Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Общие сведения о геморрагической лихорадке с почечным синдромом
1.2 Молекулярная биология, филогения и зоогеография хантавирусов
1.2.1 Зоогеография хантавирусов 15
1.2.2 Особенности организации генома хантавирусов 20
1.2.3 Синтез вирусной РНК и созревание вирионов 29
1.2.4 Функции вирусных белков 35
1.3 Вакцины 38
1.3.1. Генно-инженерные вакцины 38
1.3.2 ДНК-вакцины. Особенности генетической иммунизации 38
1.3.3 Преимущества ДНК-вакцин и возможные ограничения в их применении
1.3.4 Вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом.
Глава 2 Объект и методы исследований 53
2.1 Краткая характеристика объектов исследований 53
2.2 Выделение и очистка тотальной РНК из образцов легочной ткани рыжей nojiQBKii.(Clethrionomys glareolus) 54
2.3 Выделение и очистка суммарной РНК из образцов крови больных, заболевших ГЛПС. 55
2.4 Выделение и очистка плазмидной ДНК 56
2.5 Выделение плазмидной ДНК методом мягкого лизиса 58
2.6 Удаление РНК из препаратов плазмидной ДНК. 59
2.7 Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами
2.8 Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях 60
2.9 Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатуриругощих условиях 62
2.10 Синтез кДНК 62
2.11 Полимеразная цепная реакция 62
2.12 Элюция ДНК из агарозных гелей 63
2.13 Концентрирование ДНК бутанолом 65
2.14 Приготовление компетентных клеток 65
2.15 Приготовление вектора для клонирования 66
2.16 Секвенирование ДНК 67
2.17 Цитирование вектора и фрагмента ДНК
2.18 Трансформация компетентных клеток Е.соИ плазмидной ДНК 67
2.19 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 68
2.20 Индукция lac промотора 70
2.21 Электрофорез полипептидов Е. coli 70
2.22 Твердофазный иммуноферментный анализ 72
2.23 Реактивы и материалы 72
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 75
Заключение 106
Выводы 106
Список литературы 108
- Особенности организации генома хантавирусов
- Преимущества ДНК-вакцин и возможные ограничения в их применении
- Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях
- Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
Введение к работе
Актуальность проблемы. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - широко распространенное в странах Евроазиатского континента природно-очаговое заболевание, вызываемое хантавирусной инфекцией. В Европейской части Российской Федерации на территории Республики Башкортостан (РБ) находится самый крупный и активный природно-зоонозный очаг этого заболевания. Основным возбудителем ГЛПС в Башкортостане является хантавирус се-ротипа Пуумала (PUU). В Восточной Сибири и на Дальнем Востоке, ГЛПС с более тяжелой формой вызывается серотипом Сеул (SEU) и Хантаан (HTN). Актуальность изучения проблемы обусловлена отсутствием тенденции к снижению заболеваемости, тяжестью течения с развитием различных тяжелых осложнений (ток-сико-инфекционный шок, почечная недостаточность, разрыв почек, тромбогемор-рагический синдром, кровоизлияние) и значительным экономическим ущербом. К сожалению, на сегодняшний день еще не получены эффективные специфические средства для профилактики и этиотропной терапии ГЛПС. Динамика заболеваемости ГЛПС в республике характеризуется эпидемическими вспышками каждые 3-4 года. Подобные вспышки связаны с массовым размножением рыжих полевок и высоким уровнем инфицированности грызунов - природного резервуара для вируса. Кроме того, подъем заболеваемости ГЛПС в годы с низкой численностью полевок, а также отличия в тяжести инфекционного процесса могут быть вызваны, в том числе, антигенной вариабельностью и разной степенью патогенности циркулирующих на территории РБ штаммов хантавирусов, возбудителей ГЛПС. Передача вируса от грызуна к человеку происходит в основном воздушно-капельным путем и через экскременты животных (Schmaliohn et al., 1985; Chu et al., 1994; Avsic-Zupanc et al., 1995). Ежегодно по всему миру фиксируется более 150-200 тысяч случаев заболевания ГЛПС.
Эффективность лечения любого заболевания определяется его точной диагностикой на раннем этапе заболевания. Для диагностики ГЛПС наиболее широко используются методы, основанные на детекции специфических антител. В них используется фиксированный ацетоном антиген, полученный из культуры клеток
Vero E6, инфицированных патогенным хантавирусом (Lee et al., 1985). Получение подобного препарата является весьма трудоемкой и опасной процедурой. Альтернативой традиционному получению антигена может стать рекомбинантный вирусный белок, синтезированный в про- или эукариотической системе экспрессии. При наличии эффективных штаммов-продуцентов получение рекомбинантного белка потребует значительно меньше времени, кроме того, отсутствует необходимость работы непосредственно с вирусом.
