Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Инициация трансляции эукариот 13
1.1.1. Активация мРНК 13
1.1.2. Сборка 43S инициаторного комплекса 14
1.1.3. Загрузка мРНК, сканирование 5 НТО и выбор старт-кодона 17
1.1.4. Образование 80S 20
1.2. Элонгация трансляции эукариот 20
1.3. Терминация трансляции 25
1.3.1. Факторы терминации трансляции 25
1.3.2. Взаимодействие eRF1-eRF3 28
1.3.3. Факторы терминации трансляции в рибосоме 29
1.4. Рециклинг рибосом 35
1.5. Closed-loop мРНК 36
1.5.1 Closed loop. Протеолитическое расщепление факторов 38
1.6. РАВР 39
1.6.1. Структура 39
1.6.2. Изоформы и функции 41
1.7. PAIP1 43
1.7.1. Структура PAIP1 44
1.7.2. Изоформы и функции PAIP1 45
1.8. PAIP2 46
1.9. eIF4G 47
1.9.1. Структура eIF4G 47
1.9.2. Функции eIF4G 50
1.10. Заключение 52
Глава 2. Материалы и методы 53
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 53
2.2. Используемые среды 56
2.3. Используемые буферы и реактивы 56
2.4. Используемые антитела 58
2.5. Используемые ферменты 59
2.6. Используемые праймеры 59
2.7. Общие молекуляно-биологические методы, используемые в работе 60
2.7.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 60
2.7.2. Электрофорез в агарозном геле 60
2.7.3. Очистка фрагментов ДНК из агарозы 60
2.7.4. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 61
2.7.5. Лигирование ДНК 61
2.7.6. Переосаждение ДНК 61
2.7.7. Трансформация E. coli плазмидной ДНК 61
2.7.8. Анализ клонов методом ПЦР-скрининга 62
2.7.9. Выделение плазмидной ДНК из E. coli 62
2.7.10. Определение первичной структуры (секвенирование) ДНК при помощи автоматической системы Applied Biosystems ABI 310. 62
2.7.11. Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ 62
2.7.12. Электрофорез нуклеиновых кислот в денатурирующем ПААГ 63
2.7.13. Иммуноблотинг 63
2.8. Выделение и очистка белков 63
2.8.1.Выделение компонентов для реконструированной системы трансляции 63
2.8.2. Экспрессия и выделение PABP 64
2.8.3. Выделение и очистка GST химер PAIP1, PAIP2, p100, p50,. МА3, eIF4G2 64
2.8.4. Выделение и очистка PAIP1, PAIP2, p100, МА3, W2, p50, eIF4G2, p86 64
2.8.5. Экспрессия и выделение eRF3a 65
2.9. Получение мРНК для реконструированной системы in vitro 66
2.10. Сборка преТК 67
2.11. Тоу-принт анализ 67
2.12. Анализ гидролиза пептидил-тРНК 67
2.13. GTPазный тест 68
2.14. Pull down анализ 68
2.15. Cвязывание факторов с ТК 68
2.16.Связывание факторов с рибосомами 69
2.17. Гель-фильтрация белковых комплексов 69
2.18. Получение кэпированных мРНК для люциферазного теста в бесклеточной системе трансляции 69
2.19. Люциферазный тест в бесклеточной системе трансляции 70
2.20. Статистическая обработка данных 70
Глава 3. Результаты и их обсуждение 71
3.1. PABP стимулирует эукариотическую терминацию трансляции 71
3.1.1. РАВР стимулирует узнавание стоп кодона 71
3.1.2. PABP стимулирует образование ТК в присутствии негидролизуемого аналога GTP -GDPCP 73
3.1.3. PABP связанный с поли(А) хвостом стимулирует образование ТК 74
3.1.4. РАВР стимулирует гидролиз пептидил-тРНК 76
3.1.5. РАВР не влияет на GTPазную активность eRF3 78
3.1.6. C – концевая часть РАВР необходима и достаточна для стимуляции терминации трансляции 79
3.1.7. РАВР стимулирует загрузку комплекса eRF1eRF3a в вакантную 80S рибосому 80
3.1.8. PABP диссоциирует от eRF3а после загрузки в рибосому 83
3.1.9. Разработка методов связывания белков с преТК 84
3.1.10. PABP стимулирует загрузку комплекса eRF1eRF3a в преТК 84
3.1.11. Модель механизма действия РАВР на терминацию трансляции 86
3.2. Эффекты PAIP1 и PAIP2 на терминацию трансляции эукариот 87
3.2.1 Количественная оценка результатов toe-print анализа 87
3.2.2. PAIP1 влияет на формирование терминационного комплекса 88
