Введение к работе
Актуальность работа. Инфекционная патология с синдроыоы острой диареи продолжает оставаться проблемой как для медицины, тах и для ветеринарии. Из I миллиарда ежегодно заболевающих детей 3 миллиона уйнрают (Херсон Ы.Х., 1990; Chavaeae D.c. , 1994). Согласно научным данным, основными этиологическими агентами здесь являются vibrio choierae я Escherichia esli. Несмотря на достигнутые успехи в изучении патогенеза а патофизиологии холеры я ка снижение случаев летального исхода благодаря превентивному лечению, она продолжает беспокоить человечество сведениями о спорадических случаях, заболевания» либо пандемиях.
Особую озабоченность у медиков вызывает проявление кишечной палочкой новых инфекционных свойств (Пайков В.А., 1994 ; Bettelbeim К.А., 1990; Siifonen А., 1994; Blanco I.В. , 1996). Неблагополучной остается по эшервхяозам статистика в ветеринарии, где регестрируется до 40 % случаев заболеваемости (Celemin С, 1995 ; Нипов м.# 1996). Особенно уязвимыми оказываются молодые особи, для которых характерен летальный исход болезни (Новак Д.Д., 1995; Vray С, 1984), в связи с чем сельское хозяйство, и звероводство в том числе,' терпят значительные убытки (Евглевский А.А., 1995; Новак Д.Д., 1995; Iorgeneen н., 1996). Причиной этого является широкое распространение различных факторов патогенності в популяциях эшерихий, основную роль среди которых играют токсины (Вертиев Ю.В., 1991, 1996 ; Оуіеа С.Ь., 1971 ; Bofcreouhe I., 1980; Celemin С, 1995). Речь идет о термолабильном (ЛТ), термостабильном (СТ) и шига-подобном (3LT) энтеротоксинах, из которых доля первого в острых кишечных заболеваниях достаточно значительна (Вертиев Ю.В., 1984, 1987 ; Петровская В.Г., 1990; German! Y., 1988).
В связи с распространенностью инфекций, вызванных в.coll, синтезирующих в кишечнике человека или животных ЛТ-белок, актуальним на сегодняшний день является разработка способов защиты макрооргаянзма от данной токсической функции бактерий (Сидоров М.А., 1984). И в первую очередь необходимы новые подходы к получению очищенных препаратов энтеротоксина, как исходного материала для разработки диагностических и лечебно-профилактических средств (Смирнов Г.Б., 1984 ; Tinkeletein Е., 1990; Неп-doza-Vega О., 1995).
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работа является разработка эффективных способов получения препаратов полноразмерного термолабильяого антеротоксияа зшерихяй ж его рецепторной части (В-субъединицн).
Для достижения поставленной цели необходыо было решить следующие задачи:
-
отработать условия культивирования рекомбинантных штаммов-продуцентов полноразмеряого токсина и его рецепторной частя с целью получения биомассы, обогащенной искомыми белками ;
-
определить эффективные методы выделения IT и В-субъеди-ницы из бактериальных клеток;
-
исследовать возможность использования нммуноафинной хроматографии для получения очищенных препаратов ЛТ и В-субъеди-ницн в активной форме.
Научная новизна. В качестве продуцентов термолабильного энтеротоксина эшерихий и его рецепторной субъединицы в работе впервые использованы рекомбинантные штаммы, для которых экспериментально определены оптимальные условия культивирования.
С учетом локализации термолабильного энтеротоксина в бактериальных клетках в серии сравнительных опытов впервые доказана эффективность и доступность экстракции голотоксина и его рецепторной части мочевиной (как способ получения лизатов бактерий) .
Впервые апробирован метод очистка голотоксина и его субеди-нжцы В, основанный на аффинных свойствах голубой агарозы (ГА), обеспечиваопдай получение из биомассы продуцентов препаратов, обогащенных белками с нативными свойствами.
Доказана возможность использования этих препаратов для иммунизации животных с целью получения антисывороток и иммуносор-бентов.
Показана реальная возможность одноступенчатой очистки токсина н его рецепторной чаем с помощью иммуноаффинной хроматографии с использованием в качестве лигандов поли- и монокло-яальных антител.
Практическое значение работы. Разработана технология выделения и очистки препаратов термолабильного энтеротоксина эшерихий, пригодных для создания диагностикумов, специфических профилактических и лечебных средств.
Апробация "работа. Основные положения диссертации доложены на конференции молодых ученых, состоявшейся в Московской ветеринарной академии имени К.И.Скрябина (1988 г.), юбилейной конференции, посвященной 65-летию создания научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства имени А.В.Афанасьева (1997 г.), на совещаниях сотрудников отделов и лабораторий НИИПЗиК им.А.В.Афанасьева (І99І-І997 гг.).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, рекомендаций по использованию научных вызодов, сведений о практическом использовании результатов исследований, списка литературы, включающего 235 источников, в том числе 165 иностранных авторов, приложения. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, 7 рисунков, 9 фотографий, 2 графика.