Разработанные и лицензированные на сегодняшний день вакцинные препараты для профилактики ГЛПС представляют собой «живые» аттенюированные вакцины, созданные на основе вирусов серотипов HTN и SEU, циркулирующих, преимущественно, в странах Азии - Китае и Южной Корее (Song et al., 1998; Lee et al., 2001). К тому же, по ряду сообщений, указанные вакцинные препараты индуцируют низкий уровень синтеза нейтрализующих антител у иммунизированных людей. На территории России основным возбудителем ГЛПС является вирус серо-типа PUU, и поэтому нет оснований утверждать, что данные вакцины окажут эффективное профилактическое действие. В качестве альтернативы обычным вакцинам уже разработаны и разрабатываются новые рекомбинантные вакцины, например, от гепатита В и С (Спасокукоцкий, 2000). Стратегия создания таких вакцин сводится к клонированию гена, чей продукт при экспрессии в подходящей системе приведет к продукции белка, способного вызвать при введении в организм человека синтез вируснейтрализующих антител. Еще одним направлением в области ре-комбинантных технологий является разработка ДНК-вакцин. Принцип ДНК-вакцинации основан на введении в организм векторной ДНК, несущей гены белков, продукция которых приведет к полноценному иммунному ответу. Данный подход позволил получить антитела к множеству антигенов инфекционных патогенов вирусной и бактериальной природы (Dertzbaugh et al., 1997). В настоящее время, в ряде стран Западной Европы, а также в Китае и Южной Корее активно ведутся исследования, направленные на создание ДНК-вакцин для лечения и профилактики ГЛПС. Однако до введения ДНК-вакцин в медицинскую практику необходимо провести эксперименты, подтверждающие их эффективность и безопасность.
Цель работы заключалась в исследовании структуры гена поверхностного гликопротеина G2 хантавируса, выделенного из зоонозного очага на территории Республики Башкортостан и создании системы получения рекомбинантного белка G2 в клетках Е. coli.
Задачи исследования:
Амплификация, клонирование и секвенирование гена гликопротеина G2 хантавируса, выделенного из органов грызунов и крови больных ГЛПС на территории Республики Башкортостан;
Анализ нуклеотидной и выведенной из нее аминокислотной последовательности клонированного гена гликопротеина G2 и сравнение с аналогичными последовательностями исследованных ранее вирусов;
Получение генетической конструкции, содержащей ген поверхностного гликопротеина G2 исследуемого хантавируса, способного экспрессироваться в прокариотической системе;
Получение рекомбинантного белка G2 в клетках Е. coli.
Научная новизна. Установлено, что на территории Республики Башкортостан циркулирует хантавирус Ufa-2005 серотип PUU. Определена полная последовательность кодирующей области гена G2. Получена генно-инженерная конструкция на основе векторов pBluescript и pPinPoint, включающих в себя ген гликопротеина G2 хантавируса серотипа PUU, экспрессия которого регулируется бактериальным lac промотором. Показана возможность экспрессии полноразмерного белка G2 хантавируса серотипа Пуумала в Е. coli (штамм JM 109).
Практическая значимость Полученные результаты расширяют и дополняют представления о структуре нуклеотидной и белковой последовательностей хантавируса, который циркулировал на территории Республики Башкортостан и явился причиной вспышки ГЛПС в 2001-2005гг. Ген G2 из плазмидных конструкций можно использовать для получения штамма-продуцента гликопротеина, для диагностических целей, ДНК-вакцины и рекомбинантной вакцины.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов (Уфа, 2000); на Всероссийской научно-
практической конференции «Медицина будущего» (Сочи, 2002); на Всероссийской конференции с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение», посвященной 100-летию основания филиала «Иммунопрепарат» (Уфа, 2005); «История изучения и современное состояние эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики» (Уфа, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 1 статья в журнале из Перечня ВАК.
Объект исследования - хантавирус (род Hantavirus), который был основным этиологическим агентом ГЛПС на Южном Урале за период 2001 - 2005 гг.
