Введение к работе
1.1. Актуальность темн. Экология микроорганизмов во внешней среде является новій, теоретическим нанравлениен в иикробнологкчесіяй науке. Оно вгагает в себя различные аспекта поведения иикробной популяции во внешней среде,обеспечивайте устойчивость, віаиваеиость и размножение в ней микроорганизмов.
Для ветеркнарии.особенно для ветериирно-санитарной науки.особый интерес представляет исследования.связанные с поведением во внешней среде патогенных для сельскохозяйственных кшотных микроорганизмов.
Используя оригинальные методы и прецизионное оборудование, в напей стране впервые были выполнены работы,раскрывавшие шюгие аспекты экологии во внеиней среде популяций таких патогенных бактерий, какгиерси-иий, салышнелл, грибов кандида, микобактерий.-возбудителей туберкулеза ( Й.Б.Павлова и др., 1990, А.В.Криковский и др., 19Э0.Т.Г.Путина. 1989, К.а.Лїентекирова,1990,н.И.Касьяненко.1992). Было установлено много характерных морфологических изменений в популяции кикроорганизков.инекдос кесто при воздействии на них биотически и абиотических факторов внегней средн.а такзе в процессе естественного роста и развития.
Одцако.следует подчеркнуть,что результат вызеуказанных исследований нельзя экстраполировать іа все иикроорганнзш.особенно на спорообра-зущие. Последние занимает особое место в инфждоонной патологии с\х гм-вопЕх.а их вютваеиость и устойчивость во вневней среде создает трудности в борьбе и профилактике вызванных ими заболеваний. Наименее изученной кз этого сеиейства микроорганизмов, является экология спороооЗ-разувзих возбудителей болезней пчел.в частности- B.alvei.
Данный микроорганизм является одним из возбудителей европейского гнильца пчел - инфекционного заболевания.распространенного во всех регионах мира и наносяжего больвой уцерб пчеловодству.
Со вреши опфытнз данного заболевания С 1827 г.) инфекция не
. 4 -
только ограшчнлась европейским регионои, но распространилась но всей континентам кира,нанося больвой экономический ущерб пчеловодству.Установлено,что пгильцовая сеиья на добирает в среднем 24-36.62 кеда, количество воска в больных семьях снимется в 2 раза, количество пчел (рои. отводки) уменъкается в 3-7 раз по сравнении со здоровой пчелиной семьей. Количество расплода, выкармливаемого весной в больных семьях, сокращается на 34-45* (О.Ф.Гробов и др..1992).
В зтой связи очевидно, что борьба и профилактика европейского гнильца пчел будет малоэффективной без фундаментальных знаний экологии его возбудителей во внешней среде, и преаде всего B.alvei, который является, в отличии от других возбудителей данной инфекции (Str.pluton, Ent. ) спорообразуявдм микроорганизмом. Очевидно,что именно устойчивость этого микроорганизма во внешней среде,его характерные биологические особенности будут определять в конечном итоге подбор дезинфи-цирцвди средств и режима дезинфекции при европейском гнильце пчел.
Учитывая вазнуш роль B.alvei в этиологии европейского гнильца пчел, повсеместное распространение этого инфекционного заболевания, больвой экономический урон, наносимый им пчеловодству, изучение экологии B.alvei во внешней среде латается актуальной проблемой ветеринарной микробиологии,санитарии и гигиена.
І.2. Цель и задачи исследований. Цель диссертационной работа-изучить экология B.alvei во внекней среде, т.е. взаимоотношения популяции данного кикроорганюыа с внеяней средой, обусловливающие его внзиваеиость, развитие и возможность разиюзения.
Дня выполнения указанной цели в диссертации били поставлена следуэ-цие задачи:
-
Провести изучение корфолегим. культуратло-биохишческих свойств, чувствительности к антибиотикам и виживаємости на различных объектах внекней среды B.alvei.
-
Исследовать на погщляционноа уровне субшкроскопическуз организа-
- о -
цив B.alvei.
-
Изучить морфологические acneimi адгезии B.alvei га объектах внся-ней среды и определить его антагонистические свойства к некоторым патогенным бактериям,
-
Провести исследование популяции B.alvei при воздействии абиотических факторов внепиеи среды (высокой температуры и дезинфицирдаих средств).
Работа выполнена в соответствии с программой работ ВНИИВСГЗ по ре-еєниш основных научно-технических проблем в период с 1991 - 1994 г.г.
