Содержание к диссертации
Введение
1 ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПАТОГЕНЕЗА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 11
1.2 Изменения гематологических, иммунологических и цитогене-тических показателей у животных при анаплазмозах 17
1.3 Патогенетические особенности сочетанного течения лейкоза крупного рогатого скота с другими инфекционными и инвазионными заболеваниями 21
1.4 Проблема онкогенности паразитов (мутагенез, иммунологическая недостаточность при ассоциированных формах паразитозов) 25
1.5 Использование микроядерного теста эритроцитов и метода выявления ядрышковых организаторов хромосом в интерфазных ядрах клеток в онкологии 31
1.6 Заключение по обзору литературы 39
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 41
2.1 Материал и методы 41
2.2 Цитогенетические исследования интактного крупного рогатого скота 45
2.2.1 Стандартизация микроядерного теста эритроцитов для исследования крупного рогатого скота 45
2.2.2 Частота эритроцитов с микроядрами в крови интактного крупного рогатого скота разного возраста 47
2.2.3 Индекс ядрышковых организаторов хромосом в интерфазных ядрах лимфоцитов крови интактного крупного рогатого скота разного возраста 49
2.3 Гематологические, цитогенетические и иммунологические по казатели в крови крупного рогатого скота на разных стадиях лейкоза на фоне анаплазмозной инвазии 53
2.3.1 Гематологические показатели у крупного рогатого скота на разных стадиях лейкоза на фоне хронической анаплазмозной инвазии 54
2.3.2 Частота эритроцитов с микроядрами и индексы ядрышко-вых организаторов хромосом в интерфазных ядрах лимфоцитов крови крупного рогатого скота на разных стадиях лейкоза на фоне хронической анаплазмозной инвазии 62
2.3.3 Содержание иммуноглобулинов и иммунных комплексов в сыворотке крови крупного рогатого скота на разных стадиях лейкоза на фоне хронической анаплазмозной инвазии 69
2.3.4 Гематологические, цитогенетические и иммунологические изменения в крови крупного рогатого скота инфицированного ВЛКРС при остром течении анаплазмоза 75
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 81
4. ВЫВОДЫ 102
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 105
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 106
7. ПРИЛОЖЕНИЯ 133
- Изменения гематологических, иммунологических и цитогене-тических показателей у животных при анаплазмозах
- Цитогенетические исследования интактного крупного рогатого скота
- Частота эритроцитов с микроядрами и индексы ядрышко-вых организаторов хромосом в интерфазных ядрах лимфоцитов крови крупного рогатого скота на разных стадиях лейкоза на фоне хронической анаплазмозной инвазии
Введение к работе
1.1 Актуальность проблемы. Лейкоз крупного рогатого скота - болезнь, вызываемая вирусом лейкоза (ВЛКРС), распространение которого в нашей стране среди скота регистрируется повсеместно (В.П. Шишков, 1977; В.М. Нахмансон, 1986; Л.Г. Бурба, А.Ф. Валихов, В.А. Горбатов и др., 1988; П.Н. Смирнов и др., 1992; Р.С. Москалик, 1992; В.В. Храмцов, 1995; Ю.П. Смирнов, 1995; И.М. Донник, 1997; Ю.П. Царев и др., 1997; А.Т. Татарчук и др., 1997; Н.И.Петров, 1998; М.И. Гулюкин, П.Н.Смирнов, 1999; В.В. Разумовская, 2001; В.Л.Тихонов, 2001; М.И. Гулюкин, Л.А. Иванова, Н.В. Замараева и др., 2002). При этом развитие гематологической стадии заболевания (с переходом в опухолевую) обуславливается предрасполагающими цитогенетическими и иммунологическими нарушениями, развитие которых связано, в том числе, с экзогенным воздействием на организм животных.
В настоящее время основное внимание исследователей при изучении лейкоза крупного рогатого скота сосредоточено на физических и химических факторах риска (В.В. Храмцов, B.C. Федоров, 1994; И.М. Донник, 1997; С.А. Мурватуллоев, 1998; Ю.П. Смирнов, 1999). При этом о биологических факторах приведены весьма отрывочные сведения, в частности о влиянии М. bovis (В.В. Смирнова, П.Н. Смирнов, 1980; С.Н. Магер, 1992; Л.М. Ерова, 1996) и вакцинного штамма Br. abortus (В.В. Разумовская, 1992), о влиянии иммунодепрессии у инфицированных ВЛКРС животных на фоне вирусной диареи - болезни слизистых (D.H. Roberts et al., 1988), а также индуцированной гельминтами, на результаты серологической диагностики лейкоза (П.Н. Смирнов, В.А. Апалькин, Ф.А. Волков, 1995).
