиданту, роль якого в мітохондріях особливо велика у зв язку з тим, що ці органели відрізняються достатньо високою інтенсивністю процесів ПОЛ і є одним із основних місць метаболізму кисню у клітині [92].
Очевидно, механізми функціонування токоферолу у складі мітохондрій можуть бути пов язані не тільки з його впливом на енергетичний обмін і мембрани мітохондрій. Цей вітамін, як у випадку з клітинним ядром, може взаємодіяти з геномом мітохондрій і впливати на молекулярно-генетичні процеси, що відбуваються в органелах.
Дефіцит вітаміну Е в раціоні щурів призводить до підвищення індексу ненасиченості жирних кислот у фосфоліпідах мембран легень [93]. Вітамін Е регулює співвідношення між вмістом арахідонової і лінолевої кислот у ліпідах та вміст простагландинів у плазмі крові щурів при підвищеному вмісті лінолевої кислоти в раціоні [94]. Про важливу роль у регуляції обміну ліпідів у організмі людини і тварин свідчить встановлений у дослідах на щурах нормалізуючий вплив активного метаболіту вітаміну Е – 2-(4-метил-3-пентеніл)-6-ацетоксі-2,5,7,8-тетраметилхромана (-ТФА-С6) на нормалізацію in vitro та in vivo вмісту холестеролу і фосфоліпідів та активності ферментів антиоксидантного захисту – супероксиддисмутази, каталази і глутатіон- редуктази в плазматичних мембранах кардіоцитів при гіперхолестеринемії [10].
Методи визначення вітаміну Е і селену в біологічному матеріалі та кормах
Враховуючи те, що токофероли легко окиснюються, важливою умовою для успішного їх визначення є дотримання заходів застереження окиснення на всіх етапах підготовки зразку до аналізу і під час проведення власне аналітичної процедури. Очевидно, помітні переваги мають ті методи, для яких кількість попередніх операцій може бути зведена до мінімуму. Суттєвим моментом також є і умови зберігання зразків перед їх аналізом: за необхідності тривалого зберігання зразки поміщають під шар інертного газу і витримують за низьких температур (–20 - –70С) [223].
Методи аналізу токоферолів, як правило, передбачають екстракцію жиру, який міститься у зразку перед омиленням. Екстракція ліпідів з об єкту може бути проведена різними розчинниками, зокрема, високий ефект дає хлороформ-метанольна система [224].
Bieri J.C. [225] описує екстракцію гарячим ізопропиловим спиртом і ацетоном, причому низькополярні ліпіди, включаючи вітаміни Е і К, пропонує видобувати додаванням гексану.
Ця система розчинників застосовується за аналізу олій, маргарину, молока, овочів і т.д. Для обробки сухого рослинного матеріалу використовують 33 %-вий розчин ацетону в воді, а також ацетон у сполученні з петролейним ефіром. Крім того, екстракцію токоферолів із проб свіжих чи сухих рослин проводять бензолом. При роботі з біологічними об єктами для їх екстракції частіше всього використовують етанол і петролейний ефір [8, 226]. При аналізі токоферолу і його похідних у тканинах тварин екстракцію рекомендують проводити після гомогенізації та зневоджування зразку нагрітою до 50 С сумішшю хлороформ-метанол-ацетон (1:1:1) [227], або за методом Фолча [228], в якому з метою більш повного видобування ліпідів можна після центрифугування провести повторну екстракцію їх із супернатанта сумішшю дистильована вода-метанол-хлороформ (1:5:10). Екстракти, отримані в результаті безводного, а також водного екстрагування, з єднують і максимально упарюють у вакуумі, а ліпіди переводять у гексанову фазу. Для екстракції омилених ліпідів, окрім петролейного ефіру і гексану, часто використовують вільний від перекисів диетиловий ефір. Для видалення водорозчинних речовин екстракти рекомендують промивати водою і висушувати. При екстракції токоферолів у екстракт одночасно з ними переходить і значна кількість інших речовин. Деякі з них, такі як, наприклад, каротин, каротиноїди, вітамін А, феноли та інші сполуки, володіють властивостями відновників і можуть впливати на результати оксидиметричного визначення токоферолів у бік завищення результатів. У екстракт можуть також переходити і хімічно інертні пігменти, присутність яких може впливати на результати фотометричних вимірювань. Також в екстрактах можуть бути присутні речовини, які затримують або пригнічують кольорову реакцію токоферолів у аналізованій пробі чи руйнують зафарбований комплекс, що вже утворився. Таку дію справляють, наприклад, жири і перекиси, що утворилися в результаті їх розкладу. Усувають вплив цих побічних сполук різними шляхами. Ряд цих речовин видаляється з екстрактів після їх омилення, хроматографічним очищенням чи молекулярною дистиляцією [46].