3.2.3. PAIP1 не влияет на узнавание стоп кодона в присутствии GDPCP 89
3.2.4. PAIP1 взаимодействует с eRF3 90
3.2.5. PAIP1 и PAIP2 подавляют стимулирующий эффект PABP на формирование ТК 92
3.2.6. PAIP2 отменяет эффект PAВР на гидролиз-пептидил-тРНК 94
3.2.7. PAIP1 и PAIP2 стимулируют сквозное чтение стоп кодонов 95
3.2.8. Модель действия PAIP1 и PAIP2 в терминации трансляции 98
3.3. eIF4F стимулирует терминацию трансляции эукариот 99
3.3.1. Гидролиз пептидил-тРНК стимулируется разными формами eIF4G 100
3.3.2. GTPазная активность eRF3 активируется MIF4G доменом. 103
3.3.3. Обе изоформы eIF4G стимулируют образование ТК 107
3.3.4. eIF4G связывается с обоими факторами терминации трансляции различными доменами 110
3.3.5. eIF4G не стимулирует загрузку факторов терминации в рибосому 114
3.3.6. Эффекты других белков на активность eIF4G в терминации трансляции 115
3.3.7. Модель стимуриующего эффекта eIF4G в терминации трансляции эукариот 118
3.4. Инициаторная метиониновая тРНК стимулирует формирование ТК 119
3.5. Эффекты факторов формирующих closed loop на терминацию трансляции 120
Глава 4. Заключение 122
Выводы 123
Список использованной литературы 124
- Элонгация трансляции эукариот
- Структура eIF4G
- РАВР стимулирует загрузку комплекса eRF1eRF3a в вакантную 80S рибосому
- Эффекты других белков на активность eIF4G в терминации трансляции
Элонгация трансляции эукариот
Элонгация, или удлинение пептидной последовательности пошагово на одну аминокислоту – суть трансляции. Общая схема элонгации представлена на Рис. 4. Это очень консервативный процесс, крайне схожий у прокариот и эукариот. Интересно, что рибосома сама по себе может проводить элонгацию без всех белковых факторов, они являются лишь катализаторами этого процесса [17]. На первой стадии происходит декодирование (установление правильной кодон-антикодоновой связи) и аккомодация тРНК (позиционирование в А-сайте). При этом происходят перестройки рибосомы, называемые rolling. Для доставки Аа-тРНК в рибосому у эукариот используется фактор eEF1A (у бактерий гомолог EFu), который является GTPазой. Он состоит из трех доменов:
GTPазного и двух -бочонков (Рис. 5). При связывании GTP эти домены сближаются и компактизуются, эффекторная петля приобретает частично -структуру (Рис. 5А). При этом он приобретает сродство к Аа-тРНК и рибосоме. Комплекс Аа-тРНК–eEF1A–GTP связывается с сарцин-рициновой петлей в основании Р-стержня большой субъединицы. Связываясь таким образом с рибосомой АС шпилька Аа-тРНК попадает в А-сайт, где происходит первичный отбор. Если кодон-антикодоновую пару образовать не удалось, комплекс диссоциирует. Если первичный отбор пройден, то образуется уотсон-криковкая кодон-антикодоновая пара, что усиливает взаимодействие eEF1A c рибосомой. 18S рРНК также взаимодействует с малой бороздой получившегося дуплекса, в результате чего голова 40S как бы наклоняется к телу. Состояние тРНК в данной стадии описывается a/Т (от EFu), p/P. GTPаза активирующий центр (GAC) рибосомы позволяет G домену eEF1A гидролизовать GTP. Это приводит к понижению его сродства к рибосоме и к Аа-тРНК. В результате этого АА шпилька тРНК попадает в пептидил-трансферазный центр (ПТЦ) А-сайта, и фактор eEF1A диссоциирует. Это состояние рибосомы описывается формулой a/A, p/P [17]. Обмен GDP на GTP в eEF1A осуществляет специальный обменник – eEF1B [74]. Он состоит из трех субъединиц: каталитических и , а также скэфолд субъединицы . Интересно, что субъединица обладает еще и глутатион-S трансферазной активностью. eEF1 в эукариотических клетках может находится как в виде индивидуального белка, так и в виде комплекса с eEF1B и валиновой аминоацил-тРНК синтетазой (eEF1H) [75].
