Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 17
1. Характеристика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
2. Латентная форма инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, ее влияние на диагностику, специфическую профилактику заболевания и эпизоотологическое значение
3. Структура и функционирование генома вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
4. Методы молекулярной биологии и их использование в диагностике и молекулярной эпизоотологии инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
4.1. Рестрикционное картирование 26
4.2. Исследования по молекулярной эпизоотологии инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.
4.3. Конструирование молекулярных зондов для выявления нуклеотидных последовательностей вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и их применение для диагностики болезни
4.4. Разработка и применение полимеразной цепной реакции для диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого
4.5. Методы оценки полиморфизма ДНК 37
5. Иммунный ответ на инфекцию вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
6. Экспериментальные инфекции, вызванные вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
7. Характеристика вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
8. Особенности клинического проявления вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
9. Особенности патогенеза вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
10. Серологическая диагностика вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
11. Экспериментальные инфекции, вызванные вирусом вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
12. Иммунология вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
12.1. Иммуносупрессивное действие нецитопатогенных и цитопатогенных биотипов вируса вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
12.2. Подавление врожденного иммунитета с последующим установлением персистентной инфекции
13. Роль вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых в развитии респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота
13.1. Влияние вирусов на клетки эпителия респираторных путей
13.2. Влияние вирусов на иммунные механизмы 67
14. Применение противовирусных препаратов при инфекционном ринотрахеите и вирусной диарее болезни слизистых крупного рогатого скота
15. Заключение по обзору литературы 80
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 84
1. Материалы и методы 84
2. Результаты исследований 100
2.1. Усовершенствование методики постановки реакции нейтрализации для серологической диагностики вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
2.2. Распространение инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота в хозяйствах Сибири
2.3. Спектр возбудителей инфекционных заболеваний, выделенных от больных телят, в неблагополучных по инфекционному ринотрахеиту крупного рогатого скота хозяйствах
2.4. Выделение и характеризация изолятов вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота от животных в Сибири
2.5. Выделение и характеризация изолятов вируса вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота от животных в Сибири
2.6. Разработка диагностической ПЦР для выявления вируса ИРТКРС
2.7. Сравнительная эффективность полимеразной цепной реакции, молекулярной гибридизации и метода выделения вируса в культуре клеток в диагностике ИРТКРС
2.8. Типирование Российских штаммов и изолятов вируса ИРТ КРС при помощи ГЩР-ПДРФ-анализа
2.9. Сравнительное изучение патогенности штаммов и изолятов вируса ИРТ КРС на естественно восприимчивых животных
2.10. Патогенность изолятов вируса вирусной диареи- болезни слизистых крупного рогатого скота для естественно восприимчивых животных в зависимости от их интерферон индуцирующей активности
2.11. Смешанная экспериментальная инфекция телят, вызванная вирусами инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
2.12. Противовирусная активность препаратов различных классов в опытах in vitro в отношении вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
2.13. Лечебно-профилактическая эффективность препарата 1-фенил-2,3-диметил-4-йодпиразолон в опытах на животных с использованием экспериментального заражения вирусами инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 223
ВЫВОДЫ 252
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 256
ЛИТЕРАТУРА 257
ПРИЛОЖЕНИЕ 321
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди многообразия вирусных агентов, вызывающих патологию у крупного рогатого скота (КРС), вирусы инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС) занимают особое место в связи с многообразием клинических проявлений и тяжестью течения болезней, вызываемых ими (Н.Н. Крюков и соавт. 1984; К.П. Юров и соавт., 2003; W.D.G. Yates, 1984; D. Deregt et al, 1995; A.L.E. Lindberg, 2003).
Многие исследователи отводят первичную этиологическую роль в возникновении массовых респираторных болезней молодняка КРС этим вирусам, т.к. инфицированные ими животные становятся восприимчивыми к развитию секундарной микрофлоры и осложнению инфекционного процесса (Н.Н. Крюков и соавт, 1984; Е.В. Андреев, 1984; W.D.G. Yates, 1984; L.A. Babiuk et al, 1991; RW. Fulton et al, 2004). Роль вирусов заключается в разрушении клеток эпителия респираторных путей (V.Fainstein et al, 1980), понижении активности бактериостатических механизмов в легких, воздействии на макрофаги и полиморфно-ядерные нейтрофилы, лейкоциты и Т4+-лимфоциты и изменении их функций (G. J. Jakab, 1983; Н. B.Ohmann et al, 1985; L.A. Babiuk et al, 1988; M. T. Winkler, 1999).