Выделение и очистка тотальной РНК из крови больных и образцов легочной ткани рыжых полевок {Myodes, Clethrionomys glareolus), отловленных на территории Республики Башкортостан, проводилась экстракцией смесью гуанидинтио-ционат-фенол-хлороформ (Chomczynski et al. 1987) и «Trizol Reagent» фирмы «In-vitrogen». Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили методом мягкого лизиса с использованием Brij-58 (Pernecky, Coon 1996). Электрофоретическое фракционирование препаратов ДНК осуществляли в зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК и требуемого разрешения, используя 0,6 - 1,8% агарозные гели. Синтез кДНК. ДНК, комплементарную вирусной геномной РНК, получали, используя фермент AMV-ревертазу (обратной транскриптазы вируса миелобласто-за птиц) или MulV-ревертазу (Frohman 1988). Амплификацию вирусной кДНК проводили методом «гнездовой» полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Feldman 1993). Компетентные клетки готовили по Kushner (Kushner 1978), с некоторыми изменениями. Молекулярную массу полипептидов определяли методом коэлек-трофореза белков с известными значениями молекулярных масс (Laemmli 1970). Твердофазный иммуноферментный анализ проводили, используя тест-систему для определения антигенов хантавирусов «Хантагност». Определяли величину поглощения света при длине волны 492 нм на приборе «Унискан II» (Flow laboratories Финляндия) (Гловер 1989).
Особенности организации генома хантавирусов
У буньявирусов (BUNV) этот район задействован в регуляции транскрипции и репликации (Dunnet et al., 1995). У флебовирусов 10 терминальных нуклеотидов с 5 и 3 концами являются критическими для узнавания, регуляции инициации и транскрипции вирусной РНК L белком (Flick и др., 2002). Как упоминалось выше, геном хантавируса состоит из трех сегментов одноцепочечной негативной РНК, обозначаемых как большой (L 6,4 8,6 тпн), средний (М 3,6 тпн) и малый (S 1,2 1,6 тпн) с молекулярной массой 2,7, 1,2 и 0,6x106 кДа соответственно (Giebel et al., 1989; Schmaliohn et al., 1987).
Полностью последовательность L- сегмента установлена для штаммов Sotkamo и CGI820 серотипа PUU и пяти других хантавирусов (Vapalahti, 1996; Stohwasser et al., 1991). В мРНК комплементарной гРНК L сегмента была выявлена единичная AUG-инициированная открытая рамка трансляции (ОРТ), кодирующая белок с длиной от 2150 до 2238 аминокислотных остатков (а.о.) и молекулярной массой около 240-259 кДа, названная L белком (Vapalahti, 1996; Elliot, 1990; Garcin, 1995). В негативной геномной РНК L-сегмента обнаруживается небольшая AUG-инициированная ОРТ, которая может кодировать пептид с молекулярной массой 14-17 кДа, но соответствующий белок не был идентифицирован, поэтому в настоящее время нет доказательств о существовании неструктурных белков, кодируемых L-сегментом (Vapalahti, 1996).
L белок является вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой (транскриптаза), обладающей, по крайней мере, репликазной, транскриптазной, эндонуклеазной и, возможно, хеликазной активностями. В аминоконцевой части белка имеются два региона, мотивами последовательностей сходных с другими РНК-полимеразами вирусов с сегментированными геномами, представленными негативной РНК. В центральной части аминокислотной последовательности L белка присутствуют мотивы, которые являются консервативными для всех РНК-зависимых РНК-полимераз (Poch et al., 1989). Кроме того, L белок хантавирусов характеризуется высоким содержанием карбонильных групп на С-конце (Vapalahti, 1996). Сравнение аминокислотных последовательностей, кодируемых L-сегментом генома хантавирусов серотипов HTN, SEU и PUU показывает, что L- сегмент является более консервативным, чем S- и М-сегменты (Antic et al., 1992).
Средний по размеру М-сегмент генома хантавируса кодирует два гликопротеина G1 и G2. Наибольшая длина М-сегмента установлена для серотипа РН - 3707 н., штамм Hallnas серотипа PUU имеет длину 3682 н., серотип HTN - 3616 н. (Parrington et al., 1991). G1 и G2 являются типичными интегральными белками 1-го типа. В мРНК комплементарной геномной выявлена протяженная ОРТ, кодирующая белок-предшественник длиной 1131 - 1148 аминокислотных остатков и молекулярной массой 126 кДа. Белок-предшестсвенник синтезируется в направлении 5 -Gl-G2-3\ В результате последующего процессинга в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР), из белка-предшестсвенника образуются два гликопротеина. Молекулярная масса негликозилированных G1 и G2 белков составляет 65 и 54 кДа, в то время как гликозилированные гликопротеины характеризуются молекулярной массой от 68 до 72 кДа (Elliot, 1990; Vapalahti et al., 1992). N-терминальные концы гликопротеинов локализованы в просвете ЭПР и в люменах комплекса Гольджи, в то время как С-карбоксильные концы находятся в цитоплазме (Spiropoulou et al., 1994). Гетеродимер Gl - G2 транспортируется в комплекс Гольджи благодаря сигналу, расположенному на С-карбоксильном конце G1 белка. В комплексе Гольджи происходит сборка, отпочковывание и транспортировка к наружней клеточной мембране.
