Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8.
1.1. Краткая характеристика эймерий кур 8.
1.2. Роль нормальной микрофлоры кишечника 14.
1.3. Применение препаратов нормальной микрофлоры кишечника для предупреждения дисбактериозов и профилактики бактериальных болезней птиц 23.
1.4. Влияние возбудителей кишечных инвазий на нормальный микробиоценоз кишечника 27.
1.5. Влияние лекарственных препаратов на индигенную микрофлору кишечника.. 32.
2. Собственные исследования 36.
2.1. Материалы и методы исследования 36.
2.2. Влияние E.tenella на уровень колонизации нормальной микрофлоры на' слизистой слепых отростков кишечника цыплят 43.
2.3. Влияние метода иммунохимиопрофилактики эймериозов кур на уровень колонизации нормальной микрофлоры кишечника 56.
2.4. Динамика формирования и уровень колонизации нормальной микрофлоры кишечника цыплят при применении антиэймериозных препаратов 69.
2.5. Методы контроля и коррекции нормальной микрофлоры цыплят в производственных условиях 82.
3. Обсуждение 103.
4. Выводы 112.
- Роль нормальной микрофлоры кишечника
- Влияние E.tenella на уровень колонизации нормальной микрофлоры на' слизистой слепых отростков кишечника цыплят
- Динамика формирования и уровень колонизации нормальной микрофлоры кишечника цыплят при применении антиэймериозных препаратов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на повышение уровня ветеринарно-санитарных мероприятий, технологии и культуры ведения отрасли, эймериозы продолжают наносить птицеводству значительный экономический ущерб. Ежегодные потери от них в мире исчисляются в сотнях миллионов долларов. Они складываются из гибели птиц, снижения ее продуктивности и дополнительных затрат корма на единицу продукции. Установлено, что скрытый экономический ущерб (потери привесов, снижение категорийности тушек, увеличение затрат кормов) в 2-3 раза превышает потери от прямой гибели птицы. ( Ю.П. Илюшечкин и А.И. Кириллов, 1981) Это связано преимущественно с нарушением функций пищеварительного тракта, являющегося для большинства видов эймерий птиц средой обитания. Как отмечал В.А.Догель (1962) «С практической токи зрения главный интерес в явлениях паразитизма представляет в большинстве случаев не организм (паразит), а его среда обитания (хозяин), и с теоретической точки зрения эти отношения представляют значительный интерес. Среда паразита, будучи таким же живым организмом, как и его обитатель, реагирует на присутствие последнего иногда очень сильно».
Изучение вопросов взаимоотношений паразита и хозяина на организменном, тканевом, клеточном и молекулярном уровнях способствуют в значительной мере расшифровке ряда протозойных болезней животных и разработке научно-обоснованных мер профилактики и борьбы с ними. ( М.Ш.Акбаев,1985; Х.Х.Абдиллин,1970; И.Б. Куваева,1976; О.В. Чахава,1987)
Эндогенная стадия развития эймерий кур протекает в эпителиальных клетках слизистой кишечника хозяина. Известно, однако, что нормальная микрофлора кишечника, колонизируясь на слизистой, формирует биопленку,
выполняющую роль экрана, который лимитирует доступ возбудителям кишечных инфекций к месту их патогенного действия. (Б.А. Шендеров,1987; Б.В.Пинегин, В.М. Коршунов с соавт.,1983).
В результате жизнедеятельности эймерий в слизистой нарушается ее нормальное состояние, что отрицательно влияет на микробиоценоз облигатной микрофлоры кишечника.
Это обстоятельство и послужило основанием для изучения влияния эймерийозной инвазии на уровень колонизации нормальной микрофлоры на слизистой слепых отростков кишечника цыплят.
Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение влияния эймерийозной инвазии на биоценоз кишечника цыплят.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
- изучить влияние эймерийозной (Е. 1епе11а)инвазии на уровень колонизации
бифидобактерий, лактобацилл и Streptococcus faecium на слизистой слепых
отростков кишечника цыплят;
- определить влияние метода иммунохимиопрофилактики на эндогенную
микрофлору кишечника;
- выяснить влияние антиэимерииозных препаратов на состояние нормальной
микрофлоры кишечника птиц;
- разработать методы контроля и коррекции нормальной микрофлоры 0
кишечника цыплят.
Научная новизна. Впервые изучены динамика изменения нормальной микрофлоры слепых отростков кишечника цыплят на фоне Е. tenella -инвазии, влияние метода иммунохимиопрофилактики на колонизационную резистентность йндигенной микрофлоры кишечника и разработаны методы 1^ контроля и коррекции нормальной микрофлоры кишечника птиц.
Практическое значение работы. На основании полученных результатов
исследований разработан оригинальный метод контроля и коррекции
нормальной микрофлоры кишечника цыплят в производственных условиях.
Разработаны: "Рекомендации по прафилактике и лечению дисбактериозов
при проведении иммунохимиопрофилактики эймериозов птиц."Утверждены
Научно-координационным советом по животноводству и ветеринарии
Северо-Западного научно-методического центра Россельхозакадемии , пр.№
4 от 23 декабря 2005г. Составленные рекомендации ранее ( 2004-2005гг)
были внедрены и апробированы на птицефабриках: «Приморская»,
Лениградской области, «Гайская», Оринбургской области, «Баксанская»,
Кабардино-Балкарской Республике. Проведены производственные
испытания пробиотика СТФ-1/56 при иммунохимиопрофилактике эймериозов птиц в хозяйствах Ленинградской, Оренбургской областях, Краснодарском крае и Кабардино-Балкарской Республике. Материалы научных исследований активно используются для проведения практических занятиях и чтения лекций для студентов очного факультета Санкт-Петербургской академии ветеринарной медицины, Ставропольского аграрного университета, Саратовского аграрного университета, на курсах повышения квалификации ветеринарных врачей Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и одобрены на заседании Ученого совета Всесоюзного научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства (1990 г), Всесоюзных научных координационных совещаниях по болезням птиц (г. Самарканд, 1989 г; г. Иркутск, 1990 г), Всесоюзных совещаниях ветеринарных специалистов птицеводческих хозяйств (г. Москва, 1989, 1990 гг.), 1-ом международном ветеринарном Конгрессе по птицеводству, 2005г.
Основные положения, выносимые на защиту:
- изучить влияние эймерийозной (Е. tenella) инвазии на уровень колонизации
бифидобактерий, лактобацилл и Streptococcus faecium на слизистой слепых
отростков кишечника цыплят;
- определить влияние метода иммунохимиопрофилактики на эндогенную
микрофлору кишечника;
- выяснить влияние антиэймерийозных препаратов на состояние нормальной
микрофлоры кишечника птиц;
- разработать методы контроля и коррекции нормальной микрофлоры
кишечника цыплят.
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 5 научных работах.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений. Список использованной литературы содержит 230 наименований работ отечественных и зарубежных авторов, в том числе 139 отечественных, 91 иностранных.
Работа иллюстрирована 16 таблицами и 14 рисунками.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. І.І.Краткая характеристика эймерии кур.
Эймерии - паразитические простейшие, которые относятся к подцарству Protozoa, типу Apicomplexa, классу Sporozoa, подклассу Coccidiomorpha, отряду Coccidiida, подотряду Eimeriidea, семейству Eimeriidae, роду Eimeria. ( Levine et all, 1980) В настоящее время общепризнано, что у кур паразитируют девять видов эймерии: Е. tenella, Е. acervulina, Е. maxima, Е. mitis, Е. necatrix, Е. praecox, Е. hagani, Е. brunetti, Е. mivati.
Одноклеточные паразиты рода Eimeria имеют сложный цикл развития, в процессе которого проходят три стадии: шизогонию, гематогенез и спорогенез. Первые две стадии эймерии кур осуществляются в эпителиальных клетках кишечника (эндогенное развитие), а последняя - во внешней среде (экзогенное развитие) ( Е.М. Хейсин, 1967; Pellerdy,1974; Г.В. Бейер, 1982).
Заражение птиц эймериями происходит алиментарным путем. В желудочно-кишечном тракте под влиянием пищеварительных ферментов^ \/ желчи оболочка ооцист разрушается и освободившиеся спорозоиты внедряются в эпителиальные клетки слизистой оболочки кишечника, где трансформируются в трофозоиты. их ядра претерпевают множественное \у^ деление (шизогонию), в результате которой образуются подвижные бесполые стадии паразита - мерозоиты. После разрушения цитоплазматической мембраны пораженной клетки мерозоиты выходят в просвет кишки и проникают в неповрежденные клетки, где формируется следующая стадия шизонтов и, соответственно, мерозоитов.
Процессы шизогонии могут повторяться несколько раз, в зависимости от вида эймерий. Из мерозоитов последней генерации формируются гамонты (макрогаметоциты и микрогаметоциты). Макрогаметоцит превращается в макрогамету, а микрогаметоцит дает начало большому количеству микрогамет.
В результате внутриклеточного слияния гамет образуется зигота, которая покрывается оболочками и превращается в ооцисту. Сформированная ооциста выделяется во внешнюю среду, где при благоприятных условиях (температура 25-28С и достаточная влажность) происходит в течение 48-72 часов процесс споруляции (созревания).
Одноклеточные стадии эймерий, как и любые другие эукариотные клетки, имеют сложную ультраструктуру ( Jurajdova,1969; В.Г. Селивестрова, 1970; Sholtyseck a. Mehlhorn, 1970, Т.А. Шибалова, 1974, 1976, 1979; Т.А. Шибалова с соавт.,1974; Michael , 1975; Б.А. Кравцов, 1977; Т.В. Бейер с соавт.,1978).
Характерной биологической особенностью эймерий является их строгая специфичность по отношению к хозяину и месту локализации. Сущность ее заключается в том, что в процессе эволюции каждый вид паразита приспособился к определенной биофизико-химической среде, которую он находит лишь в организме определенного присущего ему хозяина и в конкретных органах, тканях или даже клетках.( Clarkson,1960; Н.П. Орлов, 1961; В.Ф. Гусев, 1967; Д.Н. Засухин, 1969; Marquardt, 1966, 1973)
Каждый конкретный вид эймерий кур имеет преимущественную локализацию в различных участках кишечника.( Redd, 1968; Pellerdy, 1974 ; Long etal., 1976).