1.3. Нацчная новизна. В результате проведенных исследований впервые: - изучены на популяционном уровне морфология и субыикроскопи-ческая организация вегетативных клеток и спор B.alvei;
-установлено, что B.alvei не только длительно вазивает на обт>-ектах вневней среды, но при наличии соотзетствундего субстрата, может адгезировать к неиу.разкноваться и формировать никроколонии. окруженные развитыа покровом;
изучены некоторые аспекты кеханизма неспецифической адгезии спор B.alvei и ее зависимость от рН окружаицей среды и температуры;
с прикенением иегода электронной микроскопии установлено,что при неблагоприятных условиях (старение культуры,длительное нахокдение во знезней среде) не происходит 1(Ш-ного спорообразования.Часть популяции остается представленной вегетативным клеткани,находящимися е различных стадиях гетероиорфного роста.характерного для L-трансфораации неспорооб-разущих бактерий:
определено влияние активации спор на их устойчивость к де-зинфсктанта». Впервые установлена антагонистическая активность данного микрорганизма к E.coli. S.typhiBurim. Р.vulgaris, Y.enterocolitica. Рг.вогвапіі. Klebsiella, St.aureus, параметры которой обсчитаны морфо-денситометрическим методом с применением компьютера.
. 1.4. Практическая ценность. Показано,что система индикаторных бумажек (СИБ), серийно выпускаемых отечественной прошиїсниостьв для идентификации бактерий семейства Enterobacteriacea.&raeT бать иснользозана для индикации биохимических свойств B.alvei.
Установлены сроки выживания B.alvei на различншс объектах пчеловодства, определена устойчивость возбудителя к антибиотикам,высокой температуре и дезиифектантаа. Тем самым, дано научное обоснование о возиоанссти вкяЕчения B.alvei в группу высокоустойчивых возбудителей инфекциснгеи заболеваний (четвертуя группу) в действующей инструкции ("Проведение ветеринарной дезинфекции объектов Ешотноводства",Н.,1383).
Результати экспериментов,установивше енжение устойчивости спор B.alvei к дезинфектантаи за счет инициации их прорастаїшя (кратковременное прогревание),иогут быть использованы для разработки нового,эффективного режима дезинфекции при европейской гнильце пчел (за счет снигєниа зкепозиции и уменьшения расхода дезинфицирущих средств). Кроие этого, данные эксперименты давт научное обоснование дврступенчатоЯ (двухкратной) дезинфекции при данной инфекции.
Учитывая, что B.alvei не считается патогенным для теплокровных еи-вотиых и человека, выявленные нами антагонистические свойства этого кик-роорганизьа в отиошши кавечной палочки, сальыонелл. протея, иерсиний, провиденции, клебсиелл и золотистого стафилококка, иогут найти после дополнительных исследований соответствуйте практическое пршенєшє в ветеринарии и медицине.
Материалы диссертации Вали использованы в цикле лекций по падевой пгиене и экологии для студентов 5-го курса ветеринарно-саюгтарного факультета Московского института прикладной биотехнологии.
1.5. нпробация полученных результатов. По материалам диссертации сделаны сообщения:
і.На национальном Конгрессе греческой ветеринавно-иедицинской ассоциации (ІВ - 23 ноября 1993 г.,г.йфины).
2.На секинаре Московского обцестю пчеловодов (МОП).г.Москва. 1994.
-
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 5 статей.
-
Стрцкт'іра и обгем диссертация. Диссертация состоит из введения, обзора литературы.собственных исследований,обедадения,полученных результатов, выводов и списка использованной литературы.
Диссертация излоаена га 133страницах машинописного текста.содергат 7 таблиц! график,5 диаграим и74 злектронлограммСрисунгав).Список литературы включает 40 источников отечестве! шх и 39 иностранных авторов.
2.1. Материалы и методи исследования.
Экспериментальная работа выполнена в лаборатории санитарной микробиологии и санитарии в пчеловодстве Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии.гигиены и экологии в 1991-1934 г.г.
В опытах были использованы 3 втаииа B.alvei:H20r,N5 и Н104. полученные из лаборатории санитария в пчеловодстве ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.
