Содержание к диссертации
Введение
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Краткая характеристика инфекционного эпидидимита баранов (ИЭБ)...8
1.1 .Эффективность разных методов борьбы с ИЭБ 10
1.2.1. Замена неблагополучного поголовья 10
1.2.2. Массовая диагностика 11
1.2.3. Специфическая профилактика 17
1.2.3.1. Роль иммунитета 17
1.2.3.2. Вакцины 18
1.3. Заключение по обзору литературы 27
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 29
2.1. Материалы и методы исследования 29
2.2. Результаты исследования 30
2.2.1. Реактогенные, агглютиногенные и иммуногенные свойства вакцины из штамма 19 при конъюнктивальном методе введения в разных дозах
2.2.2. Реактогенные, агглютиногенные и иммуногенные свойства живых вакцин из штаммов В. abortus 19 и В. melitensis Rev-1 при конъюнктивальном применении в уменьшенных дозах в сравнении с инактивированной адъювант-вакциной из штамма В. melitensis Rev-1 37
2.2.3. Поствакцинальные реакции у баранов, однократно и многократно привитых вакциной из штамма 19 конъюнктивальным методом в дозе 4млрдм.к 55
2.2.4. Провоцирующие свойства различных вакцин при конъюнктивальном методе введения баранам неблагополучного по ИЭ хозяйства 61
2.2.5. Эффективность конъюнктивального метода иммунизации баранов вакциной из штамма В. abortus 19 в оптимальной дозе в системе противоэпиди-димитных мероприятий 66
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 68
4. ВЫВОДЫ 78
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 80
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 81
ПРИЛОЖЕНИЯ 109
- Массовая диагностика
- Реактогенные, агглютиногенные и иммуногенные свойства живых вакцин из штаммов В. abortus 19 и В. melitensis Rev-1 при конъюнктивальном применении в уменьшенных дозах в сравнении с инактивированной адъювант-вакциной из штамма В. melitensis Rev-1
- Провоцирующие свойства различных вакцин при конъюнктивальном методе введения баранам неблагополучного по ИЭ хозяйства
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время в РФ в целях специфической профилактики инфекционного эпидидимита баранов /ИЭБ/ официально регламентировано однократное применение вакцины из штамма B.melitensis Rev-1 подкожно в дозе 2 млрд. м.к. Однако рядом авторов убедительно доказано, что оно не обеспечивает надежного оздоровления отар, неблагополучных по этой болезни. При этом ими была дополнительно предложена реиммунизация животных конъюнктивально в уменьшенной дозе (100 млн.м.к.) Такая схема обеспечила формирование достаточно напряженного иммунитета у баранов против ИЭБ [11, 73, 151].
Однако, известно, что у вакцинного штамма B.melitensis Rev-1 сохранился весьма высокий уровень инвазивности, реактогенности и остаточной вирулентности, нередко приводящий на практике к многочисленным издержкам, наиболее серьезная из которых - возможность инфицирования людей [227]. В этой связи актуальна проблема изучения перспектив изготовления из этого штамма иммуногенной убитой вакцины с использованием адъювантов [13].
Вместе с тем, отдельные публикации содержат экспериментальные и практические данные, аргументирующие возможность использования для специфической профилактики ИЭБ живой вакцины из наименее инвазивно-го, реактогенного и вирулентного штамма В. abortus 19 в дозе 40 млрд. м.к. подкожно [30, 146]. Но есть и сообщения о возникающих при этом осложнениях у привитых животных в виде хромоты у 65%, а у некоторых - эпидидимита, и даже выделения вакцинного штамма со спермой [212,215, 217].
Для специфической профилактики бруцеллеза мелкого рогатого скота предложен конъюнктивальный метод иммунизации маточного поголовья вакциной из штамма 19 в дозе 4 млрд. м.к. При этом получены экспериментальные и практические данные, свидетельствующие об его высокой эффективности [41, 42, 87, 122]. В этой связи логично утверждать о возможных
5 перспективах использования для специфической профилактики ИЭБ вакцины из штамма 19 при конъюнктивальном методе введения в уменьшенных дозах.