Так, в тонкой кишке развивается E.acervulina, E.maxima, E.mitis, E.necatrix, E.praecox, E.mitis, E.mivati и E. hagani. Причем E.acervulina, E.mitis, E. hagani
и Е.ргаесох в основном локализуются в проксимальных участках тонкой кишки, a E.maxima и E.necatrix в средней ее части, наиболее широко по тонкой кишке расселяется E.maxima (Е.М. Хейсин, 1967). В дистальном отделе тонкого кишечника и в прямой кишке паразитирует E.brunetti, а в слепых отростках толстого кишечника - Е. tenella. Приуроченность к определенной зоне распространения эймерий в кишечнике, по мнению Е.М. Хейсина, явилась основным условием возможности одновременного паразитирования нескольких видов эймерий в одном и том же хозяине. Приспособленность паразита к развитию в определенном участке кишечника, отличному от других по своей физиологической функции, приводит к межвидовым особенностям развития процесса патогенеза эймериозов.
На внутриклеточном этапе развития клетка паразита и клетка хозяина образуют единую экофизиологическую систему, выработанную в процессе длительной сопряженной эволюции (М.М. Камшилов, 1970; Т.В. Бейер с соавт., 1978; А.Е. Хованских, 1984). Внутриклеточные паразиты при этом активно влияют на характер метаболизма клетки хозяина (Ю.И. Полянский и Т.В. Бейер, 1978; Ю.И. Полянский, 1978,1982). Это проявляется в том, что на некоторых этапах цикла развития паразита, клетки хозяина активируют свой метаболизм, способствующий обеспечению его всеми необходимыми пластическими и энергетическими материалами (А.Е. Хованских, 1984).
Кажущаяся парадоксальность ситуации, в которой перестройка метаболизма клетки хозяина в итоге способствует развитию паразита, объясняется, по мнению А.Е. Хованских тем, что данные гетерогенные клетки соответствуют друг другу, как части одного организма. То есть, клетка паразита (симбионта), заключенная в паразитоформную вакуоль, превращается в экстраорганеллу клетки хозяина ( Д.В. Осипов с соавт., 1978). Это обусловлено эволюционной коадаптацией эукариотных клеток системы паразит-хозяин и закреплено в генетическом аппарате партнеров.
Однако Т.В. Бейер с соавт. предостерегают об упрощенном взгляде на клетки паразита, ибо они на всех стадиях жизненного цикла не только не уступают по сложности своей организации и метаболической оснащенности клеткам хозяина, но в чем-то даже превосходят их.
Обладая огромной репродуктивной потенцией ( С.Н. Никольский с соавт.,1975), эймерии всех видов вызывают обширные поражения слизистое/ оболочки кишечника. Пораженные эпителиальные клетки всегда разрушаются после выхода из них паразитов, находящихся на соответствующих стадиях развития ( Ю.И. Полянский, 1978; И.А.Болотников с соавт., 1981). При этом повреждается под слизистый слой, сосуды и нервы ворсинок кишки (Н.А. Колабский и П.И. Пашкин, 1974). Создаются благоприятные условия для развития и внедрения секундарной микрофлоры, что способствует возникновению дисбактериозов ( Н.А. Колабский и П.И. Пашкин, 1974; Arakawa a.Ohe, 1975; Kiwura et al., 1976; А.И. Чубис с соавт., 1982; В.А. Тимофеев, 1985).
Кроме того, в организм попадают продукты метаболизма паразитов( Berns a. Challey, 1959, 1965), вызывая его интоксикацию (Mckenzie et al.,1985) и изменение метаболистических процессов, обеспечивающих нормальное физиологическое состояние организма хозяина (Я.Д. Киршенблат. 1954).
Так, наблюдения Б.А. Тимофеева (1985) свидетельствуют, что в основе общей патологии протозойных заболеваний, лежит прежде всего нарушение гомеостаза организма и развитие в нем патологических процессов, степень выраженности которых обуславливается комплексом причин. Поэтому Н.А. Колабский и П.И.Пашкин ( 1974) справедливо считают, что эймериоз следует рассматривать как заболевание всего организма, а не только органа, в котором паразитирует возбудитель. Об этом свидетельствуют многочисленные работы отечественных и зарубежных исследователей,
касающиеся биохимических и иммунологических реакций организма хозяина, вызванных паразитированием эймерий (П.И. Пашкин, 1966; Ф.Р. Халиков, 1968,1973; АЛ. Мачинский, B.C. Орехов, 1971,1973; А.А.Суркова, 1972; Т.В. Бейер и Т.А.Шибалова,1974; А.Е.Хованских и Г.А.Михайлов, 1976; М.А. Мусаев с соавт., 1977,1983; А.Е.Хованских с соавт.,1977; А.Е. Хованских,1977,1979,1983,1984; М.А.Мусаев ,1978; А.В.Аверьянов с соавт., 1978; Я.Я. Елчиев,1982; М.А. Мусаев и Я.Я. Елчиев,1983; B.C. Мишин и Г.А. Михайлов, 1984; В.А. Тимофеев, 1986; И.А. Исмаилоа,1987; П.И. Пашкин с соавт., 1987; Stoll et al, 1970; Freeman, 1970; Visco, 1973; Kumar a. Rawat, 1975; Chommein a. Osman, 1980; Giambrone a. Klesius,1980; Witlock et al,1981; Chapman et al.,1982; Ruff a.Allen, 1982; Ruff a. Augustine, 1982; Allen a. McMurtry, 1984; McKenzie a Long, 1986; Padmarathi a. Muralidhaiam, 1986; Turk, 1986 и др.)
Несмотря на системность заболевания цыплят эймериозом в его патогенезе важное место занимает нарушение слизистой оболочки кишечника у больных птиц. Это обусловлено прохождением эндогенной стадии цикла развития паразита именно в кишечнике, следствием чего является патологическое изменение морфологической структуры слизистой. Наиболее характерными морфологическими изменениями слизистой кишечника в период отрой стадии эймериозной инвазии являются уменьшение толщины слизистого слоя; укорочение, искривление и утолщение ворсинок; удлинение крипт; оголение участков субэпителиального слоя соединительной стромы ворсинок в результате разрушения эпителия и усилениячт> десквамации; деструкция и отслаивание щеточной каймы, сопровождающееся оголением мембраны энтероцитов; изменение формы эпителиальных клеток, смещение их ядер и другие интрацеллюлярные аномалии; редукция или исчезновение гликокаликсного слоя и др .( Helmboldt a. Bryout,1971; Fernando a. McCraw,1973; Michael, 1973;
Humphrey a. Turk, 1974; Reid a. Sohuson,1974; Bayer et al., 1975; Michael a. Hodges, 1975; Reley, 1975; Smith, 1975; Witlock et al., 1975 a,b; Ruff et al., 1976; Witlock a. Ruff, 1977; Dussynski et al, 1978; Ruff et al., 1981; Smith et al.,1980; Лозанов,1983; и др.).
Новое измерение к изучению желудочно-кишечной морфологии и патологии добавила сканирующая электронная микроскопия. С ее помощью изучены участки желудочно-кишечного тракта в норме и при патологии многочисленных видов животных и птиц. Эти работы внесли ясность в динамику развития патологического процесса при эймериозах стереоскопической картиной слизистой поверхности.
При изучении цекальной инвазии индеек Histomonas meleagridis Wilkins a. Lee (1974) наблюдали существенные изменения слизистой поверхности. Они отметили присутствие отверстий в криптах у зараженных индеек и некоторые области, /де эпителий был полностью оголенным. Witlock et al (1975) изучая влияние Е. tenella на слизистую слепых отростков цыплят отметил те же изменения. Robert С. et al (1976) сообщал, что на 7 и 14 дни после заражения суточных цыплят ооцистами Е. tenella, разрушение и слущивание эпителия стали очевидными. На 30 день после заражения разрушении были более тяжелыми и в итоге приводили к обнажению отверстий крипт.
1.2 Роль нормальной микрофлоры кишечника
В истории изучения нормальной микрофлоры можно выделить несколько основных этапов. Первый - само открытие присутствия в организме человека и животных микроорганизмов, сделанное Левенгуком. Второй этап - это исследование по обнаружению и идентификации микроорганизмов на коже и слизистых и начало изучения роли отдельных видов микроорганизмов в жизни человека и животных. Важную роль в этих исследованиях сыграли отечественные микробиологи: Мечников И.И., Перетц Л.Г., Гамалеи Н.Ф., Габричевский Г.Н. и, наконец, последние десятилетия, когда широкое использование современных методов культивирования облигатно анаэробных бактерий и принципов гнотобиологии дало возможность начать детализацию роли нормальной микрофлоры и ее отдельных представителей в поддержании гомеостаза человека и животных, в возникновении некоторых патологических состояний. Необходимо отметить преемственность и взаимосвязь этих основных этапов, которые обеспечили то, что понимание роли нормальной микрофлоры с годами неуклонно углубляется.
Б.А. Шендеров (1987) считает, что с современных позиций нормальную микрофлору следует рассматривать как совокупность множественных микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающих тот или иной биотоп в организме человека и животных, в каждом из которых следует различать постоянно встречающиеся виды микроорганизмов, так называемые характерные виды (автохтонная флора), добавочные и случайные виды.
Работами многих исследователей ( СБ. Басина, 1931; S.K. Shapiro, W.B. Sarles, 1949; Л.Г. Перету, 1955; Н. Haenel, 1961,1970; Y. Ochi, Т. Mitsnoka, 1958; H.W. Smith, W.E. Crabb, 1961; L. Zubrzycki, E.H. Spanlding, 1962; R.M. Donaldson, 1964; T.Mitsnoka et al, 1965; E.M. Barnes, C.S. Ympey,
1970; S.A. Nagi et al, 1970; И.Б. Куваева, 1970; M.Y. Hill et al, 1971; E.M. Barnes et al, 1972; H.H. Низько, 1972; С.А. Шагинян, 1972, Г. Гружинова, 1973, И.В. Петрова, 1975; P.S. Ramos, Y.C. Paniso, 1977; E.M. Barnes, 1979; H.M. Круглова, 1980; Н.Л. Поликарпова, В.М. Шилова, 1981; R. Fuller, 1982; В.В. Сорокина, М.А. Тимошко, Ф.Л. Вильшанский с соавт., 1979; Н.П. Тарабрина, 1980, Н.П. Иванова, 1982, И.П. Елизарова, Т.Н. Кудинова с соавт., 1987; Т.И. Гончарова, Л.П. Семенова с соавт., 1987; А.А. Ленцпер, Х.П. Ленцпер с соавт., 1987; М.Э. Микельсаар с соавт., 1987; Е.А. Беюл, И.Б. Куваева, 1987, П.Б. Куваева, Г.Г. Кузнецова с соавт., 1987 и другие ) показана важная роль автохтонной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных, в регуляции газового состава кишечника, в формировании иммунологической реактивности организма; выработке антибиотических соединений. Нормальной микрофлоре присущи способности к антагонистической активности, предохраняющей органы, сообщающиеся с внешней средой от внедрения и безграничного размножения в них патогенных микроорганизмов; морфокинетическом действии (особенно по отношению к слизистой оболочке кишечника); влияние на синтетическую функцию печеночных клеток (связь с печеночно-кишечной циркуляцией компонентов желчи - солей, желчных кислот, холестерина, желчных пигментов); синтезирующей способности (витамины К и группы В, некоторые ферменты и, возможно, другие неизвестные вещества); использовании организмом биологически активных соединений, образующихся в результате инактивации ферментными системами микрофлоры дистальной части кишечника; утилизирующей способности флоры по отношению непереваримых пищевых веществ, образуя при этом разнообразные амины, органические кислоты и другие соединения.