Все изученные втаюм били идентична по иорфологии и культу, іль-но-биохимическин свойствам. В опитах использовались вегетативные клетки и споры B.alvei.Пазки крьтуры окраиивали на споры по И.В. Певкову (І955) и просматривали под световым микроскопом. При завервении спорообразования (90Z спор в микробной популяции) проводили смыв культуры B.alvei холодным вюиояогичесгам раствором и доводам их концентрации до 10? Полученнуи взвесь спор хранили в холодильнике при +4#С и использовали'во
всех последуацих экспериментах. При изучении поведения популяции B.alvei на различных объектах вненней среды С дерево, кетшш, бязь, воліла и пенопласт,а такге в воде),использовали общопригатув в ветеринарии кетодкку (ft.Л.Поляков.1369)
Морфологии бацилл изучали в световой ыикроскспс (Biolar Pi, Польша) в иазках, а такае в препарате моюслойюй культуры.В процессе роста микрокультуры B.alvei производили фотосьеы]<у в световом микроскопе.Биохимические свойства B.alvei изучали на дмюеретрнлыю-даигаостических средах с углеводааи,на пластювд для биохимической дифференциации знтеро-бактерии (ПБДЗ) и на системе индикаторных буьшик (СИБ) для идентификации никроорганизнов семейства Knterobacteriaceae.
ннтагаыстические свойства B.alvei испытали на следующих культурах івироргагоемоа: Stapiiylococois aureus tnam 203-P; Escherichia coli нтаым В; Proteus vulgaris вташі 0-21; Yersinia enterocolitica итаиа 08 (получены в ИЗМ иы.Н.Ф. Гаыалеи РАМН ); Providuncia uorganii; Klebsiella pneumoniae референс-итаьш (получен ю Швеции); Salmonella typhiEuriua (выделен от больной птицы кандидатом ветеринарных наук Я.И. Касъяненко). Все указанные стамаы наели типичные культурально-биохимические свойства.
Для изучения антагонистического эффекта и изменения морфологии микроорганизмов в популяции использовали киллипоровые фильтры,на которых выращивали культуру продуцента,а затем после его удаления высевали тест-культура.Количественное определение антагонистического эффекта проводили методой кошшвтерной ыорфоденситоиетрической скстеш "Дда-иорф".програаиі GIK0-Z0 (И.Б.Павлова.с соавт.,1934).
Изучение чувствительности к антибиотикам проводилось методом диффу-зки в агар с использованиеи букаашх дисков по методике,утвергденной Мкнзравоа СШЧІ983).
Изучение нзспєцифачзсіазй адгезии на поверхности дерева и на теле личинки пчелы,а таїсе влияние различных значений рН и теипературы на адгезия) спор B.alvei проводили га капроновых китах по ыетодике,разработанной в лаборатории санитарной кикробиологиии ВіШИЕСГЗ ( А.В.Куликовский,
И.Е.Павлова.1993).
Определение бактерицидной активности дезинфицирцщих средств осуществляли методом диффузии в агар (В.И.Вашлз,1Э77).По данной методике была изучай устойчивость B.alvei к препаратам Buraton F10 и Lysovet (Германия).
Определение динамики гибели споровой популяции B.alvei при воздействии дезишрицирущих средств проводили по ыетодике, рекомендованной ВОЗ (1981).
Устойчивость B.alvei к дезинфсктаитам определяли на бязевых тестах (Й.Ооляков.1975).По данной методике бша испытана устойчивость к препаратам, полученным из лаборатории дезш«екции ВПИИВСГЗ (N2,N3. Для изучения устойчивости спор B.alvei к температуре 80 С использовали иетод, аналогичный предлоіенноиу ВОЗ для испытания дезинфицирдвдих средств(1981). Для злектронномикроскопического изучения целых (интактных) бактериальных клеток их фиксировали на медной подпоите с формваровой пленкой в парах 2Ж-ШГО глутарового альдегида в течение 20 кинут.Капельный диализ проводили по методике н.С.Тихоненко и И.н.Беспаловой (1SG1). Полученные препараты после напыления углем просматривали в электронном микроскопе "Hitachi-800". При приготовлении препаратов для исследования популяции B.alvei в сканирувщеи и трансмиссионном микроскопе использовали иетод, предложенный И.Б. Павловой и Н.П. Тарабукиной (1983).Заливку осуществляли в рпли-мерные смолы. їльтратоккие срезы получали на ультратоме "LKB-4800" (Езе-цкя), с помоги стеклянных нозей. Ноет готовили на приборе "Knife Haker - 78018, LKB" (Івеция).Для контрастирования препаратов использовали лимоннокислый цитрат свинца по Reynolds 1963).Съекку объектов проводили на электронном микроскопе "Хитачи-800" со сканирущей приставкой "Hitachi -ШОЧЯпоння).Похожие диссертации на Некоторые аспекты экологии Bacillus alvei