Поскольку бессимптомное носительство ВЛКРС имеет широкое распространение, и приобрело эпизоотическое значение, то нельзя исключить возможность его сочетанного течения с сопутствующими инфекционными и, в особенности, распространенными паразитарными болезнями. При этом в по-
следнее время выдвинуты концепции о роли различных патогенных ассоцио-зов гельминто-протозойно-бактериальной этиологии в организме животных, представляющих собой своеобразную экосистему (А.С. Бессонов, 1999; Ю.Ф. Петров, 1999). В медицине рассматривается проблема онкогенности паразитов, которые могут являться предрасполагающим биологическим фактором в активации онкогенов и пролиферации клеток с развитием опухолей (В.Г. Бычков, Л.С. Яроцкий, 1990; Н.Н. Ильинских и др., 1990; Л.В. Калинин, 1995; И.Н. Ильинских, 2002). Причем развитие неоплазм наблюдается преимущественно в местах обитания паразитов, эконишах (В.А. Парнес, 1986; СЮ. Ильин, 1995; Е.Н. Ильинских, В.В. Новицкий, А.В. Лепехин и др., 2000).
Нас интересовал вопрос влияния анаплазмоза в энзоотичных зонах на показатели крови крупного рогатого скота (в том числе цитогенетические и иммунологические) при лейкозе, в соответствии с приведенными другими авторами примерами сочетанного течения этих болезней (В.Г. Минасян, А.Б. Муромцев, И.И. Русанов, 1998; О.Е.Мальцева, 1998; U. Braun et al., 1987). В представленных работах констатированы факты подобного ассоциативного течения болезней, но патогенетические изменения на организменном уровне не выяснены, лишь отмечено более выраженное проявление анаплазмоза при данной смешанной инфекции.
Хронический анаплазмоз - кровепаразитарная болезнь, в настоящее время имеющая тенденцию к распространению на ранее благополучных территориях (В.А. Седов, В.Д. Певнева, Т.И. Сидоркина, 1998; М.Ш. Акбаев и др., 1998; Н.А. Яременко, В.Т. Заблоцкий, 1999; О.Е. Мальцева, 2002; A. Poncet et al., 1987; J. M. Anldel et al., 1997), в частности, с 1970-х годов в Сибири (С.Н. Никольский, В.А. Бацанов, Е.И. Теплова, В.И. Никифоренко, 1976; Е.И. Теплова, А.И. Русскова, Л.К. Лиховоз, Н.А. Овечкин, 1983).
Кроме общей территориальной приуроченности, актуальность данного направления определяется тем, что выраженные изменения гематологических, цитогенетических и иммунологических показателей у животных, отме-
ченные при лейкозе (М.И. Гулюкин, В.А. Горбатов, 1979; Е.Е. Дун, 1982; В.Й. Тамошюнас, 1987; П.Н. Смирнов, А.Г. Незавитин, В.В. Смирнова и др., 1992; Г.А. Симонян, Ф.Ф. Хисамутдинов, 1995), во многом характерны для анаплазмоза, хотя и с другим механизмом развития (Н.И. Степанова, К.А.Казаков, В.Т. Заблоцкий и др., 1982; Л.П. Дьяконов, И.В. Орлов, И.В. Абрамов, 1985; К.И. Абуладзе, И.В. Демидов, А.А. Непоклонов и др., 1990). Это обусловило необходимость разработки дифференциальной гематологической диагностики этих болезней (Х.С. Салимов, А. Гафуров, 1983).
Данные по исследованию современными методами иммунологических и цитогенетических показателей у крупного рогатого скота при анаплазмозе, даже в моноварианте, практически отсутствуют. Кроме того, количество работ с применением скрининговых цитогенетических методик, используемых в онкологии, при патологиях сельскохозяйственных животных весьма ограничено (В.Ю. Кравцов, 1998; С.Н. Прошин и др., 2001).