Велика роль нормальной микрофлоры кишечника и в процессе детоксикации ксенобиотиков. Так, в метаболизме азотосодержащих
соединений принимают участие десятки энзимов микробного происхождения, кроме того, автохтонная микрофлора кишечника выступает в роли естественного биосорбента попадающих из вне и образующихся в организме хозяина токсических продуктов. Исходя из этого, автохтонную микрофлору можно рассматривать как первичную мишень для любых попадающих пероральным путем соединений, как экологическую систему, которая первой вовлекается в трансформацию естественных и чужеродных полезных и потенциально вредных субстанций. Следовательно, только после прорыва этого неспецифического барьера включаются собственные механизмы защиты организма.
Однако, нормальную микрофлору следует рассматривать в определенной степени и как фактор агрессии, так как в ходе трансформации могут формироваться продукты с высоким биологическим эффектом. J. Sakurai et al (1982) считают, что такой эффект может иметь место при дисбалансе автохтонной микрофлоры. Механизм взаимодействия микроорганизмов и организма хозяина, которые обеспечивают стабильность присущего микробиоценоза, приживление автохтонной и элиминацию аллохтонной микрофлоры, окончательно не выяснены. Но, несомненен тот факт, что важное значение в этих взаимоотношениях играет способность автохтонной флоры фиксироваться к строго определенным рецепторам клеток слизистой кишечника. Процесс специфической адгезии позволяет на слизистой формировать видовую, строго анатомическую биопленку, состоящую из муцина, бактериального экзополисахарида и заключенных в этом матриксе микроколоний бактерий, что обеспечивает высокую устойчивость бактерий к неблагоприятным воздействиям ( А.С. Savage , 1984 ). Однако при определенных стрессовых и физиологических состояниях состав бактериальной популяции в биопленке может изменяться, в результате чего биопленка из облигатной флоры может заменяться
биопленкой с популяцией других микроорганизмов ( М.И. Нахимовская,
1938; Н.П. Тарабрина, 1980 ). Следствием подобной трансформации может
являться дисбактериоз или инфекционный процесс. В связи с этим, контроль
за автохтонной флорой может способствовать улучшению
физиологического состояния организма ( R. Dubos, R.W. Schaedler, 1962 ).
Распределение и состав микробных популяций в кишечнике зависит от эндогенных факторов (влияние слизистой оболочки кишечника, обуславливающей органный тропизм некоторых микробов и антагонистические взаимоотношения между организмами); контролирующее влияние кишечной микрофлоры ( П.И. Киселев с соавт., 1940 ) и экзогенных факторов - антибактериальные препараты, состав диеты и гигиеническое состояние окружающей среды ( И.Б. Куваева, 1976 ).
Определение тех или иных патологических изменений, происходящих в организме по различным причинам, осуществляется путем сравнения их с «нормой». Однако дл изучения механизмов бактерионосительства патогенных возбудителей еще весьма мало используется сравнение этого явления с персистенцией в организме хозяина нормальной аутомикрофоры ( О.В.Чахова, 1983).
Исследованиями ряда ученых (Л.Г. Перегу, 1955; Н. Haenel, 1961; H.W. Smith, W.E. Crabb, 1961; R.W. Donaldson, 1961; T. Mitsnoka et al, 1965; И.Б. Куваева, 1970; S.A. Nadi et al, 1970; H.H. Лизько, 1972, M.E. Barnes, 1979; R. Fuller, 1982 ) установлены основные представители микрофлоры кишечника человека и животных, и их динамика в зависимости от возраста, воздействия внешних факторов и видовых особенностей. В частности, у птиц нормальная кишечная флора представлена следующими родами энтеробактерий: Bacteroides, Esherichia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Edwardsiella, Citrobacter, Serratia, Shigella, Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium,
Pseudomonas ( W.H. Smith, W.E. Crabb, 1961; R.M. Donaldson, 1964; C.N. Huntanen, Y.M. Pensar, 1965; S.A. Nadi et al, 1970; E.M. Barnes, C.S. Ympey, 1970; E.M. Barnes et al, 1972; E.M. Barnes, 1979; М.А. Тимошко, 1973; М.А. Тимошко, 1973a; И.В.Петрова, 1975; М.А. Тимошко, Ф.А. Вильшанская, 1980; Г.А. Николечева, 1979; R. Fuller, 1982 ). Из семейства Enterobakteria-сеае у птиц не изолированы представители родов Yersinia, Erwinia, Hafnia, Salmonella ( P.S. Ramos, G. Panizo, 1977).
Многие исследователи отмечают, что наибольшее значение в жизнедеятельности организма птицы имеют лактобациллы, бифидобактерии, молочнокислые стрептококки, бактероиды, колибактерии, стафилококки и клостридии.
На интенсивность колонизации желудочно-кишечного тракта микроорганизмами влияет доступность питательных веществ, конкуренция за них, рН окружающей среды, желчные кислоты, температура, частота смены эпителиальных клеток, антитела и фагоцитирующие клетки, муцин, лизоцим, лизопектин, высокомолекулярные и летучие жирные кислоты, кислород и водород, бактериоцины и бактериофаги.
У цыплят в кишечнике вегетируют только определенные виды бактерий. С первых дней жизни в их желудочно-кишечный тракт попадает большое количество микроорганизмов, но приживается ограниченное число видов, занимающих в нем определенные ниши ( М. Lev, 1956; R. Fuller, 1982). Количество анаэробных и аэробных бактерий в первые дни жизни одинаково, а с 2-х недельного возраста количество анаэробов увеличивается ( S.K. Shapiro, W.B. Sarles, 1949; C.N. Huntanen, G.M. Penzak, 1965) . Эти группы, в основном, представлены лактобациллами, бифидобактериями, стрептококками, эшерихиями и клостридиями. Причем во всех органах желудочно-кишечного тракта птиц присутствуют микроорганизмы, отличающиеся по своему качественному и количественному составу ( S.K.
Shapiro, W.B. Sarles, 1949; E.M. Barnes et al, 1972; T.A. Николичева, 1974,1979; И. Казанков, А. Лобанов, 1975 ).
Количество микроорганизмов возрастает до 19 недели, после чего стабилизируется (P.S. Ranios, G.C. Panizo,1977 ).
При качественном изучении микрофлоры желудочно-кишечного тракта цыплят различных возрастных групп породы белый леггорн, установлено ( Y. Ochi, Т. Mitsnoka, 1958), что в общем аутофлора кишечника здоровых цыплят представлена похожими типами. По сообщениям исследователей ( S.A. Nagi et al, 1970; T.A. Николичева, 1974,1979 ) лактобациллы доминируют в двенадцатиперстной кишке, при небольшом количестве других бактерий, флора средней кишки сходна с таковой в двенадцатиперстной кишке, но энтеробактерии и стрептококки находятся в менее значительном процентном отношении к основному количеству бактерий.
Наибольшее число бактерий находится в слепой кишке, где в норме содержится в среднем 1011 бактерий в 1 г содержимого, из которых доминирующими являются лактобактерии.
У человека и животных в ходе филогенеза выработался надежный механизм защиты организма от возбудителей заболеваний, которые имеют алиментарный путь проникновения в организм. Для нормального функционирования этого механизма необходимы все компоненты микроэкологической системы индигенной флоры кишечника, независимо от их удельного веса, хотя значимость отдельных компонентов в различных микробиотопах неодинакова (Р.Ф. Кузина, 1971).
Микрофлора любого полого органа делится на микрофлору стенки, в частности, слизистой, содержимого, т.е. пристеночную и просветную. Пристеночная, локализуется в прилегающей к эпителиальным клеткам слизи или находится в тесной ассоциации с клетками слизистой и представляет собой резидентную флору. Микрофлору содержимого составляют как
индигенные, так и постоянно поступающие в организм микробы из внешней среды или из других органов, т.е. состоит как из резидентной, так и транзитной микрофлоры.
Свойства, от которых зависит защитная функция нормальной микрофлоры кишечника, в первую очередь связаны с колонизационной способностью, непосредственной антимикробной активностью, воздействием на защитные механизмы (иммунную систему) макроорганизма, а также от влияния факторов внешней среды ( А.А. Ленцнер, 1972; Л.К. Кушина, М.А. Игнатьев, Д.Х. Лузянин, 1957; А.З. Смолянская, 1987; И.Б. Шепелева, Н.С. Захарова, Т.Н. Ремова, И.Г. Бажанова, И.Б. Сорокина, И.Г. Богданов, 1985).
Колониационная способность индигенной флоры позволяет ей стать экологическим барьером, блокирующим рецепторы клеток слизистой от адгезинов патогенный микроорганизмов ( Pourcian S.C., W.G. Springer, 1978). В свою очередь колонизационная резистентность нормальной микрофлоры стенки обусловлена высокой адгезивной способностью, устойчивостью к лизоциму, пищеварительным сокам, антагонистическому действию других микроорганизмов. Именно эти свойства обеспечивают конкурентно исключение возбудителей кишечных заболеваний ( В.И. Брилис, 1983; Г.И. Гончарова, Л.П. Семенова, Э.П. Козлова, Е.В. Донских, A.M. Лянная, 1987; Р.Ф. Кузина, 1971). D. Savag (Q. Schatz , Е. Bugie, S. Waksman, 1944) отмечает, что существует не только адгеция, т.е. слипание с клетками макроорганизма, но и межбактериальная адгезия - слипание между микроорганизмами.
Большинство видов пристеночной индигенной микрофлоры кишечника обладают высокой лизоцимустойчивостью, а многие представителя лактобацилл, стрептококки, пропионовые бактерии даже сами продуцируют лизоцим, который является одним из факторов, играющим значительную
роль в регуляции нормальной микрофлоры стенки кишечника ( Р.Ф. Кузина, 1971; R. Fuller, 1978).
Нормальная микрофлора кишечника обладает, кроме того, и высокой антимикробной активностью по отношению многих видов условно-патогенных и патогенных бактерий. Антагонистические свойства, четко проявляемые in vitro лактобациллами, бифидобактериями, Str. faecium и другими послужили объектом многочисленных исследований с момента открытия указанных микроорганизмов.