Сравнение последовательностей гликопротеинов G1 и G2, ранее выделенных и охарактеризованных хантавирусов, позволило выявить множество общих структурных особенностей, что предполагает значительное сходство в строении соответствующих гликопротеинов вирусов различных серотипов. Зрелый G1 гликопротеин серотипа HTN начинается с 18-й аминокислоты после первого AUG кодона в ОРТ, ему предшествует короткая гидрофобная последовательность в 16-20 аминокислотных остатках, выполняющая функцию сигнального пептида. Точный N-конец G1 гликопротеина был определен только для серотипов SEU и HTN (Vapalahti, 1996). Между G1 и G2 гликопротеинами в белке предшественнике располагается небольшой пептид с молекулярной массой 6 кДа и длиной 20 аминокислотных остатков, который имеет в основном гидрофобный характер и может функционировать как сигнальная последовательность для G2 (Elliot, 1990; Schmaljohn et al., 1987). С-карбоксильный конец сигнальной последовательности пептида у всех хантавирусов представлен консервативным мотивом WASSA. Эти пять аминокислот располагаются впереди предполагаемого сайта котрансляционного расщепления белка предшественника G1-G2 серотипов HTN и SEU (Vapalahti, 1996; Schmaliohn, et al. 1987; Aricawa et al. 1990).
Продукты трансляции М-сегмента - гликопротеины G1 и G2 всех хантавирусов характеризуются очень высоким содержанием (5%) остатков цистеина. Положение почти всех 57 остатков цистеина является консервативным среди хантавирусов (Vapalahti, 1996; Parrington et al., 1991; Spiropoulou et al., 1994), что говорит об участии остатков цистеина в формировании третичной структуры белков.
Гликопротеины G1 и G2 патогенных хантавирусов серотипов PUU, HTN содержат 4 потенциальных высококонсервативных аспарагин-связывающих сайтов гликозилирования, ассоциированных с сахарами преимущественно высокоманнозного типа. Три сайта локализовано в G1 и один в G2 (Vapalahti, 1996). Многие хантавирусы имеют в гликопротеинах G1 и G2 дополнительные связанные с аспарагиновой аминокислотой сайты гликозилирования. Например, штамм SR-11 серотипа SEU содержит два дополнительных сайта в G1, а штамм 76-118 серотипа HTN, штамм Hallnas и штамм CG 1820 серотипа PUU содержат по одному дополнительному сайту в G2 (Parrington et al., 1991).
Преимущества ДНК-вакцин и возможные ограничения в их применении
Очевидно, что ДНК-вакцины обладают большим потенциалом и это доказывают успешные результаты применения данной технологии на различных животных моделях - от мыши до человека. Однако проверка ДНК-вакцин уже на этапе доклинических исследований вызвала ряд закономерных вопросов, которые могут служить серьезным ограничением в их практическом применении. 1) Неизвестны сроки, в течение которых клетки организма будут вырабатывать антигенный белок. 2) Высказываются опасения, что ДНК-вакцинация может вызвать образование анти-ДНК-антител или иммунные реакции, направленные против клеток организма вакцинируемого, что может вызвать аутоиммунные заболевания. 3) ДНК-вакцины не смогут заменить вакцины, действие которых основано на иммунной реакции против полисахаридов (например, полисахаридные пневмококковые, менингококковые вакцины).
Основные опасения по применению ДНК-вакцин связаны с возможностью неконтролируемого встраивания вводимой ДНК в те или иные участки генома, что может привести к нарушению функций любых генов. В экспериментах на мышах введенная ДНК не обнаруживалась ни в препаратах хромосомной ДНК, ни в каких-либо других тканях, помимо места инъекции (Warren et al., 1995). Предполагается, что интеграция плазмиды в геном мышей либо не происходит, либо наблюдается в 1000 раз реже, чем спонтанные мутации генов (Дебабов, 1997; Спасокукоцкий, 2000).