Следующая стадия элонгации трансляции – транспептидация – происходит в ПТЦ, где рибосома проявляет себя как рибозим. В ПТЦ сближаются ССА концы тРНК, а их донорная (пептидил-тРНК) и акцепторная группы (Аа-тРНК) расположены в благоприятном для реакции положении, т.е. проходит стерический катализ реакции. Атом азота аминогруппы Аа-тРНК взаимодействует водородными связями с N3 атомом аденина рРНК в ПТЦ (у прокариот А2451) и О2 атомом концевого аденина ССА конца этой тРНК, что оттягивает протоны, увеличивая заряд электронной пары азота. Таким образом идет также катализ микроокружением. Эта аминогруппа атакует по SN2 нуклеофильному механизму карбоксильный атом сложноэфирной связи между последней аминокислотой и тРНК молекулы пептидил-тРНК. Таким образом, а А-сайте оказывается пептидил-тРНК, а в Р-сайте – деацилированная тРНК [17, 76, 77].
Последняя стадия элонгации – транслокация, т.е. перемещение тРНК внутри рибосомы. Она осуществляется за счет крупноблочной и межсубъединичной подвижности рибосом [78]. После транспептидации рибосома находится в претранслокационном состоянии, которое имеет несколько основных и множество промежуточных конформаций [79]. Состояние classic I – пептидил-тРНК в А-сайте, деацилированная тРНК в Р-сайте. При этом имеется ряд контактов АС шпильки пептидил-тРНК с рРНК 40S и 60S, в Р-сайте также есть взаимодействие тРНК с рибосомными шпильками, помимо кодон-антикодоновой связи. В Е-сайте эукариот, в отличие от прокариот, тРНК не взаимодействует с мРНК, но взаимодействует с rpLe1 белком (у дрожжей имеется дополнительное взаимодействие ССА конца с rpL44e). Спонтанно может происходить переход в classic II конформацию, сопровождающийся вращением 40S субъединицы относительно 60S субъединицы приблизительно на 2 против часовой стрелки. В этом состоянии теряется часть контактов тРНК с рибосомой: пептидил-тРНК разрывает связь с ASF (A-site finger) – удлинением шпильки Н38, участвующей в межсубъединичых мостах. Это приводит к открытию А-сайта. Это вызывает увеличение подвижности тРНК в А-сайте, и ее CCA конец, содержащий пептидил двигается в сторону Р-сайта, соответственно ССА конец деацилированной тРНК переходит в Е-сайт. Такое перемещение происходит спонтанно, т.к. сродство Е- и Р-сайтов выше к деацилированной и пептидил-тРНК соответственно, это состояние называется rotated I и характеризуется формулой а/Ар р/Е. При этом происходит вращение 40S субъединицы еще на 5-8. При транслокации также перемещается центральный протуберанец 60S субъединицы, что наклоняет 40S субъединицу приблизительно на 20 от межсубъединичной плоскости. Далее пептидил-тРНК в А-сайте, устанавливает связь с белком rpLe11, что характерно для тРНК в Р-сайте в classic I состоянии. Это стимулирует дальнейший полный переход пептидил-ССА конца в Р-сайт. Получившиеся гибридное состояние характеризуется а/Р р/Е и называется rotated II. Для эукариотических рибосом предпочтительнее rotated состояние (80% от общего пула рибосом), в отличие от прокариот (40% от общего пула рибосом). C рибосомой в этом состоянии связывается элонгационный фактор eEF2. Он состоит из пяти доменов, домены I, II, V – гомологичны доменам eEF1A (Рис. 6А). Эти домены участвуют в связывании с GAC у основания Р-стержня на 60S субъединицы. Домены II и IV функционально выполняют роль тРНК: IV домен входит в А-сайт, взаимодействует с ССА концом гибридной пептидил-тРНК в Р-сайте, и вызывает транслокацию. Фактор eFE2 являет собой пример молекулярной мимикрии, будучи структурно схожим с комплексом Aa-тРНКeEF1A (Рис. 6Б). В домене IV есть уникальная модификация гистидина – дифтамид, необходимость которой у эукариот все еще не доказана. При транслокации – антикодоновые шпильки тРНК перемещаются из А-сайта в Р-сайт, и из Р-сайта в Е-сайт. Это движение сопровождается передвижением мРНК внутри рибосомы. Установлено, что триплетность транслокации задается триплетностью антикодона – в экспериментах с искусственными тРНК с антикодонами, содержащими 4 основания, шаг транслокации соответствовал 4 нуклеотидам.