Для многочисленных бактерий, бифидий следует также признать ингибирующее действие и продуцируемых молочной и других кислот, создающих кислую среду, которая неблагоприятно действует на патогенные микроорганизмы и вирусы ( З.В. Ваксман, 1947).
Механизм защитного воздействия нормальной микрофлоры нель ця рассматривать обособленно от организма хозяина, так как она оказывает благоприятное влияние на многие системы макроорганизма. Микрофлора и организм хозяина существуют в состоянии постоянного взаимодействия как единое целое в общебиологическом понятии, в котором нормальная микрофлора с соответствующими микробиотопами интегрирована в стройную микробную экосистему.
Действие нормальной микрофлоры на иммунную систему связывают с
пептидогликами, тейхоевыми кислотами клеточных стенок
микроорганизмов, обладающими поликлониальными индукторными и иммуномодуляторными свойствами.
Некоторые авторы считают, что индигенная микрофлора стенок кишечника участвует в регуляции активности ферментов пищеварительного тракта и в обновлении эпителиальных клеток слизистой ( А.В. Сизова, 1974; Е. Goren, W.Q.Long, P. Doornenbal, J.P. Koopman, H.M. Kennis, 1984).
Помимо того, что нормальная микрофлора оказывает ингибирующее действие на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, препятствует их размножению в кишечнике, она выстилает пристеночный слой кишечника, предупреждая проникновение в слизистую этих микробов, т.е. биопленка индигенной микрофлоры выполняет роль экрана, который лимитирует доступ возбудителей кишечных инфекций к месту их патогенного действия.
1.3 Применение препаратов нормальной микрофлоры кишечника для предупреждения дисбактериозов и профилактики бактериальных болезней птиц.
Использование живых бактериальных препаратов полезной микрофлоры кишечника с целью нормализации физиологической деятельности организма впервые научно обосновано И.И.Мечниковым ( А.И. Мартынов, А.С. Гриневич, В.М. Коршунов, Б.В. Пенегин, 1982) и подтверждено работами его учеников ( Н. Tissier , 1906, А.В. Чичкина 1907, F. Tortuero 1973, А.Ф. Абызова, М.С. Полонская, Э.К. Карасевич, А.В. Платонов, 1979, Van der Waaij, Б.А. Шендеров, 1987;) на примере молочнокислых бактерий, которые в настоящее время используются в медицине и ветеринарии для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта. ( И.П. Амелин, 1968; З.В. Ваксман, 1947; А.Р. Вальдман, 1972; Н.Н. Гаврилова, А.И. Захаренко, 1979; В.Л. Кретович, В.И. Яковлева, 1960; И.Б. Куваева, 1976; Л.К. Кушина, М.А. Игнатьев, Д.Х. Лузянин, 1957; Н.Н. Лизько, 1987; Н.Н. Сафонова, Н.Б. Хазенсон, З.Н. Матвеева, 1985; А.О. Тамм, М.П. Вия, М.Э. Микельсаар, У.Х. Сейгур, 1987; Ю.Я. Тендетник, Г.Б. Гукосян, М.Е. Коцинян, И.А. Тоноян, Г.А. Бабоян, Т.Ш. Артенян, 1980; A.S. Saerjadi, S.M. Stehman, C.F.Smyser, 1981; Т.В. Огородников, В.В. Дроздов с соавт., 1988, В.М. Новиков, В.А. Фортушный и О.П. Тимошенко, 1969, А.Д. Васин с соавт., 1982; Г.И. Гончарова, Л.П. Семенова с соавт., 1987; Т.И. Кудинова, В.Н. Майорова, 1986; Н.Н. Лизько, В.Н. Фролов с соавт., 1986; Э.К. Джикидзе, С.А. Шагинян с соавт., 1984; В.М. Коршунов, Н.А. Синицина с соавт., 1985; Г.И. Гончарова, 1986; В.А. Антипов, В.М. Субботин. 1980, Б.В. Пинегин, В.М. Коршунов, Н.П. Иванова с соавт., 1983; В.М. Григорьева, Л.Н. Астанина, СВ. Лесняк с соавт., 1983; В.М. Карпов, 1987; Т.Г. Кольцова, 1962; X. Хаусманн, 1967; Н.Л. Исаева,
М.З. Шахмарданов, Л.Н. Земскова, А.В. Григорьев, В.И. Лучшев, 1994; М.Н. Якушенко, Ж.М. Тхагапсоева, В.М. Бондаренко, 1997; Е.П. Селькова, К.А. Имамкулиев, Т.В. Мацулевич, 1998; К.И. Савицкая, 1998; В.И. Лучшев, М.З. Шахмарданов, 1999; Ю.Г. Мухина, 1999; В.Н. Шабалин, Т.Д. Чулок, Е.О. Дорошенко, 2000; Е.А. Лыкова, А.О. Мурашова, В.М. Бондаренко, 2000; НЛО. Каширская, 2000; Е.Р. Корвякова, 2001; В.Ф. Учайкин, М.О. Гаспарян, А.А. Новокшонов, Т.В. Мацулевич, О.Ю. Портных, 2001; О.В. Лебедева, Т.А. Бажукова, 2002; СМ. Егорова, 2002; Л.В. Феклисова, 2003; В.М. Бондаренко, Н.М. Грачева, 2003 ) . Однако, в последние два десятилетия, в связи с широким внедрением в медицинскую практику антибиотиков и химиопрепаратов, внимание к препаратам нормальной микрофлоры необоснованно ослабло. Несомненно, в арсенале средств борьбы с бактериальными инфекциями необходимо иметь высоко эффективные антибиотики, но полагать, что с помощью одних лекарственных препаратов можно решить проблему профилактики кишечных инфекций в животноводстве глубоко не верно. Опыт тотального применения антибиотиков в ветеринарной практике показал, насколько велики негативные последствия такой практики. Если учесть существование замкнутой системы содержания большого поголовья животных, особенно птиц, на ограниченных площадях, то вполне очевидно, что роль эубиотиков в охране здоровья животных и обеспечении стабильного благополучия крупных птицеводческих хозяйств по бактериальным инфекциям все более будет возрастать.
Применение эубиотиков в ветеринарной практике наиболее изучено при профилактике сальмонеллезов птиц.
Так, финскими исследователями Е. Nurmi,M. Rantala ( S.C. Pourcian, W.J. Springer, 1978) впервые был сформулирован новый принцип профилактики сальмонеллезов в промышленном птицеводстве с
использованием препаратов индигенной микрофлоры, они использовали в качестве нормальной микрофлоры содержимое слепых отростков взрослых здоровых птиц и показали, что предварительная обработка суточных цыплят содержимым кишечника создает высокую устойчивость к алиментарному заражению S. infantis, которая обусловлена, по их мнению, колонизационной резистентностью, вводимой микрофлоры.
Ряд исследователей, повторив опыт Нурми и Рантала со многими другими видами сальмонелл, подтвердили эффективность защиты цыплят от салмонеллезной инфекции путем предварительного заселения кишечника птиц анаэробной индигенной микрофлорой (Н.Н. Martin, 1966; М. Rantala, 1974; СЕ. Rigby, J.R. Pettet, 1980; D.S. Saerjadi, S.M. Stehman, Y.H. Snoeyenbos, O.M. Weinack, C.F. Smyser, 1981;E. Seuna, K.V. Nagaraja, B.S. Pomeroy, 1985; Z.B. Sewertzowa, 1929; Y.H. Snoeyenbos, O.M. Weinack, C.F. Smyser, 1978; Y.H. Snoeyenbos, O.M. Weinack, C.F. Smyser, 1979).
Для обозначения механизма защитного действия нормальной микрофлоры кишечника A.B.Lloyd et al ( Н.Н. Martin ) предложил термин «конкурентное исключение», который стал в научной литературе общепризнанным.
Ряд исследователей считают, что защитный эффект при конкурентном исключении связан с анаэробными микроорганизмами индигенной микрофлоры кишечника ( К. Onoue, S. Kotani, Q. Sumiyoshi, Т. Koga, 1980; J. Sakurai, J. Fujii, K. Dezaki, K.Endoh, 1982; Y.H. Snoeyenbos, O.M. Weinack, C.F. Smyser, 1979; J.F. Stephens, O.H. Vestal, 1968). Однако не все представители анаэробной флоры оказывают защитное действие, если даже они обладают выраженной антагонистической активностью по отношению к возбудителям бактериальных инфекций in vitro. Так, Е.М. Barnes ( Е.М. Barnes, C.S. Impey, B.J.H. Sterens, 1980) не удалось получить защитный эффект с чистыми культурами бифидобактерий и бактероидов.
По данным медицинской литературы, у человека лактобациллы и бифидобактерии играют ведущую роль в конкурентном исключении возбудителей кишечных инфекций в нормализации индигенной микрофлоры при энтероколитах, дисбактериозах различной этиологии ( Э.В. Бакулина, И.Н. Олейник, 1970; Р.Ф. Кузина, 1971; А.А. Ленцнер, 1973; А.З. Смолянская, 1987; И.Б. Шепелева, Н.С. Захарова, Т.Н. Ремова, И.Г. Бажанова, И.Б. Сорокина, И.Г. Богданов, 1985).
Что касается птиц, то по данным G.H. Snoeyenbos et al ( О.М. Weinack, C.F. Smyser, 1978). наиболее выраженным защитным эффектом при экспериментальном алиментарном заражении салмонеллами обладают фекальные стрептококки. Однако, по мнению Н.В. Мишурновой, приписывать защиту от салмонелл полностью только одному виду, например, Streptococcus faecium было бы не верно. При применении не отдельных видов, а определенного набора видов нормальной микрофлоры защитный эффект каждого может проявляться либо непосредственно, либо опосредовано, так как степень и длительность защиты зависит от стабильности оптимальной численности каждого вида, входящих в состав пристеночного микросимбиоценоза. Отсутствие одного или нескольких сочленов микросимбиоценоза, может привести к исчезновению других видов, которые несут прямую превалирующую роль в защите организма.
1.4 Влияние возбудителей кишечных инвазий на нормальный микробиоценоз кишечника.