Однако сведения о реактогенности, иммуногенности, агглютиногенно-сти, а также провоцирующей способности этой вакцины при данных условиях применения отсутствуют, что и определило цель и задачи исследований. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Изучить эффективность конъ-юнктивального метода иммунизации баранов вакциной из штамма В. abortus 19 в уменьшенной дозе.
При этом в задачи исследований входило:
Изучить реактогенные, агглютиногенные, иммуногенные и провоцирующие свойства вакцины из штамма 19 при конъюнктивальном методе применения в сравнении с вакциной из штамма Rev-1.
Провести оценку эффективности конъюнктивального метода иммунизации баранов вакциной из штамма В. abortus 19 в оптимальной дозе в системе противоэпидидимитных мероприятий.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В экспериментальных и производственных условиях при ИЭБ доказана высокая эффективность конъюнктивального метода иммунизации баранов вакциной из штамма 19 в дозе 4 млрд м.к. по сравнению с вакциной из штамма Rev-І (живой и инактивированной).
При подкожном введении баранам убитой адъювант-вакцины из штамма Rev-І установлено (независимо от количества микробных клеток в дозе) местное проявление реактогенных свойств в виде болезненных припухлостей, абсцессов и т.п., а также сохранение у большинства привитых животных высокого уровня бруцеллезных антител в течение всего срока наблюдений.
Для иммунизации баранов против ИЭБ определена оптимальная доза живой вакцины из штамма 19 на основании обеспечения практически равного уровня иммунитета, и более быстрого угасания бруцеллезных антител, чем при введении максимальной дозы.
Доказан провоцирующий эффект вакцин из штаммов 19 и Rev-І, позволяющий при серологическом исследовании в РСК и РДСК сывороток крови баранов неблагополучной по ИЭ отары на 14 и 21 дни после иммунизации конъюнктивальным методом дополнительно выявлять значительное число инфицированных животных.
Установлен противоэпизоотический эффект при ИЭБ двукратной с интервалом один год иммунизации баранов вакциной из штамма 19 конъюнктивальным методом в дозе 4 млрд м.к. в сочетании с использованием рациональной поствакцинальной диагностики.
На способ специфической профилактики инфекционного эпидидимита баранов получено решение ФГУ ФИПС о выдаче патента РФ на изобретение.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Полученные экспериментальные и практические данные, доказывающие высокую эффективность при ИЭБ конъюнктивального метода иммунизации баранов вакциной из штамма 19 в дозе 4 млрд. м.к., в сочетании с рациональной диагностикой, в том числе основанной на использовании провоцирующих свойств вакцины, открывают возможности для его широкого внедрения в системе противоэпи-дидимитных мероприятий, что обеспечит надежное и быстрое оздоровление овцеводческих хозяйств от этой болезни.
АППРОБАЦИЯ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Основные положения диссертации доложены на IV, V межрегиональных научно-практических конференциях ГНУ ВНИИБТЖ (Омск, 2005, 2006 гг.); на XI научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов ФГОУ ПО ОмГАУ (Омск, 2005 г.), на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИБТЖ (2004 - 2005 гг.).
Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном совещании сотрудников ГНУ ВНИИБТЖ (2006 г.).
7 ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 107 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы, приложений.
Диссертация иллюстрирована 13 таблицами, 9 рисунками. Список литературы включает 249 источников, из них 169 - отечественных, 80 - зарубежных авторов.
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ. Система противо-эпидидимитных мероприятий с использованием конъюнктивального метода иммунизации баранов вакциной из штамма 19 внедрена в ОАО «Чистов-ское» Омской области. На основе результатов исследований разработан проект «Временное наставление по применению вакцины живой сухой из штамма 19 бруцелла абортус конъюнктивальным методом при инфекционном эпидидимите баранов (в порядке широкого производственного испытания)», рассмотренный и одобренный ученым советом ГНУ ВНИИБТЖ (протокол № 4 от 6 апреля 2006 г.).