Результаты исследований в этом направлении, по-видимому, могут внести некоторые коррективы в существующие представления как о роли паразитов в изменении изучаемых показателей у крупного рогатого скота при лейкозе, так и при анаплазмозе в моноварианте.
1.2 Цель и задачи исследований. Цель исследований - оценить роль анаплазмозной инвазии в изменении гематологических, цитогенетических и иммунологических показателей у крупного рогатого скота при лейкозе.
Задачи исследований включали:
Стандартизировать микроядерный тест эритроцитов для исследования крупного рогатого скота и изучить частоты эритроцитов с микроядрами и индексы ядрышковых организаторов хромосом в интерфазных ядрах лимфоцитов крови у интактного скота черно-пестрой породы разного возраста.
Изучить изменение гематологических, цитогенетических и иммунологических показателей в крови крупного рогатого скота на разных стадиях лейкоза на фоне хронического и острого течения анаплазмоза.
1.3 Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование гематологического, цитогенетического и иммунологического статуса крупного рогатого скота черно-пестрой породы на разных стадиях лейкоза на фоне анаплазмозной инвазии.
У здоровых и инфицированных ВЛКРС животных, содержащихся на эн-зоотичной по анаплазмозу и лейкозу территории, в период активности клещей выявлены общие особенности гематологической картины, выражающиеся в лейкоцитозе, умеренной эозинофилии (весной), нейтрофилии (летом, у инвазированных в основном за счет палочкоядерных нейтрофилов, у свободных от анаплазм - сегментоядерных), лимфоцитозе и моноцитопении. У гематологически больных лейкозом коров перечисленные изменения наблюдались в более стертой форме при низком содержании моноцитов.
Доказана зависимость повышения частоты эритроцитов с микроядрами в крови крупного рогатого скота от стадии развития лейкозного процесса в связи с осложнением анаплазмозной инвазией (резко выражено повышение показателя при остром течении анаплазмоза).
Выявлено повышение пролиферативной активности лимфоцитов крови по индексам ядрышковых организаторов хромосом (ЯОР) в интерфазных клетках животных (в большей мере у коров с гематологической стадией лейкоза и у инфицированных ВЛКРС при остром течении анаплазмоза), содержащихся на энзоотичной по анаплазмозу и лейкозу территории, по сравнению с интактными животными благополучной территории.
Установлено, что в разгар периода активности клещей (летом) гуморальное звено иммунной системы животных свободных от ВЛКРС и на разных стадиях лейкоза на фоне анаплазмозной инвазии характеризуется активацией, выражающейся повышенной продукцией иммуноглобулинов разных классов, в особенности IgG (в зависимости от стадии развития лейкоза в связи с осложнением хроническим анаплазмозом), а при остром течении анаплазмоза - весной. Также выявлен повышенный уровень сывороточных им-
мунных комплексов, особенно в весенний период, увеличивающийся в зависимости от стадии развития лейкоза при незначительном превышении в группах, инвазированных анаплазмами.
На интактных животных экспериментально стандартизирован микроядерный тест эритроцитов для исследования крупного рогатого скота. Установлено повышение частоты эритроцитов с микроядрами в крови скота черно-пестрой породы с возрастом, отражающее уровень накопленных генетических повреждений.
На интактном крупном рогатом скоте черно-пестрой породы выявлено снижение индекса ядрышковых организаторов хромосом в интерфазных ядрах лимфоцитов крови с возрастом, свидетельствующее о снижении проли-феративной активности клеток организма в онтогенезе.
1.4 Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные
в настоящем исследовании данные вносят новые сведения о гематологиче
ской картине, изменениях цитогенетических и иммунологических показате
лей у крупного рогатого скота при лейкозе и анаплазмозе и их сочетанном
течении, и могут быть использованы в гематологической диагностике лейко
за у животных, содержащихся на энзоотичной по анаплазмозу территории.
Материалы по стандартизации микроядерного теста эритроцитов открывают перспективы для его использования в качестве скринингового при учете цитогенетической нестабильности и формировании групп повышенного риска при лейкозе крупного рогатого скота.
Результаты цитогенетических исследований крупного рогатого скота черно-пестрой породы в норме, в онтогенезе и при патологии вносят вклад в частную генетику этого вида и ветеринарную генетику.