При передвижении тРНК-мРНК комплекса в рибосоме происходит вращение головы 40S – swiveling, этот процесс облегчается присоединением фактора элонгации eEF2. Вращение головы 40S не зависит от межсубъединичного вращения. После перемещения рибосомы на один кодон происходит обратное вращение между субъединицами – back rotation, рибосома возвращается в classic состояние. После транслокации eEF2 гидролизует GTP, теряет сродство к рибосоме и диссоциирует. Рибосома переходит в посттранслокационное состояние (которое подразделяется на 3 субсостояния) с вакантным А-сайтом [17, 79-81].
Существуют и другие факторы, участвующие в элонгации – eEF3 у дрожжей, извлекающий деацилированую тРНК из Е-сайта, eIF5A c уникальной модификацией лизина – гипузином, который связывается с E-сайтом и стимулирует элонгацию на полипролиновых последовательностях [82-84].
Структура eIF4G
eIF4G – большой (175 кДа, подвижность в ПААГ – 220 кДа) мультидоменный полипептид, который можно структурно и функционально разделить на три большие части – N, M, C (Рис. 16А) [133]. N-концевая треть белка преимущественно неструктурирована и ответственна за связывание кэпа и формирование closed-loop структур на мРНК. На N-конце eIF4G содержится участок связывания SLIP1 белка (27-129 а.о.), который связывается с 3 концевой шпилькой гистоновых мРНК вместо РАВР [180]. Таким образом SLIP1 участвует в формировании close loop структуры на этих специфичных мРНК. Далее в eIF4G после SLIP связывающего участка находится РАМ1 мотив (166-200 а.о.), связывающийся с RRM2 доменом РАВР, что также формирует closed-loop структуру [158]. Через неструктурированный линкер расположен участок связывания с eIF4E (409-457 а.о.), содержащий консервативный мотив YDREFLL [181].
Этот участок (4EB) является внутренне-разупорядоченным – он структурируется при связывании с eIF4E – образуются две спирали между которыми находится неструктурированный 10 а.о. участок [181-183]. Первая спираль содержит вышеупомянутый гидрофобный консервативный мотив. После 4EB мотива находится неструктурированный линкер, содержащий сайты расщепления вирусными протеазами [184]. Далее начинается средняя часть белка, содержащая домен MIF4G. В разных работах указаны различные границы этого домена: 751-993, 672-970, 672-867, 722-949, 762-989 [62, 185-188]. Этот домен относится к семейству НЕАТ доменов, содержащих 10 -спиралей уложенных в 5 антипараллельных тандемов, таким образом, что они формируют правозакрученный домен (Рис. 16Б-Д). Рис. 16. А. Схемы доменной организации eIF4G1, p100, p50, eIF4G2, p86. Серыми линиями указаны места взаимодействия доменов с белками или РНК. Б. Кристаллическая структура MIF4G домена eIF4G3, HEAT тандемы отмечены разными цветами и цифрами. В. MIF4G домен eIF4G3 повернут на 90. Г. Поверхность MIF4G домена. Д. Поверхность MIF4G домена, повернуто на 90. Е. Участки взаимодействия eIF4A (голубой), и EMCV IRES (серый). Ж. Участки взаимодействия eIF4A (серый), и EMCV IRES (голубой), повернуто на 90. Б-Ж. по [189] с изменениями. З. Кристаллическая структура MA3 домена eIF4G1. И. Кристаллическая структура W2 домена eIF4G1, по [190].