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
Результаты изучения реактогенных, агглютиногенных, иммуногенных и провоцируюших свойств вакцины из штамма 19 при конъюнктивальном методе применения, в том числе в сравнении с живой и убитой вакцинами из штамма Rev-1.
Материалы, доказывающие эффективность конъюнктивального метода иммунизации баранов вакциной из штамма В. abortus 19 в оптимальной дозе в системе противоэпидидимитных мероприятий.
Массовая диагностика
Вторая мера, направленная на исключение из эпизоотической цепи источника возбудителя инфекции - диагностика в целях выявления и изъятия зараженных животных из неблагополучной отары, регламентированная инструкцией о мероприятиях по профилактике и ликвидации инфекционного эпидидимита баранов (1992).
Со времени открытия возбудителя [182, 238] многими исследователями изучались различные методы и способы диагностики инфекционного эпидидимита баранов.
На данный момент диагностика заболевания овец, вызываемого B.ovis, основывается на клиническом, серологическом, аллергическом, методе провокации антител, бактериологическом, биологическом методах исследования животных с учетом эпизоотологических данных и патологоанатомических изменений.
Клинический метод. В литературе еще задолго до открытия возбудителя ИЭ имелись сообщения об орхито-эпидидимитах у баранов [9, 10, 89, ПО, 123, 152]. Установлено, что ИЭБ может проявляться в острой и хронической формах [3, 18, 19]. Больных выявляют методом пальпации семенников и их придатков. По имеющимся данным [147], орхито-эпидидимиты у баранов, аборты и яловость у овцематок, случаи рождения нежизнеспособных ягнят не являются специфическими. Часто они не совпадают с результатами исследований сывороток крови животных в РДСК и не могут характеризовать эпизоотическую обстановку в хозяйстве. Следовательно, клиническое обследование семенников и придатков с дополнительной проверкой спермы может служить только вспомогательным методом в диагностике ИЭБ. Серологические методы. В настоящее время в ветеринарной практике нашей страны приняты следующие серологические методы диагностики ИЭБ: РДСК, РСК, РА, РИГА, РНАт, РИД, РИФ, ИФА. В отличие от клеточных реакций, с помощью гуморальных тестов представляется возможность с большей достоверностью производить не только качественные, но и количественные измерения. Наиболее полная картина гуморальной реактивности организма может быть при применении широкого набора серологических тестов. При этом с помощью соответствующих антигенов представляется возможным выявить свойства антител, их иммуногло-булиновые изотипы. Динамика синтеза иммуноглобулинов и их угасание идут в определенной последовательности. Это подтверждает ряд авторов как в нашей стране [23,99, 119], так и за рубежом [4, 21, 135, 214]. Реакция длительного связывания комплемента (РДСК) Наряду с всеобщим признанием РДСК/РСК (во многих случаях по своим показаниям дополняющие друг друга до 5-9% и более), как основного метода серологической диагностики ИЭБ, материалы экспериментальных и производственных испытаний показывают, что многие животные с отрицательной РДСК могут являться бруцеллоносителями [35, 60, 84]. Это, как отмечают исследователи, связано с особенностью инфекционного процесса, на разных стадиях которого синтезируются антитела (Ig) различного свойства.
Реакция агглютинации (РА). Известно, что возбудитель ИЭБ находится в природной R-форме и лишен поверхностного оболочечного слоя S-антигена. Долгое время РА для диагностики ИЭБ считали неперспективной из-за нередко наблюдаемого феномена самоагглютинации, связанного с биологическими особенностями возбудителя [27, 218, 234, 238, 243].
В 1980 году А.Ф. Руденко испытал новый более стабилизированный антиген из штамма B.ovis УНИЭВ и получил положительные результаты. Уже на 4-й день после заражения баранов в сыворотке крови были обнаружены антитела (1:320), но к 14-му дню реакция выпадала.