1.5 Апробация полученных результатов. Материалы диссертации доло
жены и обсуждены на научно-практической конференции «Болезни сельско
хозяйственных животных вирусной и других этиологии и меры борьбы с ни
ми» (Иркутск, 2001); I международном ветеринарном конгрессе (Алматы,
2002); 5-й Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение АПК Сибири, Монголии, Казахстана, Беларуси и Башкортостана» (Абакан, 2002); научно-практической конференции, посвященной 70-летию Иркутской НИВС «Актуальные проблемы ветеринарной медицины Восточной Сибири» (Иркутск, 2002); международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» (Душанбе, 2003); VII международной научно-производственной конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (Белгород, 2003); 2-nd International Conference «Veterinary Genetics, Selection and Ecology» (Novosibirsk, 2003); межрегиональной научно-практической конференции «Повышение устойчивости и эффективности агропромышленного производства в Сибири: наука, техника, практика» (Кемерово, 2003); международной научной конференции, посвященной 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» (Владимир, 2003); региональной научно-практической конференции «Современные проблемы и достижения аграрной науки в животноводстве, растениеводстве и экономике» (Томск, 2004); международной научной конференции «Современные проблемы эпизоотологии» (Краснообск, 2004).
Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном совещании сотрудников ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (2004).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, приложений.
Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 4 рисунками. Список литературы включает 222 источника, из них 3 8 - зарубежных авторов.
1.8 Внедрение результатов исследований. Материалы по оценке изме
нений гематологических показателей у крупного рогатого скота при лейкозе
в энзоотичных по анаплазмозу районах используются в диагностической ра
боте областной и районных ветеринарных лабораторий Томской области.
Результаты исследований используются в программе подготовки студентов факультета ветеринарной медицины по курсам «Эпизоотология и инфекционные болезни животных» и «Паразитология и инвазионные болезни животных» в Томском сельскохозяйственном институте - филиале Новосибирского государственного аграрного университета.
По результатам исследований разработаны методические рекомендации «Использование микроядерного теста эритроцитов и метода выявления ядрышковых организаторов хромосом в интерфазных ядрах лимфоцитов в цито-генетических исследованиях крупного рогатого скота в норме и при лейкозе» (рассмотрены и утверждены ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН, пр. №4 от 27.09.2004 г., подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины РАСХН, пр. №21 от 27.09.2004 г.).
1.9 Основные положения, выносимые на защиту.
Результаты цитогенетических исследований частоты эритроцитов с микроядрами и индексов ядрышковых организаторов хромосом интерфазных лимфоцитов в крови крупного рогатого скота, отражающих возрастные изменения уровня генетических повреждений и пролиферативнои активности клеток организма соответственно.
Материалы, доказывающие, что анаплазмозная инвазия при сочетан-ном течении оказывает влияние на гематологический, цитогенетический и иммунологический статус крупного рогатого скота, инфицированного ВЛКРС и больного лейкозом.
Изменения гематологических, иммунологических и цитогене-тических показателей у животных при анаплазмозах
Картина крови при анаплазмозе крупного рогатого скота резко изменяется. Количество эритроцитов уменьшается и доходит до 1 миллиона и ниже в 1 мм3, а количество гемоглобина снижается до 3-5 мг%. При микроскопии мазков крови отмечается анизоцитоз, пойкилоцитоз, полихромазия, базо-фильная пунктация, нормобласты и тельца Жолли. Последние бывают более крупных размеров, чем анаплазмы, окраска более интенсивная (А.А. Кудрявцев, 1948; Ф.А. Терентьев, А.А. Марков, 1956).
Количество лейкоцитов вначале увеличивается, а затем быстро падает, доходя до 3-4 тысяч в 1 мм3. В период выздоровления преобладают (до 98%) лимфоциты. В лейкоформуле нейтрофилия со сдвигом до палочкоядерных и юных форм, лимфоцитоз, эозинофилия. Изменение лейкоцитарной формулы значительно опережает появление видимых клинических признаков болезни (Артеменко Л.П., 1975; Х.С. Салимов, А. Гафуров, 1983; Н.Ф. Баранова, Н.Ф. Новинский, Ю.Г. Шубик, Е.Я. Виноградов, 1986; Г.А. Симонян, Ф.Ф. Хисамутдинов, 1995).