Полученные данные по исследованию многогранной роли облигатной микрофлоры желудочно-кишечного тракта и ее оптимального состава натолкнуло исследователей на мысль о том, что микробный состав feces выявляет функциональное состояние кишечника и может служить показателем здоровья в комплексе с данными других исследований ( И.В. Петрова, 1975). Для этого необходимо знать уровень, характеризующий нормоценоз и дисбактериоз кишечника. F, Buttiaux, D.A.A.Mossel сопоставляя устойчивость к воздействиям внешней среды и содержание в кишечнике фекальных бактерий пришили к выводу, что если внешние факторы оказывают сильное воздействие на кишечник, то увеличивается вегетация клостридий и других представителей гнилостной микрофлоры. Ограниченное воздействие внешних факторов будет характеризоваться размножением бактероидов, лактобацилл и бифидобактерий. Настоящее положение отражает суть основных процессов, развивающихся при дисбактериозе кишечника. С этими положениями согласуются исследования H.Haenel ( 1970), сообщающего о существовании одних и тех же для всех возрастов критериев анормальной флоры: облигатные анаэробы отсутствуют вообще или присутствуют в небольших количествах; резкое уменьшение или исчезновение бифидофлоры из толстого кишечника; преобладание бактероидов в сочетании с большим количеством аэробов, представленных, главным образом, колиформами и энтерококками. Увеличение общего количества микроорганизмов и, в частности грибной флоры (дрожжи и дрожжеподобные грибы рода Candida), протеев, паракишечной палочки, стафилококков, стрептококков, клостридий, сарцин, при одновременном снижении молочнокислых бактерий описаны при различных заболеваниях
неинфекционной этиологии или в результате вегетирования моноинфекции. ( Н. Flock, 1954; В.Г. Геймберг с соавт., 1964 В.Н. Красноголовец, 1965; К.В. Негода с соавт., 1970; С.А. Шагинян, 1972; Г.Г. Кузнецова, 1972; Н.А. Жуковская, Л.М. Крулес, 1972; И. Казанков, А. Лобанов, 1975; Н. Haenel, J. Bendiny, 1975; Г.К. Калашникова с соавт., 1978; И.Н. Блохина, В.Г. Дорофейчук, 1979; Н.М. Круглова, 19804 Н.Л. Поликарпов, В.М. Шилов, 1981; Б.В. Пинегин, В.М. Коршунов, 1983; В.М. Коршунов, Н.А. Синицина с соавт., 1985; А.З. Смолянская, 1987; Т.Н. Желнова, 1987; Е.А. Беюл, 1987; О.Н. Костюковская, Е.А. Гладкая с соавт., 1987). Причем при некоторых патологических состояниях, связанных с дисбактериозами у представителей нормальной микрофлоры могут появляться новые свойства. Например, E.coli приобретает способность образовывать гиалуронидазу ( М.Н.Ломтева, 1957), вызывать патологические изменения в кишечнике и гибель цыплят ( R. Y. Nisco, 1975). Микробные ассоциации при дисбактериозах могут обладать высокой токсичностью, тогда как отдельные виды лишены этих свойств.
Развитием дисбактериоза сопровождаются многие заболевания, этиологический фактор которых связан с желудочно-кишечным трактом.
У человека резкие нарушения биоценоза кишечной микрофлоры описаны при энтеритах, гельминтозах и прочих заболеваниях ( О.П. Марко, 1972; И.Н. Блохина, В.Г. Дорофейчук, 1979; Т.А. Таги-Заде, Р.Э. Чобанов, 1983), у овец при паразитировании дикроцелий ( Б.Г. Абалихин с соавт., 1983), мониезий, тизаниезий, авителлин ( П.В. Радионов, 1980), стронгилоидов ( В.В. Шаповалов, 1971; Я.П. Литвинский, 1983), фасциол ( Ю.Ф. Петров, A.M. Сазанов с соавт., 1985), анаплазм ( С.А. Сулейманов, 1982); у свиней при гастро- и колиэнтеритах ( Ф.Х. Ахметзянов, 1968; М.М. Интизаров, 1969; И. Зеленый, А. Матвеева, 1980; Y. Poli et al, 1982). Дисбактериозы при этом характеризовались увеличением патогенных
штаммов кишечной палочки, стафилококков, протея, клостридий и появлением у некоторых лактобацилл патогенных свойств. При энтеритах телят различной этиологии значительно сокращается количество полезной микрофлоры при увеличении в одних случаях условно-патогенной и гнилостной микрофлоры, в других - патогенной кишечной палочки, вызывающей эширихиоз ( Р.А. Цион, В.П. Урбан, 1978; К.Н. Наумова, 1980; Д.И. Панасюк, Н.Г. Шигина, 1981). Интестинальный дисбактериоз описан у лошадей при паразитировании аскарид и оксиурат ( Х.В. Аюпов, З.А. Янгуразова, 1981); у кроликов - при эймериозе и колидиарее ( К.Л. Ковалевский, 1974; L. Prohaszka, F. Baron, 1981); у птицы - при аскаридозе ( Н.А. Ефимова с соавт., 1980).
Ряд работ посвящено исследованию взаимоотношений между кишечной микрофлорой и возбудителями эймериоза птиц.
Так, Fantham (1910), изучая эймериоз цыплят шотландских куропаток, сообщал, что кишечные бактерии имеют тесную связь с тяжестью эймериозов. Он отмечал, что спорозоиты и мерозоиты играют роль «заражающих игл», позволяющих вредным бактериям проникать внутрь тканей кишечника и далее посредством тока крови и лимфы достигать других органов.
Изучая флору слепой кишки 2-недельных цыплят, зараженных E.tenella ( K.R. Yohansson, W.B. Sarles,1948) установили, что независимо от рациона количество лактобацилл и энтерококков уменьшается к 4-5 дню после заражения, при неизменном количестве колиформ и возрастании количества анаэробов, в частности CI. perfringens. Последние, по мнению исследователей, осложняют течение эймериоза. Инвазия E.tenella у цыплят вела к резкому уменьшению количества лактобацилл и бифидобактерий в помете, при незначительном уменьшении бактероидов, катенобактерий и пептострептококков. Количество CI. perfringensc 5 по 7 день заболевания
увеличилось в миллион раз. Отмечалось постоянное увлеличение энтеробактерий.популяции большинства бактерий нормализовались после 15 дня, но лактобациллы, бифидобактерии, клостридии и энтеробактерий оставались в измененном соотношении еще на 17 день после заражения ( N. Kimura et al, 1976; Ю.П. Илюшечкин с соавт., 1979). По сообщению I.F.Stephens стабилизирование микрофлоры кишечника при инвазии E.necatrix происходит на 20 сутки после заражения.
Как считают I.P.Lafont et al, цекальный эймериоз является комбинированным результатомЗ-х факторов: паразита, бактериальной флоры и хозяина. Причем действие E.tenella, по мнению авторов, проявляется в присутствии Plectridium sp.H отсутствует при Bacillus cevcus.
Исследования, проведенные на гнотобиотических и свободных от бактерий цыплятах ( Y.Yohanson et al, 1973; K.S. Hedge et al, 1974) позволили установить, что развитие клинического эймериоза (E.necatrix) может проходить без вовлечения бактерий и грибов, в тоже время достоверно установлена тасная зависимость патогенности E.tenella от кишечной флоры. Авторы высказывают предположения о том, что микробная флора играет этиологическую роль при эймериозе и стимулирует РЭС, клетки которой способствуют диссиминации паразитов. Подобные данные получены и другими исследователями ( R.Y. Visco, W.C. Burns, 1972; R.E. Bradly, C.V. Radhakrishnan, 1973). При исследовании влияния ( D.E. Turk, V.P. Littlejohn, 1987) E. acervulina, E.necatrix, E. Brunette и E.tenella-инвазии на концентрацию общей аэробной флоры, общей анаэробной флоры, лактобацилл и колиформных бацилл в свежих фекалиях цыплят было установлено, что влияние эймериоза на микрофлору зависит от локализации инвазии внутри кишечника, влияния времени прохождения пищи, содержания влаги в помете, объема фекалий и других факторов.
При E.tenella-инвазии популяция лактобацилл, наряду с другими кишечными бактериями обнаруживалась неизменной в незатронутой части кишечника (ободочная, центральная часть тонкого кишечника) за исключением слепых отростков. Принимая во внимание эти результаты, а также факт, что понижение количества лактобацилл и биыидобактерий совпадает с периодом слущивания слизистой, вполне очевидно, что интенсивность этих бактериальных видов тесно связана с цекальной слизистой хозяина (N. Kimura, F. Mimura, 1976).
Изучение взаимоотношения между кишечной микрофлорой и возбудителями эймериозов свидетельствует о влиянии эймерий на ее качественный и количественный состав. В связи с этим, исследование влияния эймериозной инвазии на уровень колонизации нормальной микрофлоры на слизистой кишечника представляется актуальным.
1.5. Влияние лекарственных препаратов на индигенную микрофлору кишечника.
В последние годы неуклонно возрастает интерес к нормальной микрофлоре организма хозяина ( Б.В. Пинегин, В.М. Коршунов, В.М. Иванов с соавт., 1983; В.М. Коршунов, Синицина, Пинегин, 1985; Микельсаар, Тюри, Ленцнер, 1987; Смолянская, 1987; Чахава, 1972; Чахава с соавт., 1982; Чахава с соавт., 1984; Чахава с соавт., 1985; Шендеров, Сернова, 1984). На сегодняшний день известно, что в процессе эволюции автохтонные микроорганизмы превращались во все более взаимосвязанное целое. Одновременно для достижения большей эффективности происходило и разделение функции между отдельными группами микроорганизмов, то есть их специализация. Так некоторые представители нормальной микрофлоры кишечника животных и человека, используя молочную кислоту, продуцируют метаболиты, крайне важные для размножения других автохтонных анаэробных бактерий. Анаэробные бактерии образуют в процессе своей жизнедеятельности продукты, используемые аэробной флорой; последние в свою очередь создают условия, благоприятные для существования облигатно-анаэробных бактерий. ( Б.А. Шендеров) Подобная интеграция позволяет кишечной фкологической системе выступать как единое целое, согласованно работающее в интересах всей системы и организма хозяина, в котором она локализована. Таким образом, экологическая система макроорганизм и его нормальная микрофлора несут в себе элементы саморегуляции и способны противостоять, по крайней мере в известных пределах, изменениям условий среды и резким колебаниям плотности микробных популяций.
Известно, что представители нормальной микрофлоры живут в животном организме на коже и слизистых в виде биопленки, которая состоит
из клеточного муцина, бактериального экзополисахарида и заключенных внутри этого матрикса микроколоний бактерий. Устойчивость бактерий внутри этой биопленки повышается в десятки и сотни раз ( Шендеров, 1987). Несмотря на определенную стабильность, состав автохтонной бактериальной популяции в биопленке может изменяться под влиянием различных стрессовых агентов. Наиболее распространенным и мощным из этих агентов является влияние антибиотиков и других антимикробных препаратов (Чахава, Горская, Рубан, 1982; Чахава, Горская, 1984; Van der Waaij о, 1979,1982).