Для переведення ацетатної форми токоферолу у вільну за використання хімічних методів аналізу вітаміну Е широко використовують процеси омилення. Крім цього, в об єктах, що містять токофероли у вільному стані, омилення проводять також з метою очищення зразку від речовин, які заважають виділенню токоферолів [229, 230].
Bieri J.C. [225] сформулював наступні вимоги до проведення омилення: 1) виключення потрапляння повітря у реакційну суміш; 2) зведення процесу обробки проби до мінімуму; 3) обов язкове додавання антиоксиданту; 4) використання концентрованого розчину лугу, що складає 0,5-1 мл на 1 мл (г) речовини. Залежність вмісту токоферолів від режимів омилення різних кормів і тканин докладно описані Сураєм П.Ф., Жедеком М.С. [231], якими доведено, що для повного омилення проби без втрати токоферолу необхідно від 5 до 30 хвилин.
Одним із способів очищення токоферолів від імовірних домішок є молекулярна дистиляція [232, 233, 234], але вона недостатньо розділяє токофероли від інших відновників.
Іншим способом очищення токоферолів є кристалізація і хроматографія на колонках. Неомилена частина зразків рослинного походження часто містить стероли, присутність яких ускладнює подальші хроматографічні дослідження. Вони можуть частково видалятися охолодженням зразку в розчинах метанолу і гексану до –5 - –10С [235, 236]. Хроматографія на колонках часто використовується в якості попередньої обробки для видалення каротиноїдів і вітаміну А, але при цьому можливі втрати токоферолів [237, 238].
Для хроматографії на колонках у якості сорбентів частіше за все використовують окис алюмінію, фосфати магнію і кальцію [235, 237, 239]. Для попередження втрат токоферолів сорбенти перед використанням рекомендують активувати шляхом пропускання через колонку розчинника, що використовується для елюації [227]. У якості рухомої фази у хроматографії на колонках використовують розчин диетилового ефіру в гексані чи петролейному ефірі.
Дослідження токсикокінетики альфа-токоферолу ацетату і селеніту натрію у промислових курей-несучок за умови тривалого сумісного надходження з кормом
Методика визначення вітаміну Е (альфа-токоферолу) в плазмі крові, описана в збірнику Камишнікова В.С. [266], на нашу думку, стала найбільш прийнятною для відтворення, вона не потребує затрат реактивів і часу на пробопідготовку. Недоліком цього методу є те, що його не можна застосовувати для визначення вітаміну Е в тканинах, багатих ліпідами (жовток, печінка). У плазмі крові вітамін Е (альфа-токоферол) міститься у вільному стані, тому даний метод передбачає пряму екстракцію, але її не можна застосовувати для органів (зокрема печінки), в яких альфа-токоферол знаходиться у зв язаному стані та окрім токоферолу в ліпідній фракції печінки містяться речовини, що заважають фотометричному визначенню вітаміну Е (каротиноїди, вітамін А та ін.). За іншим методом (Кондрахін І.П. та ін., 1985) для видалення домішок застосовують сорбційну колонку з використанням в якості сорбенту оксиду алюмінію [237]. Недоліком цього методу є перевитрата реактивів та адсорбенту.
Методика П.Ф. Сурая з застосуванням тонкошарової хроматографії [174, 231] є найбільш точною. Але основним і суттєвим недоліком методу на даний час є її трудомісткість і перевитрата реактивів (для дослідження однієї проби дослідник використовує 50 см3 етанолу, більш як 200 см3 гексану, 50 см3 бензолу та суміш двох неорганічних кислот). Як наслідок, за цією методикою можна досліджувати лише до 12 проб за робочий день.
Методики, що описані в збірнику під редакцією Антонова Б.І. [279] також мають недоліки: для екстракції вітаміну Е використовують ацетон і диетиловий ефір (обмежені для використання), а також те, що всі операції з пробою проводять в атмосфері інертного газу (азоту).
Широкого застосування набули методи визначення токоферолів за допомогою рідинної хроматографії, але основним недоліком їх є використання коштовного обладнання (хроматографів).
Отже, пріоритетними напрямами досліджень стали зменшення кількості реактивів, спрощення процедури пробопідготовки та можливість переходу від тонкошарової хроматографії до спектрофотометричного детектування.
Методику розробляли з використанням в якості контролю тонкошарової хроматографії на пластинках «Силуфол» із закріпленим шаром сорбенту.
Спочатку були відпрацьовані хроматографічні властивості альфа-токоферолу при нанесенні на пластинки для ТШХ: 0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 7,0; 10,0; 15,0, 100,0 мкг (Рис. 3.13).