При анаплазмозе, также как и при болезнях, вызываемых возбудителями иной природы, иммунитет и иммунные реакции являются общефизиологической защитной функцией организма, в основе которой лежат клеточные и гуморальные факторы.
В благополучной зоне все породы крупного рогатого скота и овец в любом возрасте восприимчивы к заражению анаплазмозом (К.И. Абуладзе, И.В. Демидов, А.А. Непоклонов и др., 1990). При анаплазмозе в латентных очагах имеют место реинвазии. Ежегодно новая встреча с возбудителем вызывает в организме ранее переболевшего животного повторный иммунологический эффект, связанный с образованием специфически реагирующих клеток и гуморальных антител, обеспечивающий дальнейший баланс возбудителя и реактивных сил организма (Н.И. Степанова, 1971).
Основой иммунологических реакций организма животных при анаплазмозе является пролиферация и плазматизация клеток ретикулоэндотелиаль-ной системы и, прежде всего, селезенки, что предшествует нарастанию уровня антител. Биохимически это проявляется значительным увеличением гам-ма-глобулиновой фракции сывороточных белков, а в период острого перебо-левания возрастает уровень и бета-глобулинов. При этом на фоне развивающейся анемии снижается содержание общего белка и альбуминов (Н.И. Степанова, К.А. Казаков, В.Т. Заблоцкий и др., 1982; S.A. Ajaji, I.L. Ojetunde, G.A. Ogbonna, 1987). Понижение содержания альбуминов указывает на расстройство нормальной функции печени, в результате чего в организме животных создаются неблагоприятные условия для образования антител (А.Д. Рыбкина, 1964).
Заслуживает внимания установленный Н.И. Степановой (1971) факт, что по титру специфических антител в сыворотке крови можно судить о давности переболевания животных, то есть практически можно отдифференцировать переболевание от паразитоносительства. Титр антител в острый период болезни повышается до 1 : 320, иногда- 1 : 1280, в период паразитоносительства - 1 : 40 — 1: 5. Таким образом, результаты серологических исследований можно использовать для изучения эпизоотической ситуации и более точного планирования и проведения профилактических мероприятий (Н.И. Степанова, 1971).
В процессах патогенеза и иммуногенеза при кровопаразитарных болезнях ведущая роль отводится селезенке (Н.И. Степанова, 1971), в которой происходит взаимная кооперация между Т- и В-клетками (P.M. Хаитов, 1977). Селезенка и другие органы, богатые элементами ретикулоэндотелиальной системы, утилизируют пораженные анаплазмами эритроциты, вследствие чего титр антител у больных животных возрастает по мере длительности течения болезни. Наличие и возрастание количества анаплазм в организме животных вызывают выработку не только специфических иммуноглобулинов - антител, но также и аутоантител, которые способствуют изъятию из крови пораженных анаплазмами эритроцитов и утилизации их в макрофагах, клетках ретикулоэндотелиальной системы (Л.П. Дьяконов, И.В. Орлов, И.В. Абрамов, 1985). Усиленный эритрофагоцитоз, который активизируют вырабатывающиеся аутоантитела, а также сывороточные антигены, приводят к блокаде ретикулоэндотелиальной системы продуктами распада эритроцитов (Н.И. Степанова, К.А. Казаков, В.Т. Заблоцкий и др., 1982; Н.Ф. Баранова, Н.Ф. Новинский, Ю.Г. Шубик, Е.Я. Виноградов, 1986; М.Ш. Акбаев, А.А. Водянов, И.Е. Каминков и др., 1998). Количество эритроцитов и гемоглобина у тяжелобольных животных сокращается в 2,5 раза, в организме наступает гипоксемия и гипоксия, при угнетении иммунобиологических механизмов снижается резистентность организма, и процесс часто заканчивается летально.
Высказывается предположение об аллергии как обязательном компоненте в патогенезе анаплазмоза. Клеточный состав в очагах кожной реакции на введение эритроцитов с анаплазмами (скопление гистиоцитов, эозинофилов, лимфоцитов, нейтрофилов и плазматических клеток в дерме) указывает на наличие реакции немедленного и замедленного типа (Н.И. Степанова, К.А. Казаков, В.Т. Заблоцкий и др., 1982; С.A. Carson, 1976).