Изучение микрофлоры в целом и отдельных ее компонентов было начато задолго до широкого применения антибиотиков в экспериментах на безмикробных, обычных и гнотобиотических животных ( Чахава, 1972; Чахава, Горская, Рубан, 1982; Чахава, Горская, 1984; Шендеров, Сернова, 1984; E.N. Huntanen, Peusack, 1965; Kimura, Yoshika et al, 1986). Эти исследования имели вначале больше познавательное значение, однако после повсеместного распространения «химического прессинга» (пестициды, антибиотики и т.д.) они приобрели практическое значение. Исследования последних лет в области изучения нормальной микрофлоры и ее изменений в различных условиях, прежде всего при воздействии антимикробных препаратов, привели к созданию новых областей науки, таких как физиология, биохимия и генетика анаэробных микроорганизмов. Итогом длительного применения антибиотических препаратов явилось существенное ограничение распространения многих инфекционных заболеваний. Вместе с тем на фоне массового и не всегда контролируемого применения антибиотиков возникли негативные тенденции, среди которых нарушение эволюционно-вложившихся микробных экосистем, распространение бактерий с внехромосомной антибиотикорезистентностью и повышенной вирулентностью занимают одно из первых мест ( А.А. Ленцнер, Х.П.
Ленцнер, Микельсаар с соавт., 1987; А.И. Гладштейн, Тузова, Коваленко с соавт., 1987; Горская, Ланчинская, Чахава с соавт., 1987). Степень выраженности микроэкологических нарушений зависит от пути введения, дозы и длительности применения химиопрепаратов ( СМ. Навашин, 1988; Van der Waaij D, 1984). Антибиотики широкого спектра действия вызывают, как правило, более ранний и выраженный дисбаланс нормальной микрофлоры. Выявлена фазность изменений в нормальной микрофлоре: повышенная частота нарушений в начальные сроки воздействия антибиотиков с последующим развитием компенсаторный реакций и восстановлением микробиоценоза либо срыв с декомпенсацией и теми или иными клиническими проявлениями.
Кроме антибиотиков и другие лекарственные препараты способны (потенциально) вызывать микроэкологические нарушения. Это и наркологические и местноанестезирующие вещества, рвотные, обволакивающие, адсорбирующие, слабительные, отхаркивающие, желчегонные и другие средства, которые, изменяя моторику слизистых, нарушая образование муцина (место обитания автохтонной микрофлоры), также могут приводить к развитию дисбаланса в составе нормальной микрофлоры ( И.Б. Куваева, 1976). Потенциально дисбиотическими агентами могут быть некоторые психотропные препараты (производные фенотиазина), соли тяжелых металлов, некоторые антигистаминные препараты, лекарства, содержащие эфирные масла, красители, другие антисептики из-за их способности вызывать антимикробный эффект в отношении различных представителей автохтонной флоры.
Таким образом, анализ состояния нормальной микрофлоры при различных воздействиях, как и использование бактериальных препаратов для коррекции возникающих в ней нарушений - актуальная задача современной медицины и ветеринарии.
Представленный анализ литературного материала позволяет считать, что при эймериозной инвазии у птиц недостаточно выяснены вопросы динамики нормальной микрофлоры на слизистой кишечника; остается открытым вопрос влияния антиэимериозных препаратов на уровень колонизации молочнокислых бактерий на слизистой кишечника птиц; не исследовано влияние метода иммунохимиопрофилактики на динамику индигенной пристеночной микрофлоры на слизистой кишечника.
2.Собственные исследования. 2.1. Материалы и методы исследования
Работу выполняли в течение 1987-2004 гг в лабораториях паразитологии и микробиологии Всесоюзного научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства (ВНИВИП).
Эксперименты проводили на 980 цыплятах кросса «Бройлер-6», суточного возраста, которых получали из ГППЗ «Большевик», Ленинградской области.
Формирование подопытных групп птиц осуществляли по принципу сходных признаков (аналогов). Индивидуальные различия в живой массе их не превышали + 5г от средней по группам.
Содержали цыплят в условиях вивария ВНИВИПа в клеточных батареях КБ-106М при свободном доступе их к воде и корму. Кормление осуществляли комбикормом ПК-6 ЛЕН, ГОСТ/ОСТ 182221-72, сбалансированном по содержанию основных пищевых компонентов для данной возрастной группы цыплят-бройлеров. Поили водопроводной водой.
При изучении влияния антиэймериозных препаратов на уровень колонизации нормальной микрофлоры на слизистой слепых отростков кишечника цыплят, применяли:
химкокцид
ампролплюс
фармкокцид-25
Изучение метода контроля и коррекции нормальной микрофлоры кишечника цыплят в производственных условиях проводили на
птицефабриках: " Большевик" Ленинградской области, " Гайская" Оренбургской области, "Русь" Краснодарского края, " Баксанская" Кабардино-Балкарской Республике, используя антиэймериозный препарат эланкобан-100.
В экспериментах по изучению влияния эймериозной инвазии и антиэймериозных препаратов на уровень колонизации нормальной микрофлоры на слизистой слепых отростков кишечника птицы химкокцид, ампролплюс и фармкокцид-25 скармливали, начиная со второго дня после заражения и до окончания эксперимента.
В опытах по определению влияния метода иммунохимиопрофилактики на уровень молочнокислой микрофлоры на слизистой слепых отростков, ампролплюс скармливали начиная с 8 дня после введения суспензии живых ооцист вакцинных штаммов, и до окончания опыта.
В обзоре литературы отмечалось, что в последнее время в птицеводческих хозяйствах нашей страны и за рубежом с целью профилактики дисбактериозов, а также с целью коррекции, применяются препараты нормальной микрофлоры кишечника. С этой целью мы использовали препарат СТФ-1/56.
Методика получения препарата СТФ-1/56
Препарат СТФ-1/56 представляет собой культуру Streptococcus faecium штамма СТФ-1/56 выращенную на мясо-пептонном бульоне с глюкозой. В наших опытах препарат готовили на мясопептонном бульоне с 1% глюкозой.
Для получения прототипной посевной серии бульонной культурой Str. faecium СТФ-1/56 в пробирках, выращенной в течение 12-14 часов при 37-38С, предварительной проверенной на чистоту микроскопией мазков, окрашенных по Грамму, засевали мясо-пептонный бульон с 1% глюкозы во флаконах. Матрицевую культуру во флаконах, выращенную в течение 18-20
часов и проверенную на чистоту, засевали в бульон с глюкозой в колбах, выращивали в течение 24 часов при при 37-38С по истечении срока выращивания бульонную культуру Str. faecium СТФ-1/56 проверяли на чистоту микроскопией мазков, окрашенных по Грамму, высевали на МПА на среду Эндо, определяли концентрацию водородных ионов (рН), количество колониеобразующих единиц в 1 см3 культуры Str. faecium и суспендируемость в воде. При отсутствии посторонней микрофлоры и соответствии по другим показателям культуру использовали в качестве препарата СТФ-1/56.
Важным показателем, характеризующим состояние колонизационной резистентности является количество колониеобразующих единиц (КОЕ) исследуемого микроорганизма в 1 г исследуемого материала. Известно также, что преимуществом экспериментов на интактных животных является близость таких опытов к естественном условиям. Вместе с тем, эти исследования огранивают возможности их анализа. Учитывая это, а также исходя из специфики наших исследований, мы использовали методику, в основе которой было получение изолированных от организма препаратов слизистой оболочки слепых отростков кишечника цыплят.
С этой целью цыплятам в первые 8 дней жизни назначали препарат СТФ-1/56 с питьевой водой в дозе 109, а с 9 по 30 день - 2-109 микробных клеток Str. Faecium. В возрасте 10 дней цыплят заражали:
- в опытах по изучению влияния эймериозной инвазии на уровень колонизации нормальной микрофлоры на слизистой слепых отростков взвесью ооцист чистого вида E.tenella (лабораторный штамм ВНИВИП), в количестве 9-104 на 1 цыпленка.
в опытах по определению влияния метода
иммунохимиопрофилактики на уровень колонизации молочнокислой
микрофлоры на слизистой слепых отростков - смесью ооцист вакцинных штаммов трех видов в количестве: E.tenella - 1500, Е. acervulina - 15000, Е. maxima - 500 ооцист в одной иммунизирующей дозе.
За сутки до заражения, а затем через 1,3,5,7,10,15 и 20 дней после заражения из каждой группы убивали по 3 цыпленка, стерильно отбирали слепые отростки кишечника, помещали их в раствор Рингера (9,0 г NaCl, 0,42 г КС1, 0,24 СаС1, 0,2 г ЫаНСОз на 1 л дистиллированной воды). Удаляли
содержимое кишечника с помощью шприца с канюлей стерильным раствором Рингера при температуре +4 - +6С. После удаления содержимого слепые отростки кишечника вскрывали глазными ножницами и восьмикратно отмывали от остатка содержимого кишечника холодным раствором Рингера. Расправляли стенки кишечника слизистой вверх на стекле, охлаждаемого льдом, удаляли остатки раствора Рингера со слизистой стерильной фильтровальной бумагой. Затем с помощью стеклянного шпателя отделяли слизистую и отбирали сборную навеску 1 г от трех цыплят. Навеску слизистой измельчали стерильными ножницами, помещали в стерильные гомогенизаторы, добавляли 9см3 стерильного раствора Рингера и гомогенизировали до получения однородной суспензии.
Учет количества колониеобразующих единиц (КОЕ) Streptococcus faecium.
Чтобы определить количество КОЕ Str. faecium брали 1см3 гомогенизата слизистой, готовили разведения в растворе Рингера до 10-9. В последующем, из разведений 10-5 - 10-9 гомогенизата слизистой оболочки слепых отростков высевали по 1см3 на 3 чашки Петри с расплавленным и охлажденным до +45С МПА с 1% глюкозой. Чашки с посевами выдерживали 40 мин при комнатной температуре и инкубировали в течение
36 часов при температуре =37-38С по истечении срока инкубации определяли количество выросших колоний Str. faecium в чашках Петри. Для этого считали общее количество колоний в чашках в двух последних разведениях, где наблюдался рост, отбирали по 30 колоний, пересевали их в МПБ с 1% глюкозой для идентификации. Идентификацию отобранных колоний проводили микроскопией мазков бульонных культур, окрашенных по Грамму. Культуры, имеющие морфологию, свойственную грамположительным стрептококкам, пересевали на дифференциальные среды и среду Гиса. По количеству колоний, отнесенных к Str. faecium СТФ-1/56, определяли среднее арифметическое число колониеобразующих единиц в 1 г слизистой.