ИРТ и ВД-БС КРС регистрируются во многих регионах РФ и странах СНГ и причиняют значительный экономический ущерб мясному и молочному скотоводству (П.А. Красочко, 1991; О.Г. Петрова и соавт, 1999; А.Г. Высокопоясный и соавт, 2000; Н.И. Закутский, 2000; В.А. Мищенко и соавт, 2001; Н.Ю. Басова, 2002; К.П. Юров и соавт, 2003).
Латентная и персистентная формы у этих болезней осложняют проведение профилактических мероприятий, т.к. приводят к неконтролируемому распространению возбудителя во внешней среде, где немаловажную роль играют животные-вирусоносители (Е.А. Андреев, 1984; А.Г. Глотов, 1999; G. Van Shchaik, 1998). Учитывая длительную персистенцию возбудителя на уровне популяции крупного рогатого скота, определение вирулентности изолятов вирусов вызывает большой научно-практический интерес исследователей всего мира (М. Ackennann, 2001).
В настоящее время необходима разработка и внедрение простых, высокочувствительных и специфичных методов, выявляющих возбудителя на любой стадии заболевания, основанных на определении в биоматериале нуклеиновых кислот (молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) становится одним из важных диагностических тестов в ветеринарной вирусологии (S.Belak. et al.,1993). Метод имеет явные преимущества в скорости и чувствительности по сравнению с традиционными вирусологическими методиками, а при высокой специфичности его значение для ветеринарной практики возрастает.
В научной литературе есть сообщения о разработке и использовании ПЦР для выявления ДНК вируса ИРТ КРС в сперме быков (M.Wiedmann,1993; R.S.Kataria,1997; J. Rola et al, 1999), культуральной жидкости (B.P. Sreenivasa et al., 1996), полевых изолятах (S.Moore et al., 2000).
В качестве мишеней амплификации выбирались гены гликопротеинов (М. Fuchs et al., 1999; С. Ros et al, 1999), тимидинкиназы (S. Moore et al., 2000), использовалась или стратегия гнездовой ПЦР, или ПЦР в комбинации с блот-гибридизацией (F.S. Kibenge et al., 1993; R.S.Kataria, 1997).
С введением в практику ветеринарной вирусологии метода рестрикционного анализа появилась возможность дифференцировать вирус ИРТ КРС (BHV-1) на подтипы (1.1, 1.2 а/в и 1.3), различающиеся по вирулентности (М. Engels et. al., 1981; A. Metzler, et. al., 1985). Впоследствии штаммы BHV-1.3, были реклассифицированы в отдельный тип BHV-5 (В. Roizman et al., 1995). Метод имеет ограниченное диагностическое значение, но успешно используется при эпизоотологических исследованиях. К сожалению, он обладает некоторыми недостатками, главным из которых является необходимость наработки большого количества вирусной ДНК.
Существование геномных вариантов вируса необходимо учитывать при разработке диагностических ПЦР-тест-систем (C.Ros, S.Belak, 1999). Для дифференциации между вариантами различных вирусов широко используются методы оценки полиморфизма ДНК, в частности, ПЦР-ПДРФ анализ (С. Херрингтон и соавт, 1999).
Актуальным в настоящее время представляется изучение возможности использования противовирусных препаратов различных классов для профилактики и лечения больных животных (М.М. Зубаиров, 1998).
Противовирусные препараты с успехом используются при лечении герпесвирусных инфекций человека (И.Ф. Баринский и соавт., 1986, Е. De Clerq, 2001). Данных о применении их для профилактики и терапии ИРТ и, особенно, ВД-БС у крупного рогатого скота недостаточно.
Возбудитель ВД-БС КРС представлен 2 биотипами, цитопатогенным и нецитопатогенным (A.L.E. Lindberg, 2003). Клинические проявления болезни у КРС зависят от биотипа вируса и определяются наличием интерферона (ИФН) 1 типа и его активности. Формирование персистентной формы болезни у плода происходит в период его внутриутробного развития до 150 дней нецитопатогенным вариантом вируса за счет ингибирования синтеза этого белка (М. Schweizer et al., 1999; N. Grandvaux et al., 2002). Цитопатогенные штаммы вируса, напротив, индуцируют выработку интерферона в организме животных в высоких титрах, что, по мнению C.R. Rinaldo et al. (1976) и SJ.Skidmore (1987), является косвенным свидетельством их патогенности.