Гуморальные антитела, по мнению К.И. Абуладзе и др. (1990), не имеют большого значения в предохранении от анаплазм. Ведущую роль в предохранении организма от анаплазм играет клеточный иммунитет (Н.И. Степанова, К.А. Казаков, В.Т. Заблоцкий и др., 1982). При экспериментальном анаплазмозе овец было выявлено, что на высоте паразитемии увеличивается количество В-лимфоцитов, количество Т-клеток снижается, а у спленэктомирован-ных животных наблюдается ингибиция иммунного ответа на уровне Т-клеток на всем протяжении заболевания (Т.Х. Рахимов, Т.А. Фаткулина, 1983).
Факторы клеточного неспецифического иммунитета при анаплазмозе изменяются в сторону активизации - повышение фагоцитарной активности лейкоцитов в период обострения анаплазмоза у животных (М.Э. Марданов, Р.У. Булханов, И.В. Ряснянский, 1986; Э.К. Шмунк, Р.У. Булханов, Т.Н. Шевченко, 1986).
Исследования по цитогенетическим изменениям у крупного рогатого скота при анаплазмозе ограничены единственным доступным нам сообщением о повышении индекса хромосомной изменчивости до 10,9 ± 1,6% по сравнению с контрольными животными. Индекс митотической изменчивости был незначительно увеличен. Тем не менее, отмечено, что в отдельных лимфатических узлах выявлено более значительное повышение митотической активности, хромосомной и геномной изменчивостей (Л.П. Островская, 1975; В.М. Лемеш, А.Г. Дрогун, В.Н. Якубов, В.М. Лучко, 1987). Кроме того, отмеченное выше возрастание числа телец Жолли (микроядра в эритроцитах) также указывает на наличие цитогенетической нестабильности у инвазированных животных.
Обобщая представленный материал можно сделать вывод, что при анаплазмозе исход заболевания во многом определяется функционированием иммунной системы инвазированного животного, большую роль в патогенезе заболевания играет аутоиммунитет. В то же время отдельные изменения свидетельствуют о сопутствующих цитогенетических нарушениях.
Цитогенетические исследования интактного крупного рогатого скота
Сущность микроядерного теста заключается в количественном подсчете эритроцитов с микроядрами на определенное число клеток. Оптимальное количество анализируемых эритроцитов, необходимое для учета микроядер и обеспечивающее достоверность и сходимость полученных результатов, зависит от генотипа организма и его видовой принадлежности (Л.Я. Перепечаев, Н.А. Новикова, Н.Н. Плотникова, 1987). Например, уровень эритроцитов с микроядрами на порядок выше у мышей, чем у человека, в силу более высокого развития у последнего ДНК-репарационных систем, а для достоверного анализа необходим учет 1-3 тыс. и 10-30 тыс. эритроцитов, соответственно (Н.Н. Ильинских, В.В. Новицкий, Н.Н. Ванчугова, И.Н. Ильинских, 1992; И.П. Бурлакова, 1993).
В экспериментах по стандартизации микроядерного теста для исследования крупного рогатого скота нами была подобрана группа из 15 клинически здоровых коров черно-пестрой породы 2,5-3-летнего возраста в благополучном по хроническим инфекционным заболеваниям сельхозпредприятии Томского района Томской области (СПК «Воронино»). Микроядра в эритроцитах крови животных подсчитывали 3-кратно в каждом мазке и анализировали на 1 000, 5 000 и 10 000 клеток, то есть каждый мазок просчитывали 9 раз.
Для выбора оптимального количества клеток, обеспечивающего наибольшую сходимость измерений, которая отражает близость друг к другу результатов измерений, выполненных в одинаковых условиях, то есть близость к нулю случайных погрешностей, использовали подсчет средней арифметической (X ± Sx) и коэффициента вариации (Cv) по 3-кратному исследованию каждого стекла по методике В.В. Власова (1988) (табл. 2-3). При этом средние величины частот эритроцитов с микроядрами, выраженные в промилле (%о), соответственно были следующими (табл. 3).