Поиски нового, более чувствительного антигена для РА продолжались. В 1976 году совместно ИЭВСиДВ -НИИБТЖ был разработан овисный антиген цветной (ОАЦ), исключающий явление самоагглютинации [35]. Специфичность РА с ОАЦ установлена при исследовании сывороток крови от баранов 13 проиводителей и овцематок, как интактных, так и искусственно зараженных
B.ovis [69]. Благодаря четкости, простоте постановки и экономической доступности реакция агглютинации с ОАЦ была включена в качестве официального метода в Наставление по диагностике ИЭБ (1991). Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Данные литературы свидетельствуют о высокой чувствительности РНГА по сравнению с другими иммунологическими методами [24, 25, 37, 113]. Возможность использования РНГА при инфекционном эпидидимите баранов впервые показали D. Ris, Т. Punga [235], которые для сенсибилизации нативных эритроцитов барана использовали принцип S. Boyden (1951). Антигеном в их исследованиях служил экстракт, полученный путем дезинтеграции клеток B.ovis ультразвуком. При этом D. Ris [232] отметил в качестве обязательного условия необходимость изготовления диагностикума путем сенсибилизации нативных эритроцитов антигеном непосредственно перед каждым исследованием, что является весьма трудоемким процессом.
Реактогенные, агглютиногенные и иммуногенные свойства живых вакцин из штаммов В. abortus 19 и В. melitensis Rev-1 при конъюнктивальном применении в уменьшенных дозах в сравнении с инактивированной адъювант-вакциной из штамма В. melitensis Rev-1
В задачу эксперимента входило сравнительное изучение реактогенных и агглютиногенных свойств живых вакцин из штаммов В. abortus 19 и В. melitensis Rev-1 при конъюнктивальном применении в уменьшенных дозах в сравнении с инактивированной адъювант- вакциной из штамма В. melitensis Rev-1 при подкожном применении в разных дозах.
В целях повышения иммуногенности инактивированной вакцины нами был испытан адъювант под условным кодовым обозначением 6510, полученный из ВНИИ защиты животных (г. Владимир), на основе которого и были приготовлены два варианта инактивированной вакцины из штамма В. melitensis Rev-1: в дозах 50 и 500 млн. м.к. Мотивацией к такому варианту использования препарата послужила наметившаяся тенденция к применению инактивирован-ных вакцин.
Эксперимент проводили на 80 баранах, которых разделили на четыре группы.
Группа 1 (20 гол.). Животных вакцинировали конъюнктивально вакциной из штамма В. melitensis Rev-1 в дозе 100 млн. м.к.
Группа 2 (20 гол.). Бараны привиты подкожно инактивированной вакциной из штамма В. melitensis Rev-1 в дозе 50 млн. м.к. с адъювантом 6510.
Группа 3 (20 гол.). Животных иммунизировали подкожно той же инактивированной вакциной, но в дозе 500 млн. м.к. с адъювантом 6510. Группа 4 (20 гол.). Животных вакцинировали конъюнктивально вакциной из штамма В. abortus 19 в дозе 4 млрд. м.к.
Проявление реактогенности препаратов при разных способах иммунизации отслеживали клиническим методом (температура, пульс, дыхание, аппетит, общее состояние, местные изменения). Никаких отклонений от нормы в группах 1 и 4 в течение 10 дней не отмечено. Вместе с тем в группах 2 и 3 у 20% и 35% животных соответственно к концу опыта (250 дней) на месте введения вакцины сохранялись воспалительные отеки размером от 2 до 5 см с образованием абсцессов и свищей.
Поствакцинальные серологические реакции отслеживали с применением РА и РСК с бруцеллезным антигеном и РДСК с овисным антигеном до предельного титра, а также РИД с О-ПС антигеном. Исследования животных проводили на 30,60, 90,120,180,210 и 250 дни после иммунизации.
В таблице 3 приводятся результаты серологических исследований, которые показывают, что в группах 1 и 4 поствакцинальные реакции выражены слабо. Так в первой группе в РА реагировало только на 60-й день 26,7% животных в не высоком титре - 43,8 ME, а в РСК - на 30-й день 5,9% в титре 1:10. В группе 4 агглютинины регистрировались в течение 60-и дней у 7-13% с титром в пределах 35-25 ME, а комплементсвязывающие антитела - до 90-го дня у 7 -20 % с резким угасанием титра с 1:50 до 1:7,5.