Після проявлення кольоро-реагентом – реактив Емері-Енгеля (суміш 1:1 спиртових розчинів 0,5 %-вого 2-2-дипіридилу і 0,2 %-вого хлорного заліза) альфа-токоферол проявлявся у вигляді забарвлених (від малинового до яскраво-червоного) плям на білому фоні. При цьому Rf токоферолу склало 0,53, межа детектування – 0,5 мкг.
Чутливість проявляючого реактиву за умов ТШХ (стандартні розчини альфа-токоферолу 15,0; 10,0; 7,0; 5,0; 3,0; 1,0 та 0,5 мкг).
Також проводили порівняння методики Сурая П.Ф. [231] і нашої без використання сорбційної колонки на моделі печінки від курей-несучок ІІ дослідної групи, що отримувала п ятиразові добавки альфа-токоферолу ацетату.
Результат дав змогу говорити про те, що пропорційне зменшення реактивів у 10 разів не впливає на результат фотометрії (однакова інтенсивність забарвлення плям), але крім вітаміну Е на пластинці проявлялися різні речовини (вітамін А та каротиноїди), які б заважали фотометричному визначенню токоферолу. Також провели дослідження проб печінки від усіх груп досліду без використання колонки за нашою методикою.
Токсикокінетика альфа-токоферолу ацетату і селеніту натрію у добових курчат, отриманих від курей репродуктивного поголів’я, в організм якого надходили різні дози альфа-токоферолу ацетату і селеніту натрію
Вже на другу добу експерименту в жовтку яєць обох дослідних груп відмічено підвищення вмісту альфа-токоферолу. До 10 доби вміст токоферолу стабілізувався і був вищим за контроль у І групі в 3,5; а в ІІ – у 7,7 разів. З 10 по 18 добу відмічали зменшення вмісту альфа-токоферолу в обох дослідних групах, а в контролі припинення несучості з 16 по 24 добу. В подальшому вміст токоферолу в жовтку яєць курей І дослідної групи підвищувався з 18 до 28 доби, потім стабілізувався і на 40 добу досліду був вищим за контроль у 3,2 разу. Підвищення вмісту альфа-токоферолу відмічали також і в ІІ дослідній групі з 18 по 30 добу експерименту, а потім вміст його зазнавав коливань як у бік зниження, так і підвищення, і на 40 добу експерименту був вищим за контроль у 7,7 разів.
Отже, тривале надходження в організм курей альфа-токоферолу ацетату і селеніту натрію з кормом викликає максимальне підвищення вмісту альфа-токоферолу в жовтку яєць, жировій тканині та печінці, а також призводить до накопичення його в усіх органах і тканинах.
Дослідження розподілу селену в організмі курей-несучок репродуктивного поголів я Розподіл селену в органах і тканинах курей-несучок представлено у табл. 3.11. і на рис. 3.37-3.38.
Максимально селен розподілявся і накопичувався в кістках, селезінці та головному мозку.
У курей-несучок І дослідної групи вміст селену був вірогідно вищим за контроль у плазмі та червоних м язах у 1,4 разу, печінці і білих м язах – у 1,9 разів, головному мозку – у 1,3 разу, нирках – у 1,6 та пері – в 1,2 разу, тоді як у селезінці, серці та кістках рівень селену вірогідно не відрізнявся від контролю. У курей-несучок ІІ дослідної групи вміст селену був вірогідно вищим за контроль у плазмі в 1,8 разів, печінці – в 1,9; червоних м язах у 1,4 разу, білих м язах – у 3,1 разу, серці та кістках – у 1,2; селезінці та пері – в 1,6 разу, тоді як у головному мозку та нирках рівень селену вірогідно не відрізнявся від контролю. Про перехід значної частини селену в яйце свідчать дані щодо накопичення селену в жовтку та білку яєць (рис. 3.37-3.38).
Таблиця 3.11. Розподіл селену в органах і тканинах курей-несучок за умови тривалого сумісного надходження токоферолу ацетату і селеніту натрію з кормом, (М±m, n=15) Орган, тканина Одиниці виміру Групи Контроль Дослідні І ІІ Плазма мг/см3 0,331±0,022 0,466±0,0517 0,597±0,0476 Печінка мг/кг 0,279±0,074 0,496±0,095 0,595±0,043 М язи червоні мг/кг 0,293±0,037 0,417±0,047 0,423±0,047 М язи білі мг/кг 0,169±0,029 0,333±0,031 0,525±0,067 Головний мозок мг/кг 1,189±0,120 1,562±0,152 1,350±0,173 Серце мг/кг 0,552±0,037 0,550±0,059 0,674±0,057 Нирки мг/кг 0,393±0,026 0,651±0,066 0,386±0,010 Селезінка мг/кг 1,989±0,340 2,631±0,300 3,119±0,140 Кістки мг/кг 4,823±0,615 5,389±0,483 5,969±0,631 Перо2 мг/кг 0,641 0,783 1,030 Примітки:
1. І дослідна група – альфа-токоферолу ацетат 200 г/т та селеніт натрію 0,2 г/т; ІІ дослідна група – альфа-токоферолу ацетат 1000 г/т та селеніт натрію 1,0 г/т; 2 – збірна проба;
2. – P 0,05; – Р 0,01; – P 0,001 – відносно контролю. Вміст селену в жовтку яєць курей обох дослідних груп підвищувався протягом 6 діб і на 6-ту добу експерименту був вищим за контроль у І групі в 1,7; в ІІ групі – майже в 2 рази, а потім знижувався з 6-ї по 20-ту добу і знову зростав з 20 по 30 добу, потім стабілізувався і на 40 добу експерименту залишався вищим за контроль у І групі в 1,5; в ІІ групі – в 1,8 разів.