Цель и задачи исследований. Цель работы: разработка способов диагностики, изучение молекулярно-биологических свойств возбудителей и научное обоснование применения противовирусных препаратов при инфекционном ринотрахеите и вирусной диарее крупного рогатого скота. Для достижения указанной цели были поставлены задачи: 1 .Усовершенствовать методику постановки реакции нейтрализации в культуре клеток микрометодом для ретроспективной серологической диагностики ВД-БС КРС. Изучить распространение ИРТ и ВД-БС КРС в Сибири, установить роль вирусов в этиологии массовых респираторных болезней молодняка КРС и выявить ассоциации вирусов, возникающие при вспышках массовых респираторных болезней;
2. Разработать ПЦР для выявления вируса ИРТ КРС и изучить ее сравнительную диагностическую эффективность, а также способ типирования и дифференциации штаммов и изолятов вируса при помощи ПЦР-ПДРФ-анализа;
3. Изучить некоторые молекулярно-биологические свойства штаммов и изолятов вирусов, выделенных от больных и инфицированных животных. В условиях контролируемых экспериментов определить их сравнительную патогенность для естественно восприимчивых животных в зависимости от генотипа и интерфероногенной активности, а также воспроизвести острую смешанную бронхопневмонию вирусной этиологии и изучить ее клинические проявления;
4. Изучить противовирусную активность препаратов различных классов, а также экзогенного интерферона в отношении вирусов ИРТ и ВД-БС КРС в опытах in vitro, а наиболее эффективных из них в экспериментах in vivo.
Научная новизна.
1. Усовершенствована методика постановки реакции нейтрализации в культуре клеток микрометодом для ретроспективной серологической диагностики ВД-БС КРС. Установлено широкое распространение ИРТ и ВД-БС КРС в Сибири и подтверждена ведущая роль вирусов в возникновении массовых респираторных болезней телят вирусной этиологии в крупных хозяйствах племенного и молочного направления. Установлена взаимосвязь между концентрацией поголовья, серопозитивностью и частотой выделения вирусов от больных животных. Изучены ассоциации вирусов, возникающие при массовых вспышках респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота.
2. Разработана ПЦР для выявления вируса ИРТ КРС и изучена ее сравнительная диагностическая эффективность, а также способ типирования и дифференциации вируса при помощи ПЦР-ПДРФ-анализа. Проведено типирование штаммов и изолятов вируса, разработан способ дифференциации аттенуированного вакцинного штамма ТК-А от полевых штаммов и изолятов вируса.
3. Изучены некоторые молекулярно-биологические свойства изолятов вирусов ИРТ и ВД-БС КРС, выделенных от больных и инфицированных животных. В условиях контролируемых экспериментов показана взаимосвязь генотипа вируса ИРТ КРС и интерфероногенной активности вируса ВД-БС КРС с их патогенностью для естественно восприимчивых животных, а также воспроизведена острая смешанная вирусная болезнь и показано усиление патогенных свойств вируса ИРТ КРС на фоне размножения вируса ВД-БС КРС.
4. Установлена противовирусная активность препаратов различных классов в отношении вирусов ИРТ и ВД-БС КРС в опытах in vitro. Показана профилактическая эффективность 1-фенил-2,3-диметил-4 йодпиразолона в контролируемых опытах на экспериментально зараженных телятах 4-6-месячного возраста.
Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации использованы при составлении:
- Рекомендаций «Вирусные заболевания крупного рогатого скота в Сибири и на Урале (Особенности эпизоотологии, клинического проявления, диагностика, меры профилактики и борьбы)», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (прот. № 1, 12.01.2001) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (прот. №1, 15.01.2001);
- Методических рекомендаций «Оценка токсичности противовирусных препаратов в культуре клеток», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (прот. № 2, 05.03.2004) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (прот. №10, 05.03.2004);
- Методических рекомендаций «Выявление вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции с последующей дифференциацией вакцинного штамма и эпизоотических изолятов», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (прот. № 6, 09.11.2004) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (прот. №11, 10.11.2004);
- Рекомендаций «Вирусные и ассоциативные вирусно-бактериальные респираторные болезни крупного рогатого скота (Особенности эпизоотологии, патогенеза, клинического проявления, патологоанатомических изменений)», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (прот. № 6, 09.11.2004) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (прот. №23, 09.11.2004);
- Методических рекомендаций «Выявление вируснейтрализующих антител к вирусу вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота в реакции нейтрализации микрометодом в культуре клеток», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (прот. №2, 29.04. 2005) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (прот. №4, 29.04.2005);
Методического пособия «Противовирусное действие интерферонов», утвержденного Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (прот. №2, 03.05. 2005) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (прот. №4, 03.05.2005);
- Методического пособия «Молекулярные методы диагностики: принципы и практическое применение при инфекционных болезнях животных», утвержденного Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (прот. №2, 03.05. 2005) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» (прот. №4, 03.05.2005).
Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, создают перспективы использования ПНР не только в диагностике ИРТ КРС, но и в молекулярной эпизоотологии болезни и могут быть использованы для оптимизации противоэпизоотических мероприятий с целью дифференциации аттенуированного вакцинного штамма от полевых штаммов и изолятов вируса. Полученные данные также дают возможность расширить научные знания относительно роли вирусов в возникновении массовых респираторных болезней телят и могут быть использованы при дальнейшем изучении иммунологии и патогенеза инфекций, вызванных герпес- и пестивирусами. Результаты исследований открывают перспективы применения противовирусных препаратов для профилактики вирусных инфекций и могут быть использованы в практике при разработке оздоровительно-профилактических мероприятий.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: заседаниях Ученого совета ГНУ Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (Новосибирск, 1999-2005), Международной научно-практической конференции (Новосибирск, 1999); Научно-практической конференции (Новокузнецк, 2000); Научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных» (Троицк, 2000); 111 и IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2001,2002); Научно-практической конференции «Болезни сельскохозяйственных животных вирусной и других этиологии и меры борьбы с ними» (Иркутск, 2001); 5-й Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение АПК Сибири, Монголии, Казахстана, Беларуси и Башкорстана» (Новосибирск, 2002); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» (Воронеж, 2002); Международной научно-практической конференции (Покров, 2002); 6-й Международной научно-практической конференции «Аграрная наука Сибири, Монголии, Казахстана и Башкорстана - сельскому хозяйству» (Новосибирск, 2003); International Multidisciplinary Workshop Scientific Discussion Club «Progress in Biotechnology and neurobiology - integrative medicine» (Egypt, 2004); Научно-производственной конференции, посвященной 100-летию проф. Н.Т. Кондюрина (Омск, 2004); Международной научно-производственной конференции «Актуальные проблемы эпизоотологии на современном этапе» (Санкт-Петербург, 2004); Сибирском Международном ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2005); Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний (Новосибирск, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (Новосибирск, 2005), Международной научно-практической конференции «Проблемы ветеринарной науки и практики в современных условиях» (Алматы, 2005).
Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены Подсекцией инфекционной патологии при ИЭВСиДВ (прот. № 5, 20.10.2005) и Ученым Советом ГНУ ИЭВСиДВ (прот. № 9, 20.10.2005).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 39 печатных работах в сборниках научных трудов, журналах «Ветеринария», «Вопросы вирусологии», «Антибиотики и химиотерапия» и других научных трудах и изданиях.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 320 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, приложения. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 20 таблицами. Список литературы включает 515 источников, в том числе 364 зарубежных.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Модифицированный метод серологической диагностики ВД-БС КРС, распространение и особенности эпизоотической ситуации при ИРТ и ВД-БС КРС в Сибири;
- Теоретическое и экспериментальное обоснование разработки «Тест-системы для диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом полимеразнои цепной реакции» и определение ее сравнительной диагностической ценности при различных формах болезни, а также способ типирования и дифференциации штаммов и изолятов вируса при помощи ПЦР - ПДРФ-анализа;
- Молекулярно-биологические свойства изолятов вирусов ИРТ и ВД- БС КРС, выделенных от больных и инфицированных вирусами животных и их сравнительная патогенность для естественно восприимчивых животных в зависимости от генотипа и интерфероногенной активности;
- Противовирусная активность препаратов различных классов в отношении вирусов ИРТ и ВД-БС КРС в опытах in vitro и in vivo.
Теоретический анализ, обобщение результатов, экспериментальные исследования выполнены автором самостоятельно.
Автор выражает глубокую благодарность за участие в выполнении некоторых фрагментов диссертации сотрудникам ГНЦ ВБ «Вектор»: С.Ф. Орешковой, А.Н. Сергееву, Е.И. Рябчиковой, заведующему лабораторией биотехнологии-диагностический центр ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН А.Г. Глотову и ее сотрудникам: А.В. Нефедченко, Н.В. Некрасовой.