Что касается РИД, то эта реакция на всем протяжении опыта в обеих группах не регистрировалась.
Совершенно иные результаты серологических исследований были получены в группах 2 и 3, где животные были привиты адъювант-вакциной. Здесь в обеих группах у животных отмечалась активная продукция противобруцеллез-ных антител и длительная их персистенция. Так, в группе 2 при дозе 50 млн. м.к. РА проявлялась у 50-100 % животных в титрах 80-250 ME, РСК - соответственно у 66-100 % со средним титром 1:33-1:190. В высоких титрах антитела продолжали сохраняться на всём протяжении наших наблюдений (250 дней).
Провоцирующие свойства различных вакцин при конъюнктивальном методе введения баранам неблагополучного по ИЭ хозяйства
Параллельно с изучением реактогенных, агглютиногенных и иммуно-генных свойств вакцины из штамма 19 проводились исследования по выявлению способности препарата вызывать провокацию специфических овис-ных (R-) антител у баранов - скрытых носителей возбудителя ИЭБ.
С этой целью подобрали хозяйство в Курганской области, неблагополучное по ИЭБ, но благополучное по бруцеллезу мелкого рогатого скота. Перед постановкой опыта всех баранов (149 гол.) исследовали комплексно: серологическим (РСК, РДСК со стандартным овисным антигеном) и клиническим методами. При этом выявили 21 (14,1%) больного барана. От трех реагирующих баранов бактериологически исследовали семенники (после кастрации), в одном случае выделили культуру В. ovis. Больных изолировали, а остальных по принципу аналогов разделили на три группы. Животных первой группы иммунизировали вакциной из штамма 19 конъюнктивально в дозе 4 млрд. м.к., второй - вакциной из штамма Rev-І также конъюнктивально в дозе 100 млн. м.к. и третьей (контрольной) - не вакцинировали до конца наблюдений.
Сыворотки крови от всех животных на 14-й и 21-й дни после прививки исследовали в РСК, РДСК с овисным антигеном.
Результаты исследований показали, что в обеих опытных группах на 14-й и 21-й день после иммунизации, независимо от свойств вакцины, отмечали значительное увеличение количества выявляемых в РСК и РДСК животных. Из таблицы 11 видно, что на 14-й день после введения вакцины из штамма 19 выявлено 22,6% реагирующих, а после иммунизации штаммом Rev-І- в два раза меньше (только 9,8%). Аналогичная тенденция отмечена и при исследовании животных на 21-й день после вакцинации: в группе привитых штаммом 19 реагировало 28,3% баранов, а штаммом Rev-І - 21,5%. Указанные показатели превышали таковые по контрольной группе животных, не подвергавшихся иммунизации: в группе животных, привитых вакциной из штамма 19 - на 14 день в 5,4 раза, на 21 день - в 3,4 раза; в группе животных, привитых вакциной из штамма Rev-І - в 2,3 и 2,6 раза соответственно.
На 21-й день реакции сохранялись (таблица 12) после введения вакцины из штамма 19 у 50,0% животных, после иммунизации штаммом Rev-І- у 80,0%. К указанному сроку серологические реакции дополнительно проявились соответственно у 17,0 и 13,7% животных из числа исследованных.
Провоцирующие свойства вакцины из штамма 19 оказались в 1,7 раза более выраженными, чем у вакцины из штамма Рев-1.
По чувствительности из разных методов серологической диагностики для обнаружения животных с латентной формой ИЭ с использованием феномена вторичного иммунного ответа, на первое место выступила РСК, значительно превосходя РДСК при исследовании животных в оба срока.
Эпизоотическая опасность животных-бруцеллоносителей, спровоцированных с помощью вакцины из штамма 19, подтверждена в 50% случаев результатами бактериологического исследования с применением биопробы на морских свинках.
Таким образом, доказана целесообразность использования при специфической профилактике инфекционного эпидидимита баранов вакциной из штамма 19 метода провокации антител с выявлением больных животных с латентной формой ИЭБ с помощью комплекса РСК и РДСК на 14-21 дни после иммунизации.