Кристаллическая структура этого домена получена для изоформы eIF4G3, в которой домен MIF4G идентичен таковому у eIF4G1 на 80%. Каждая из спиралей тандема формирует одну из двух поверхностей. Межтандемные и внутритандемные петли находятся на противоположных поверхностях домена. Соседние повторы взаимодействуют электростатически и через взаимодействие Ван-дер-Ваальса. Между тандемами 1 и 2, а также 3 – 4 и 4 – 5 угол вращения составляет +25, между повторами 2 и 3 -50. Длина петель между тандемами 2 и 3, а также внутри 3-го тандема большая, что увеличивает ее подвижность и не позволяет получить ее структуру [189]. После HEАТ домена находится участок связывания eIF3 длиной примерно 100 а.о., некоторые авторы включают его в состав MIF4G домена [64, 191]. При действии HIV протеазы образуется фрагмент, содержащий только этот домен, при этом этот пептид способен участвовать в инициации в in vitro системах [187]. После MIF4G домена находится неструктурированный 155 а.о. линкер. С-концевой участок содержит два НЕАТ домена – МА3 (1235-1426 а.о.) и W2 (1438-1593 а.о.), соединенные 13 а.о. линкером. Они также содержат несколько спиральных тандемов, но имеют некоторые различия в укладке, и являются нетипичными НЕАТ доменами. MA3 домен содержит 5 НЕАТ повторов, которые образуют компактный домен, углы между тандемами составляют около -45. В петлях между 5 и 6, 7 и 8 спиралью находятся небольшие -спирали (Рис. 16З). После 10-я спираль фланкирована короткими 310 спиралями. W2 домен содержит только 4 HEAT повтора. В шпильке внутри 2-го тандема присутствуют два -слоя (Рис. 16И). В W2 домене содержится так называемый aromatic and acidic box (АА-бокс). Первый АА-бокс содержится в спиралях 6-7, второй в 8-й спирали. Каждый бокс содержит 14 консервативных гидрофобных аминокислотных остатака, четыре из которых являются ароматическими [190].
У eIF4G1 есть изоформа eIF4G3 (eIF4GII), содержащая те же домены, они идентичны с eIF4G1 только на 46%, но отдельные домены MIF4G, MA3, W2 на 83%, 66% и 82% соответственно [133]. В клетках существует также белок eIF4G2 (DAP5, p97, NAT1) [192]. Он не содержит РАВР и eIF4G связывающего участков, но также содержит HEAT домены. Идентичность eIF4G2 и eIF4G1 составляет 28%, для MIF4G домена 39% [133]. MIF4G домен eIF4G2 расположен с 78 по 309 а.о., МА3 с 545 по 658 а.о., W2 с 824 по 907 [193]. По структуре MIF4G белка eIF4G2 напоминает этот домен у eIF4G: 5 НЕАТ тандемов, образующих правозакрученный суперсоленоид (Рис. 17А, Б). Между 2 и 3 тандемом имеется поворот на -50. Основным отличием являются длины петель, особенно удлинена петля между тандемами и 2 и 3, петля между спиралями в 3-м тандеме структурирована [194]. МА3 домен содержит 5 тандемов и содержит 5 коротких спиралей 310: фланкирует 3 спираль, между 7 и 8 спиралями, две спирали 310 расположены между 9 и 10 -спиралями (Рис. 17 В). Поворот между спиралями в МА3 составляет -45, т.е. это нетипичный НЕАТ домен. Между МА3 и W2 доменом находится короткая 310 спираль.
Кристаллическая структура доменов eIF4G2. А. MIF4G домен eIF4G2. Б. Поверхность MIF4G домена eIF4G2, по [194], с изменениями. В. Структура участка eIF4G2, содержащая МА3 и W2 домены, по [193], с изменениями.
В W2 домене eIF4G2 содержится 4 HEAT тандема и короткая -спираль между 1 и 2 тандемами (Рис. 17В). В отличие от eIF4G1, домен W2 eIF4G2 не содержит -тяжей [193].
РАВР стимулирует загрузку комплекса eRF1eRF3a в вакантную 80S рибосому
Для того чтобы понять, как РАВР влияет на взаимодействие факторов с рибосомами мы провели эксперименты по их связыванию. После инкубации интересующих белков с рибосомами их центрифугировали в градиенте плотности сахарозы и детектировали их во фракциях иммуноблоттингом. Для детекции 40S субъединиц во фракциях использовали антитела против рибосомного белка rpS15e. Мы наблюдали два пика: фракции 3-7 и 8-14, соответственно содержащие 40S и 80S (Рис. 24). Иммуноблотинг с использованием антител против рибосомного белка rpL9е позволил детектировать 60S субъединицы в пике состоящем из фракций 7-15 (Рис. 24А). Таким образом, 80S рибосомы присутствуют во фракциях 7-14, содержащих обе рибосомные субъединицы.