Схожу динаміку накопичення селену відмічали і в білку яєць. Так, у І дослідній групі вміст селену зростав протягом 8 діб, потім знижувався з 8 до 18 доби, далі зростав і стабілізувався з 22 по 40 добу і на 40 добу досліду був вищим за контроль у 1,4 разу. У ІІ дослідній групі зростання вмісту селену реєстрували з 2 до 14 добу, далі вміст різко знижувався з 14 по 18 добу, а з 18 доби відмічали його підвищення і стабілізування. На 40 добу вміст селену в білку яєць був вищим за контроль у 2,4 разу. Рис. 3.37. Динаміка вмісту селену в жовтку курей протягом досліду (з 18 до 22 доби у контролі вміст селену не досліджували). Рис. 3.38. Динаміка вмісту селену в білку курей протягом досліду (з 18 до 22 доби у контролі вміст селену не досліджували).
Отже, тривале введення альфа-токоферолу ацетату і селеніту натрію з кормом викликає максимальне підвищення вмісту селену в кістках, селезінці та головному мозку, а також жовтку та білку яєць і призводить до накопичення його в усіх досліджуваних органах і тканинах курей.
Таким чином, введення курам-несучкам репродуктивного поголів я альфа-токоферолу ацетату і селеніту натрію з кормом в дозах 200 і 0,2 г/т та 1000 і 1,0 г/т протягом 47 діб призводить до накопичення альфа-токоферолу і селену в усіх органах і тканинах, особливо при надходженні надлишкових доз препаратів. У птиці І та ІІ груп відповідно альфа-токоферол максимально накопичується в жовтку яєць (480,00 та 1200,00 мг/кг), жировій тканині (179,00 та 190,57 мг/кг) і печінці (112,86 та 135,83 мг/кг), а селен – у кістках (5,389 та 5,969 мг/кг), селезінці (2,631 та 3,119 мг/кг) і жовтку яєць (0,90 та 1,10 мг/кг). Вміст селену в печінці курей репродуктивного поголів я був меншим, ніж у курей промислового поголів я, що може свідчити про наявність матеріальної (у першому досліді) та функціональної (у другому досліді) кумуляції. Матеріали цього розділу використані для публікації наукової статті [286] та при оформленні методичних рекомендацій [285].
Вивчення ембріотоксичного впливу альфа-токоферолу та селеніту натрію за умови тривалого надходження їх у надлишкових дозах в організм курей-несучок
За останній тиждень (з 40 до 47 добу) експерименту була зібрана та закладена в інкубатор наступна кількість яєць: від контрольної групи – 17, від І дослідної – 13, від ІІ дослідної – 22.
На 7 добу інкубації незапліднені та яйця з патологією були вилучені з інкубатора і піддані розтину: в контрольній групі виявлено незапліднених яєць – 5 (29,41 %), з кров яним кільцем – 1 (5,88 %), у І дослідній групі незапліднених не було, з кров яним кільцем – 1 (7,69 %), у ІІ дослідній групі на розтині виявлено 5 (22,73 %) незапліднених яєць та 4 (18,18 %) з кров яним кільцем. Отже, заплідненість яєць у контрольній групі склала 70,59 %, у ІІ дослідній – 100 %, у ІІ дослідній – 77,27 % (табл. 3.12). На 11 добу інкубації розвиток ембріонів контрольної групи відбувався без видимої патології. Ембріони знаходилися в центрі яйця, замикання алантоїсу відбулося у всіх ембріонів своєчасно. В обох дослідних групах виявлено по одному завмерлому ембріону. Загибель ембріоні в І групі можна пояснити наявністю механічного пошкодження шкаралупи при закладці в інкубатор. У ІІ групі загибель ембріону, ймовірно, настала внаслідок гіпоксії, що спричинена порушеннями кровообігу (на розтині відмічено гіперемію та крововилив у алантоїс.