Методика учета количества латобацилл.
Учет количества КОЕ лактобацилл проводили на агаризованной среде МРС-1. с этой целью, из разведений гомогенизата 10-3 - 10-9 высевали по 1см3 на 3 чашки Петри с расплавленной средой. Затем чашки выдерживали 40 мин при комнатной температуре и помещали их в эксикатор. Откачивали из эксикатора воздух и вводили в него из аппарата Кипа углекислый газ. Помещали эксикатор в термостат и инкубировали при температуре +37-38С в течение 48 часов. По истечении срока инкубации определяли количество выросших колоний лактобацилл. С целью идентификации лактобацилл делали мазки и окрашивали их по грамму. Определяли среднее арифметическое число колониеобразующих единиц в 1 г слизистой.
РОССИЙСКАЯ
ГОСУДАРСТВЕННАЯ
БИБЛИОТЕКА
Методика определения уровня колонизации бифидобактерий.
Уровень колонизации бифидобактерий определяли методом предельных разведений на жидкой среде Блаурокка. С этой целью, стерильную среду разливали в стерильные пробирки с высотой столбика среды не менее 12 см и регенерировали кипячением в водяной бане в течение 45 минут. Затем высевали по 1 см3 гомогенизата из разведений 10-2 - 10-9 и инкубировали при температуре +37-38С в течение 48 часов. По истечении срока инкубации проводили учет количества бифидобактерий, условно принимая, что в последнем разведении с видимым ростом имеется хотя-бы одна микробная клетка. С целью идентификации бифидобактерий делали мазки и окрашивали их по Граму.
Методика учета ооцистопродукции.
В ходе каждого опыта определяли динамику ооцистопродукции. Для этого отбирали пробы помета от всех цыплят каждой подопытной группы и исследовали на наличие ооцист эймерий. Взятие и исследование проб осуществляли следующим образом: весь помет, выделенный цыплятами в течение суток, тщательно перемешивали и отбирали пробу в количестве 5 г, размешивали тщательно в ступке с 45 см3 чистой водопроводной воды. Полученную суспензию фильтровали через один слой марли, осадок отбрасывали. Затем, 10 см3 фильтрата помещали в центрифужную пробирку и центрифугировали в течение 5 минут с частотой вращения 5000 об/мин, жидкую часть сливали, к осадку добавляли 10 см3 флотационного раствора (насыщенного раствора поваренной соли), тщательно перемешивали. Центрифугировали еще раз в течение 5 минут с частотой вращения 5000 оборотов в минуту. При помощи петли из пробирки снимали поверхностный
»
»
слой жидкости и вводили в камеру Горяева. При малом увеличении микроскопа подсчитывали количество ооцист во всех 225 квадратах камеры. Ооцистопродукцию выражали количеством ооцист эймерий в 1 г помета. Расчет проводили по формуле:
Х=п-1111, где X - количество ооцист в 1 г помета; п - количество ооцист в камере Горяева;
ППчисло, показывающее, во сколько раз объем камеры Горяева меньше 1 мл.
Полученные данные подвергали статистической обработке методами вариационной статистики с проверкой достоверности результатов с помощью критерия Стьюдента по специально разработанным компьютерным программам.
2.2. Влияние E.tenella на уровень колонизации нормальной микрофлоры на слизистой слепых отростков кишечника цыплят.
В обзоре литературного материала отмечалось, что слизистая оболочка кишечника является местом адгезии нормальной микрофлоры и образования биопленки, препятствующей проникновению внутрь ее патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Эндогенная стадия цикла развития большинства видов эймерий кур также протекает в эпителиальных клетках слизистой оболочки кишечника, результатом чего является разрушение ее, а следовательно и разрушение биопленки, что приводит к нарушению нормоценоза. Недостаточная изученность этой стороны взаимоотношений паразита и хозяина послужила основанием для исследования влияния инвазии E.tenella на уровень колонизации нормальной микрофлоры на слизистой слепых отростков кишечника цыплят.
С этой целью за сутки до заражения у цыплят определяли фоновые уровни колонизации нормальной микрофлоры. В десятидневном возрасте цыплят заражали перорально взвесью спорулированных ооцист E.tenella в количестве 9-104 на одного цыпленка. Затем через 1, 3, 5, 7, 10, 15 и 20 суток после заражения определяли уровень колонизации бифидобактерий, лактобацилл и Streptococcus faecium СТФ-1/56. В качестве исследуемого материала использовали гомогенизаты соскобов слизистой слепых отростков кишечника цыплят.
В течение всего эксперимента учитывали выделения ооцист эймерий с пометом (табл. 2.2.4).
Данные этих опытов представлены в таблицах 2.2.1-3 и на рис. 2.2.1-4. из них видно, что у инвазированных птиц в уровне колонизации нормальной микрофлоры на слизистой слепых отростков отмечены значительные
~ изменения по сравнению с уровнем колонизации контрольных
(незараженных) цыплят.
Степень и направленность этих изменений зависит от промежутка времени, прошедшего с момента заражения.
Так, фоновый уровень колонизации бифидобактерий за сутки до заражения цыплят ооцистами эймерий в контрольной и зараженной группах составлял 108 микроорганизмов в 1 г слизистой и не подвергся изменениям через 1 сутки после заражения (табл. 2.2.1, рис. 2.2.1).
Через трое суток с момента заражения наблюдали снижение количества
микроорганизмов, уровень которых падал на один порядок по сравнению с
контролем и составлял 107 микроорганизмов в 1 г слизистой.
ш Через пять дней после заражения отмечали резкое снижение
количества бифидобактерий, уровень которых снижался до 104 микроорганизмов/г слизистой, что на четыре порядка ниже по сравнению с уровнем колонизации контрольных цыплят.
Через семь суток после заражения (в день максимального выделения ооцист с пометом) количество бифидобактерий достигало минимального уровня и составляло 102 микроорганизмов/г слизистой, что на шесть порядков ниже уровня колонизации бифидобактерий у цыплят контрольной группы.
Таблица 2.2.4 Количество ооцист эймерий (КОЭ) в 1 г помета инвазированных цыплят в различные дни после заражения (ДПЗ)
В последующие дни инвазии происходило постоянное повышение уровня колонизации бифидобактерий у зараженных цыплят в тоже время количество выделяемых ооцист с пометом резко снижалось. Однако, количество бифидобактерий до последнего дня исследований оставалось более низким, чем в контроле. Так, на десятый день опытов уровень колонизации бифидобактерий возрос по сравнению с предидущим исследованием на четыре порядка и составлял 106 микроорганизмов/г слизисто^ а по сравнению с контролем он оставался еще на два порядка ниже. На 15 и 20-й дни эксперимента разница между показателями у птиц опытной и контольной групп продолжала сокращаться. В эти дни уровень колонизации бифидобактерий на слизистой слепых отростков был на один порядок ниже контрольного уровня.
Таким образом, количество бифидобактерий в 1г слизистой у зараженных ооцистами E.tenella цыплят начиная с третьего дня после заражения резко снижалось, и в период с 5-х по 7-е сутки на 4-6 порядков было ниже по сравнению с показателями контрольных цыплят.
Таблица 2.2.І Динамика бнфндобактернй в гомогенизате соскобов слизистой слепых отростков контрольных (К) и
зараженных эймериями (Э) цыплят. Уровень колонизации выражен в количестве микроорганизмов в 1 г слизистой
Рис. 2.2.1. Динамика бифидобактерий в гомогвниэате соскобов слизистой слепых отростков у контрольных(А) и зараженных эймериями (Б) цыплят в различные дни после заражения(ДПЗ) и динамика интенсивности
ооцистпродукции(В)
Г-количество ооцист (млн) в 1 г помета
Максимум снижения уровня колонизации совпадал с периодом наибольшего выделения ооцист во внешнюю среду с пометом.
Динамика изменения уровня колонизации лактобазилл у зараженных ооцистами эймерий цыплят была подобной колебаниям уровня колонизации бифидобактерий (рис. 2.2.4)
Так, через сутки после заражения уровень колонизации лактобацилл у цыплят контрольной и опытной групп существенно не отличался и составлял: 2,35+0,37-106 КОЕ в зараженной, (табл. 2.2.2, рис. 2.2.2)
Резкое снижение уровня колонизации лактобацилл отмечали на пятые сутки после заражения, когда он падал до 3,03+0,37-105 КОЕ, что на три порядка ниже по сравнению с контролем, где уровень колонизации составлял в этот день исследования 3,53+.0,56-108 КОЕ.
На седьмой день эксперимента уровень колонизации лактобацилл продолжал снижаться и составлял 5,31+0,56-103 КОЕ, что на пять порядков ниже по сравнению с контролем, где уровень колонизации был 2,81+0,48-108 КОЕ.
В последующие дни эксперимента (10, 15, 20) происходило резкое повышение количества КОЕ лактобацилл на слизистой слепых отростков.
Так, уровень колонизации этого микроорганизма на 10-й день исследования составлял в опытной группе 2,54+0,48-105 КОЕ, в то время как в контрольной группе - 2,23+0,50-108 КОЕ, а на 15-й день - соответственно 4,02±0,56-106 КОЕ и 3,51+0,65-108 КОЕ.
Следует отметить, что несмотря на повышение уровня колонизации лактобацилл в этот период, различия между контрольной и зараженной птицей оставались весьма существенными. Из таблицы 2.2.4 видно, что в этот период исследований происходило резкое снижение количества выделяемых ооцист с пометом.
Таблица 2.2.2 Динамика лактобацилл в гомогенизате соскобов слизистой слепых отростков контрольных (К) и зараженных эймериями (Э) цыплят. Уровень колонизации выражен в количестве колониеобразующих
единиц (КОЕ) в 1 г слизистой
Рис. 2.2.2. Динамика лактобацилл в гомогенизатв соскобов слизистой слепых отростков у контрольных (А) и зараженных аймериями (Б) цыплят в различные дни после заражения (ДПЗ) и динамика интенсивности
ооцистопродукции (В)
Г-количество ооцист (млн) в 1 г помета
Таким образом, уровень колонизации лактобацилл на слизистой слепых отростков кишечника цыплят, зараженных спорулированными ооцистами E.tenella на пятые сутки после заражения и в последующие дни резко снижался и достигал минимального значения на седьмые сутки эксперимента. В последующие дни он резко повышался, но даже к 20-му дню не достигал показателей контрольной группы. Максимум снижения уровня колонизации на седьмой день после заражения совпадал с наиболее интенсивным выделением ооцист с пометом.
Динамика изменений уровня колонизации Streptococcus faecium СТФ-1/56 на слизистой слепых отростков кишечника зараженных цыплят по ходу эксперимента имела сходную с бифидобактериями и лактобациллами направленность. Вместе с тем, степень происходящих при этом изменений была менее выражена (рис. 2.2.4).