Представленные данные показывают, что наименьший коэффициент вариации, определяющий большую сходимость измерений, имел место при определении частоты эритроцитов с микроядрами на 10 000 клеток. Необходимо отметить, что наиболее значительное варьирование уровня микроядер наблюдалось при их подсчете в 1 000 эритроцитов. В последнем случае имели место даже достоверные уровни значимости (Р 0,003-0,001) различий показателей между первым, вторым и третьим измерениями (табл. 2).
В опытах по изучению возрастных различий частоты эритроцитов с микроядрами в крови крупного рогатого скота были исследованы 10 групп клинически здоровых животных черно-пестрой породы разного возраста: 1, 4 недели; 2, 4, 6, 12 месяцев; 2, 4, 6 и 8 лет, принадлежащих сельхозпредприятию Томского района Томской области (СПК «Воронино»), благополучному по инфекционным заболеваниям. Для учета эритроцитов с микроядрами анализировали 10 000 клеток в мазке крови, окрашенном по Романовскому-Гимза. Уровень эритроцитов с микроядрами выражали в промилле (%о).
Минимальный уровень эритроцитов с микроядрами зарегистрирован в крови 1-недельных телят - 0,03 ± 0,015%о. С 4-месячного возраста произошло скачкообразное повышение содержания эритроцитов с микроядрами до 0,52 ± 0,092%о, сохраняющееся с незначительными колебаниями у животных до 2-летнего возраста. У 4-летних коров отмечается дальнейшее увеличение уровня эритроцитов с микроядрами до 1,06 ± 0,082%о с последующим его незначительным снижением у коров более старшего возраста до 0,74 ± 0,067%о (табл. 4).
Между телятами трех групп до 2-месячного возраста достоверных различий показателей не отмечено. Выявлены достоверные различия по частоте эритроцитов с микроядрами телят до 2-месячного возраста с коровами старших возрастов. У телят 4-месячного возраста после скачкообразного повышения исследуемого показателя достоверные различия с животными старших возрастов наблюдаются только по 4-летним коровами. Незначительное снижение показателей у 12-месячных телят обусловило достоверность различий с животными 4-8-летнего возраста. По сравнению с животными всех групп достоверно более высокие значения имели коровы 4-летнего возраста, даже немного превышая показатели коров 6-8-летнего возраста Исследования по количественному изменению ЯОР интерфазных лимфоцитов крупного рогатого скота черно-пестрой породы разного возраста в онтогенезе проводили на животных, принадлежащих сельхозпредприятию Томского района Томской области (СПК «Воронино») благополучному по хроническим инфекционным заболеваниям. Были подобраны 9 групп клинически здоровых животных по 7 голов в каждой следующих возрастов: 10 дней; 4 недели; 2, 4, 6, 12 мес; 4, 6 и 8 лет.
Средние значения индексов ЯОР интерфазных лимфоцитов, рассчитанные по группам животных, показывают поступательное снижение показателей с 2,59 ± 0,08 (10-дневные телята) до 2,04 ± 0,04 (8-летние коровы) (табл. 6). При этом между телятами трех групп до 2-месячного возраста, аналогично частоте эритроцитов с микроядрами, достоверных различий не отмечено. Однако в последующем у упомянутых телят отмечены достоверные уровни значимости различий по показателям ЯОР с животными старших групп. Самые низкие показатели ЯОР у коров 8-летнего возраста имели достоверные различия с таковыми у телок младше 12-месячного возраста. Между коровами трех групп 4-8-летнего возраста достоверных различий по индексам ЯОР интерфазных лимфоцитов не отмечено (табл. 7).
Размах внутригрупповой изменчивости индекса ЯОР был незначительным, а коэффициенты вариации находились в пределах 2,7-8,5% (табл. 6).
Определенный интерес представляют выявленные закономерности распределение лимфоцитов с разным содержанием ЯОР в анализированных клетках. Установлено, что минимальное количество ЯОР у животных в интерфазных ядрах лимфоцитов крови равно 1, а максимальное — 9
Частота эритроцитов с микроядрами и индексы ядрышко-вых организаторов хромосом в интерфазных ядрах лимфоцитов крови крупного рогатого скота на разных стадиях лейкоза на фоне хронической анаплазмозной инвазии
Принципы разделения животных на группы в зависимости от стадии лейкоза крупного рогатого скота и наличия хронической анаплазмозной инвазии по сезонам года представлены в подразделе 2.1 «Материал и методы».