Прежде всего, мы проверили как индивидуальные белки eRF1, eRF3a, eRF3c и PABP связываются с 80S рибосомой. Мы обнаружили, что факторы eRF3c и eRF3a связываются с рибосомами по-разному (Рис. 24В, 25). eRF3c детектируется вдоль всего градиента, т.е. связывается как с 40S, так и с 60S (Рис. 24В). Для того чтобы исключить агрегацию eRF3c, мы проверили его распределение в сахарозном градиенте без рибосом. Рис. 24. Распределение различных факторов трансляции и рибосом при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы. А. Иммуноблотинг распределения рибосомных субъединиц в результате центрифугирования 80S или ТК. Детекция антителами против rpS15e, rpL9e. Б. Иммуноблоттинг распределения индивидуальных белков eRF1, eRF3a, eRF3c, PABP и их комплексов при центрифугировании. Детекция антителами против соответствующих белков. В. Иммуноблоттинг распределения инкубированных с 80S eRF1, eRF3c, РАВР, РАВР при центрифугировании. Детекция антителами против соответствующих белков. Числа над блотами соответствуют номерам фракций.
Оказалось, что сам по себе eRF3c присутствует только в 3-х верхних фракциях (Рис. 24Б). Это указывает на неспецифичное связывание eRF3c с рибосомами. Большая часть eRF3a обнаруживалась в верхних фракциях градиента, не взаимодействуя с рибосомами. Немного этого белка детектировалось во фракциях 4-7, содержащих 40S, но он полностью отсутствовал во фракциях 8-13, содержащих 80S рибосомы (Рис. 25Б). Как оказалось, PABP способен связываться как с 40S так и с 80S рибосомами, поскольку детектировался в соответствующих пиках (Рис. 24В). По-видимому, это результат его неспецифической РНК связывающей активности, обеспечиваемой доменами RRM3-RRM4. Урезанная форма, PABP, не имеющая этих доменов, была неспособна связывать 40S субчастицы рибосом. Иммуноблотинг показал, что PABP содержится в 10-12 фракции, соответствующих 80S (Рис. 24В). Стоит отметить, что плохое качество окраски вызвано слабым сигналом, что по-видимому связано с природой PABP. Индивидуальный eRF1 не взаимодействовал с рибосомами, находясь в верхних фракциях градиента 1-4 (Рис. 24В).
PABP улучшает связывание eRF3a c 80S. А. Иммуноблоттинг распределения факторов eRF1 и eRF3 во фракциях после центрифугирования комплексов 80S+eRF1eRF3a и 80S+eRF1eRF3с в присутствии и отсутствии РАВР. Б. Иммуноблоттинг распределения eRF3a во фракциях после центрифугирования комплексов 80S+eRF3a в присутствии и отсутствии РАВР. В. Иммуноблоттинг распределения eRF3a во фракциях после центрифугирования комплексов 80S+eRF3a в присутствии РАВР. Детекция антителами против соответствующих белков. Числа сверху блотов соответствуют номеру фракции. Красными рамками отмечены фракции, где содержится 80S. Добавление комплекса eRF1eRF3с к 80S рибосомам не изменяет распределения eRF3c в градиенте (Рис. 25А). Этот паттерн взаимодействия eRF3c с рибосомами указывает на неспецифическую РНК-связывающую активность eRF3c. Добавление eRF1 к 80S рибосомам преассоциированным с eRF3a, не изменяло распределение eRF3a (Рис. 25А). Однако, проассоциированные eRF1eRF3a добавленные к 80S рибосомам уменьшает связывание eRF3a c 40S субъединицам, поскольку eRF3a детектировался в этом случае во фракциях 1-4 (Рис. 25А,Б ). Эти данные показывают, что eRF3a связанный с eRF1 обладает меньшим сродством к рибосомам, чем индивидуальный eRF3a.