Так, уровень колонизации Str. faecium СТФ-1/56 на первый день
эксперимента незначительно отличался о уровня контрольной группы (табл.
2.2.3, рис. 2.2.3). через трое суток после заражения количество КОЕ Str.
faecium снизилось на один порядок и составляло 1,92+0,36-107 КОЕ в группе
зараженных цыплят и 2,32+0,39-108 КОЕ в контрольной группе. С третьих
по седьмые сутки отмечалось постепенное снижение количества КОЕ Str.
faecium. Максимальное снижение уровня колонизации этого микроорганизма
приходилось на пятые и седьмые сутки после заражения цыплят ооцистами
эймерий. Уровень колонизации в эти дни составлял соответственно
3,81+0,60-105 и 7,34+0,53-105 КОЕ. В последующие дни у зараженных
цыплят происходило постепенное повышение уровня колонизации однако,
до последнего дня исследования он оставался более низким чем у не
зараженным цыплят. В частности, на 10-й день опыта он составлял 3,02
+0,49-106 КОЕ в опытной группе, в то время как у контрольной
2,35+0,43-108 КОЕ т.е. на два порядка ниже. На 15-й день разница составляла
всего один порядок, а на 20-й день эксперимента колонизация Str. faecium у зараженных цыплят достигал показателей контрольной группы и составлял 2,11±0,36-108КОЕ.
Таким образом, наиболее значительная разница уровня колонизации Str. faecium между контрольной группой и группой зараженных цыплят отмечалось на 5-7 сутки после заражения. В этот период он был ниже контрольного уровня на три порядка. Кроме того, максимум снижения количества КОЕ Str. faecium на седьмые сутки после заражения сопровождался наиболее значительным выделением ооцист эймерий с пометом (табл. 2.2.4).
Следовательно, у цыплят, экспериментально зараженных ооцистами E.tenella имеет место изменение уровня колонизации бифидобактерий, лактобацилл и Str. faecium. Хотя эти изменения проявляются в различной степени у каждого из исследованных микроорганизмов и направленность имеет в основном общую закономерность и зависит от сроков, прошедших с момента заражения птиц (рис. 2.2.4). в частности, в первые двое суток после заражения уровни колонизации этих микроорганизмов на слизистой слепых отростков кишечника мало отличался от таковых у незараженных цыплят. Через трое суток после их контаминации, происходило постепенное снижение количества КОЕ, с последующим резким снижением по сравнению с контролем вплоть до седьмого дня эксперимента. Максимум снижения уровней колонизации исследованных микроорганизмов сопровождался наиболее интенсивным выделением ооцист эймерий во внешнюю среду с пометом. В последующие дни эксперимента (10,15,20) наблюдалось повышение количества КОЕ всех трех микроорганизмов и приближение его к контрольному уровню. Выделение ооцист с пометом в этот период резко сокращалось.
Таблица 2.2.3
Динамика Streptococcus faecium СТФ-1/56 в гомогенизате соскобов слизистой слепых отростков контрольных (К) и зараженных (Э) цыплят. Уровень колонизации выражен в количестве
колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г слизистой
Г-КОЛИЧесТВО О ОЦИСТ (МЛН) В 1 Г ПОМета |затв соскобов слизистой слепых отростков у конторольных(А) и заражнных эймериями(Б) цыплят в различные дни после заражения(ДПЗ) и динамика интенсивности
ооцистопродукции(В).
2.2.4. Сопоставление уровней колонизации бифидобактерий(В),лактобацилл(А) и Streptococcus faeclum СТФ-
1/56(Б),динамика интенсивности ооцистопродуции(Г)
9 і
7^
з^
1 О
Д-количество ооцисг (мин) в 1 г помета
2.3. Влияние метода иммунохимиопрофилактики эймериозов кур на уровень колонизации нормальной микрофлоры кишечника.
В последние годы в нашей стране и за рубежом нашел широкое применение метод иммунохимиопрофилактики эймериозов, который как известно, предусматривает искусственное инвазирование птиц ооцистами эймерий с последующим применением антиэимериозных препаратов, не препятствующих образованию иммунитета, что позволяет ограничить проявление эймериозов на субклиническом уровне, но при этом, обязательным условием для формирования антиэймериозного иммунитета является прохождение стадии шизогонии и гаметогенеза в эпителиальных клетках слизистой кишечника.
В связи с этим, представляет практический интерес изучение влияния этого метода на уровень колонизации нормальной микрофлоры на слизистой слепых отростков.
С этой целью, за сутки до введения суспенции ооцист определяли фоновые уровни колонизации молочнокислых бактерий на слизистой слепых отростков. В десятидневном возрасте цыплятам вводили суспензию живых ооцист вакцинынх штаммов трех видов в количестве: E.tenella - 1500, Е. acervulina - 15000, Е. maxima - 500 ооцист в одной иммунизирующей дозе. После заражения цыплята в течение 7 дней получали обычный корм. Начиная с 8-го дня после иммунизации и до конца эксперимента цыплятам скармливали антиэймериозный препарат ампролплюсв дозе 0,5 мг/кг корма.
Через 1, 3,5, 7, 10, 15 и 20 суток после ввдения суспензии ооцист определяли уровень колонизации бифидобактерий, лактобацилл и Str. faecium СТФ-1/56 на слизистой слепых отростков кишечника. В качестве исследуемого материала использовали гомогенизаты соскобов слизистой оболочки.
По ходу эксперимента учитывали выделение ооцист E.tenella с пометом (табл. 2.3.4).
Результаты этих опытов представлены в таблицах 2.3.1-3 и на рис. 2.3.1-4.
Анализируя данные этих таблиц следует отметить, что у зараженных птиц в уровне колонизации молочнокислых бактерий на слизистой слепых отростков происходили значительные изменения по сравнению с уровнем колонизации контрольных (незараженных) цыплят.
Так, уровень колонизации бифидобактерий за день до заражения цыплят в контрольной и опытной группах составлял 108 микроорганизмов в 1 г слизистой и не подвергался изменениям через 1 и 3 дня после заражения (табл.2.3.1, рис. 2.3.1).
На пятые сутки после инвазирования цыплят уровень колонизации составлял 105 микроорганизмов/г слизистой, т.е. снизился на три порядка по сравнению с уровнем колонизации этого микроорганизма в контрольной группе. Через семь суток после заражения (в день максимального выделения ооцист с пометом) уровень колонизации бифидобактерий снизился еще на один порядок и составлял .микроорганизмов/г слизистой слепых отростков.
Таблица 2.3.І Динамика бифндобактерий в гомогеннзате соскобов слизистой слепых отростков кишечника цыплят контрольных (К) и зараженных суспензией ооцист вакцинных штаммов (В). Уровень колонизации
выражен в количестве микроорганизмов в 1 г слизистой
Рис. 2.3.1. Динамика бифидобактерий в гомогенизате соскобов слизистой слепых отростков у контольных(А) и зараженных суспензией ооцист вакцинных штаммов(Б) цыплят в различные дни после зараженияЩПЗ) и
динамика интенсивности оцистопродукции(В)
—А Б В
Д-количество ооцист (мин) в Ігпомета
Таблица 2.3.4 Количество ооцист E.tenella в 1 г помета цыплят, зараженных суспензией ооцист вакцинных штаммов в различные дни после
заражения (ДПЗ)
В последующие дни эксперимента отмечали постепенное повышение уровня колонизации бифидобактерий в группе цыплят, подвергнутых иммунохимиопрофилактике. Вместе с тем количество бифидобактерий до последнего дня исследований оставалось на более низком уровне по сравнению с контролем.
Так, через 10 дней после введения суспензии ооцист, уровень колонизации бифидобактерий повысился на три порядка по сравнению с показателем предыдущего исследования в этой же группе и составлял 107 микроорганизмов/г слизистой оболочки слепых отростков кишечника, но по сравнению с контрольным уровнем он оставался еще на один порядок ниже.
Через 15 дней после инвазирования цыплят уровень колонизации бифидобактерий оставался на один порядок ниже уровня контрольной птицы и не достигал и показателей даже к 20 дню эксперимента.
Таким образом, уровень колонизации бифидобактерий у цыплят подвергнутых иммунопрофилактике, начиная с пятого дня после введения суспензии ооцист, резко снижался и в день максимального выделения ооцист
с пометом, т.е. на седьмые сутки эксперимента, был ниже уровня контрольной группы на 4 порядка.
Динамика изменений уровня колонизации лактобацилл в группе цыплят, зараженных взвесью ооцист была сходной с изменениями уровня колонизации бифидобактерий (рис. 2.3.4).
Так, уровень колонизации лактобацилл за сутки до введения суспензии ооцист и в последующие три дня после инвазирования оставался неизменённым по сравнению с контрольной группой (табл.2.3.2).
На 5 сутки эксперимента отмечали резкое снижения уровня колонизации до 4,21+0,84-106 КОЕ, что на два порядка ниже по отношению к контролю, где он составлял 3,66+0,80-108 КОЕ.
На седьмые сутки после инвазии отмечено максимальное падение уровня колонизации этого микроорганизма, который составил 3,72+0,93-105 КОЕ, что на три порядка ниже уровня колонизации контрольной птицы. В последующие дни исследований (10, 15) отмечали постепенное повышение уровня колонизации лактобацил. В эти дни он составлял соответственно 2,29+0,56-106 и 3,33+0,80-107 КОЕ. Однако, даже к 20 дню после инвазии он не достигал показателя контрольной группы.
Таким образом, уровень колонизации лактобацилл в группе цыплят, зараженных взвесью ооцист, используемой при иммунохимиопрофилактике, на 5 сутки после заражения резко снижался и достигал минимального значения на седьмые сутки эксперимента. В последующие дни он постепенно повышался, но даже к 20 дню после инвазирования не достигал уровня контрольной группы цыплят. Максимальное значение количества лактобацилл на седьмые сутки эксперимента совпадало с наиболее интенсивным выделением ооцист с пометом.
Таблица 2.3.2 Динамика лактобацилл в гомогенизате соскобов слизистой слепых отростков кишечника цыплят контрольных (К) и зараженных суспензией ооцист вакцинных штаммов (В). Уровень колонизации выражен в количестве колониеобразующих единиц (КОБ) в 1 г слизистой
2.3.2 Динамика лактобацилл в гомогениэате соскобов слизистой слепых отростков у контрольных(А) и зараженных суспензией ооцист вакцинных штаммов(Б) цыплят в различные дни после эаражения(ДПЗ) и динамика интенсивности
ооцистопродукции(В)