Анализ частот эритроцитов с микроядрами в крови показывает выраженные различия в показателях животных в зависимости от степени компрометации к лейкозу, в том числе, в связи с осложнением хронической анаплазмозной инвазией (табл. 13). При этом основные тенденции заключались в следующем:
1. весной отмечено поступательное увеличение показателей у животных в порядке «здоровые - инфицированные - гематологически больные лейкозом» как в 1-3 группах (инвазированные), так и в 4-6 группах (свободные от анаплазм). В этот период достоверные различия между животными обусловлены в основном повышенными показателями у гематологически больных коров. Однако у свободных от анаплазм коров отмечены достоверные различия между свободными от ВЛКРС (4 группа) и инфицированными ВЛКРС (5 группа). Среди инвазированных коров (1 и 2 группы) еще до появления анаплазм в крови достоверность данного различия стерта за счет повышения показателей у свободных от ВЛКРС животных 1 группы;
2. у животных всех групп, кроме 4 и 5, имело место повышение уровня микроядер в летний период. Достоверные различия были выявлены только у коров 2 группы (табл. 13, 14);
3. в летний период между животными 4-6 групп (свободных от анаплазм, но на разных стадиях лейкоза и свободных от ВЛКРС), наблюдалось отмеченное выше достоверное повышение уровня микроядер в зависимости от стадии лейкоза. При этом у животных аналогичных 1-3 групп (на разных стадиях лейкоза и свободных от ВЛКРС, но инвазированных анаплазмами) достоверные различия между свободными от ВЛКРС и инфицированными не выявлены по причине повышенного уровня эритроцитов с микроядрами у коров 1 группы.
4. в летний период частота эритроцитов с микроядрами среди свободных от ВЛКРС коров 1 группы (инвазированная) была достоверно выше по сравнению с животными 4 контрольной группы (свободная от анаплазм) (Р 0,05). Среди инфицированных ВЛКРС (2 и 5 группы) и гематологически больных лейкозом коров (3 и 6 группы) по разному скомпрометированных к анаплазмозу также наблюдается тенденция увеличения частоты эритроцитов с микроядрами у животных инвазированных групп 2. в летний период имело место достоверное увеличение индекса ЯОР у инвазированных анаплазмами коров 1 и 2 групп, у животных остальных групп данное повышение показателя было недостоверным;
3. в разгар периода активности клещей, как и в начале (весной), достоверность различий между животными разных групп обусловлена повышенными показателями у гематологически больных лейкозом коров (табл. 14);
4. наиболее стабильными были показатели индекса ЯОР интерфазных лимфоцитов у неинвазированных анаплазмами коров 4 и 5 групп (свободные от ВЛКРС и инфицированные);
5. увеличение индекса ЯОР происходило за счет перераспределения лимфоцитов - снижения количества клеток с 1 ядрышком и увеличение клеток с 3 ядрышками и более; при снижении индекса ЯОР имел место обратный процесс (табл. 13);
6. модальный класс лимфоцитов по числу ядрышек в интерфазном ядре не был четко дифференцирован и был разделен между клетками с 2-3 ядрышками. У гематологически больных лейкозом коров при увеличении индекса ЯОР выше 3,0 представительное число лимфоцитов имело 4 ядрышка в ядре (табл. 13).
Таким образом, представленный материал позволяет сделать вывод, что изменения рассмотренных цитогенетических показателей во многом были связаны со стадией лейкозного процесса. Кроме того, по частоте эритроцитов с микроядрами в крови достоверно прослеживается тенденция увеличения показателя у аналогичных по стадии лейкоза животных при осложнении хронической анаплазмозной инвазией, то есть при сочетанном течении лейкоза и анаплазмоза.
Изменения индекса ЯОР в интерфазных ядрах лимфоцитов и наличие достоверных различий между животными разных групп и по сезонам года при сохранении указанных тенденций были менее выраженными. Необходимо подчеркнуть, что коровы всех групп (даже 4 контрольной) имели достоверно более высокие значения ЯОР по сравнению с интактной группой коров аналогичного возраста на благополучной территории (раздел 2.2.3) (2,10 ± 0,02; Р 0,001). Возможно, это отражает общее повышение пролиферативной активности лимфоцитов, и является характерным признаков для коров в эн-зоотичной по лейкозу и анаплазмозу зоне.