Как и ожидалось, инкубация PABP с комплексом eRF1eRF3c не влияла на распределение eRF3c в градиенте, поскольку РАВР не связывается с eRF3c (Рис. 25А). Взаимодействие PABP с комплексом eRF1eRF3a изменяет паттерн распределения eRF3a: он детектируется во фракциях 4-8 (40S) и 9-14 (80S) (Рис. 25А). Таким образом, РАВР стимулирует связывание eRF1eRF3a комплекса с 80S рибосомами. Это предположение согласуется с описанными выше экспериментами по узнаванию стоп кодона и гидролизу пептидил-тРНК. Похожий эффект проявлялся, когда преассоциированный комплекс eRF3aPABP добавлялся к 80S рибосомам (Рис. 25Б). Кроме того, мы обнаружили, что PABP влияет на связывание eRF3a с 80S рибосомой. Комплекс eRF1eRF3aPABP был добавлен к 80S рибосоме. Мы нашли, что PABP сходным с полноразмерным PABP образом увеличивает сродство eRF3a к 80S рибосоме (Рис. 25В).
Эффекты других белков на активность eIF4G в терминации трансляции
Оба домена MIF4G и MA3 вовлеченные в стимуляцию терминации трансляции взаимодействуют с другими белками, в первую очередь с хеликазой eIF4A и фактором инициации трансляции eIF3. Поэтому мы решили установить, как взаимодействие eIF4A с eIF4G будет влиять на функцию последнего в терминации трансляции. Для этого мы провели гидролиз пептидил-тРНК, GTPазный тест, и pull down анализ. p100 преинкубировали с 4-х кратным избытком eIF4A или мутанта eIF4A(R362Q), неспособного диссоциировать от eIF4G. Затем этот комплекс добавлялся к преТК, затем добавлялись терминационные факторы и определяли эффективность гидролиза пептидил-тРНК по высвобождению радиоактивного пептида MVHL.
Влияние белков-партнеров eIF4G1, на эффект eIF4G1 в терминации трансляции. А. Влияние eIF4A и его мутанта eIF4A(R362Q) на эффект р100 в гидролизе пептидил-тРНК. Б. Влияние eIF4A и его мутанта eIF4A(R362Q) на эффект р50 в GTPазном тесте. В. Влияние eIF4A и eIF3 на эффект р50 в GTPазном тесте. n – число повторов, достоверное отличие от контроля р 0.01. Г. Pull down анализ взаимодействия р50 с eRF3a в присутствии eIF4A или его мутанта R362Q. Pull down анализ взаимодействия МА3 с eRF1 в присутствии eIF4A. Представлены сканы иммуноблотинга с использованием соответствующих антител. К – контрольный белок, п – промывка, э – элюция.
Взаимодействие p100 c eIF4A и его мутантом слабо, но значимо понижало эффект p100 в терминации трансляции (Рис. 50А), а сам eIF4A не влиял на терминацию. В GTPазном тесте преинкубация eIF4A или его мутанта с р50 не влияли на p50 (Рис. 50Б). Также мы решили проверить эффект eIF3 вместе с eIF4A на GTPаз стимулирующую активность р50. Мы показали, что формирование комплекса eIF4A-р50-eIF3 (факторы были добавлены в равных количествах) не влияли на функцию р50 в GTPазном тесте (Рис. 50В).
PAIP1 конкурирует с р50 в GTPазном тесте. n – число повторов, достоверное отличие от контроля р 0.01.
Сам по себе eIF3 не оказывал эффекта на гидролиз GTP. При проведении pull down анализа не обнаружили влияния eIF4A или мутанта R362Q на взаимодействие между p50 и eRF3a (Рис. 47Г).Также не обнаружили эффекта eIF4A на взаимодействие MA3 c eRF1 (Рис. 50Г). Эти результаты показывают, что связывание eIF3 и eIF4A с eIF4G не влияет на взаимодействие MIF4G c eRF3 и MA3 c eRF1. Вероятно, участки связывания в eIF4G c eIF4A и с терминационными факторами не пересекаются или пересекаются незначительно, что позволяет образовывать комплекс.
Поскольку мы обнаружили два белка, содержащие гомологичные домены и связывающиеся с eRF3 – eIF4G и PAIP1, мы решили посмотреть, как они будут функционировать при совместном добавлении в терминацию трансляции. Мы решили проверить этот эффект в GTPазном тесте, т.к. eIF4G активен в нем, а PAIP1 неактивен. Мы провели GTPазный тест, как описано ранее и добавили в реакцию помимо р50 еще и PAIP1. Мы обнаружили снижение активности p50, что очевидно связано с конкуренции PAIP1 с ним за связывание с eRF3 (Рис. 51). Это может служить доказательством функциональной конкуренции между eIF4G и PAIP. Также это подтверждает предположение, что PAIP1 взаимодействует с eRF3 посредством MIF4G домена.