Несмотря на возможные ограничения, использование ДНК-вакцин намного привлекательнее традиционных вакцин по целому ряду причин. ДНК-вакцины позволяют получить как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ против огромного количества антигенов в различных животных моделях. Помимо этого, ДНК-вакцинация дает потенциальную возможность решить ряд важных задач в вакцинологии: а) создание иммунитета широкого спектра, например против различных штаммов вирусов через образование Тс, которые узнавали бы консервативные эпитопы сходных вирусных белков; б) презентация антигена с нативными посттрансляционными модификациями, конформацией для получения антител оптимальной специфичности; в) создание долговременного иммунитета; г) получение преимущественно гуморального или клеточного иммунного ответа через активацию различных видов Т-хелперов; д) получение ДНК вакцины, представляющей комбинацию из нескольких иммуногенов для одновременной иммунизации; е) высокая степень чистоты препарата; ж) низкая себестоимость при производстве, что является важным фактором для стран со слаборазвитой экономикой: з) быстрота и простота в приготовлении ДНК-вакцины; и) использование вакцины против тех инфекций и заболеваний, для которых не разработаны традиционные вакцины и методы лечения.
С ДНК-вакцинами связаны большие надежды в решении многих теоретических и практических задач. До внедрения этой технологии в медицинскую практику потребуются годы исследований, чтобы убедительно доказать эффективность и безопасность их применения.
На сегодняшний день разработаны, лицензированы и широко используются для профилактики ГЛПС инактивированные вакцины в Китае и в Южной Корее. В Китае производятся три подобных препарата-инактивированная формалином вакцина, которую получают из инфицированной вирусом серотипа SEU культуры клеток почек золотистого хомяка; инактивированную бета-пропиолактоном вакцину получают из культуры клеток почек монгольской песчанки, зараженной вирусом серотипа HTN; инактивированная формалином, очищенная вакцина из инфицированного вирусом HTN мозга крыс-сосунков (Song et al., 1998). В настоящее время в Китае также разработана и подготовлена для клинических испытаний бивалентная инактивированная вакцина, которую получают из культуры клеток Vero-Еб, зараженных хантавирусами двух серотипов HTN и SEU. По мнению разработчиков, данный препарат должен заменить используемые инактивированные вакцины, поскольку последние часто вызывают побочные эффекты, индуцируя при этом низкий уровень синтеза нейтрализующих антител. Корейскими учеными также была получена инактивированная формалином вакцина «Hantavax» из мозга крыс, инфицированного вирусом серотипа HTN, выделенного из эндемичного района Кореи. С 1991 года Hantavax успешно применялась для профилактики ГЛПС в Корее, а в 1996-1997 г. - в Югославии (Lee et al., 2001).
Многочисленные исследования показали, что все лицензированные инактивированные хантавирусные вакцины вызывали у иммунизированных людей активный синтез специфичных антител. Например, после вакцинации двумя дозами Hantavax сероконверсия была выявлена у 91,5 % людей по данным иммуноферментного анализа (Lee et al., 2001). Но, как упоминалось, серьезным недостатком данных препаратов, по мнению ряда ученых, является низкий титр нейтрализующих антител в иммунном ответе, что свидетельствует о неспособности используемых инактивированых вакцин обеспечить полную защиту вакцинируемого (Vapalahti, 1996).
В России подобные вакцины отсутствуют, а применение на территории Башкортостана в профилактических целях Hantavax или вакцин, разработанных китайскими исследователями, может оказаться малоэффективным, поскольку в республике основным агентом, вызывающим ГЛПС, является на сегодняшний день хантавирус серотипа PUU. Данный факт подтверждается исследованиями (Yong et al., 1995), в которых рекомбинантная вакцина против серотипов HTN и SEU защищала привитых хомячков от заражения вирусами этих серотипов, и в то же время не могла защитить от серотипа PUU. В работе Custer с сотр. (Custer et al., 2003) антитела, полученные от макаки-резус в результате вакцинации плазмидной ДНК, кодирующей гены Gin G2 хантавируса серотипа SNV, вызывающего геморрагическую лихарадку с легочным синдромом, защищали сирийских хомячков от заражения этим же вирусом, в то же время не оказывали защитного эффекта при заражении хантавирусом серотипа (PUUV), который вызывал геморрагическую лихарадку с почечным синдромом.
Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях
Элюцию фрагментов ДНК из препаративного агарозного геля проводили с помощью легкоплавкой агарозы и диализных трубок. (Sealey and Southern, 1982). Просматривая окрашенный бромистым этидием агарозный гель в ультрафиолетовом трансиллюминаторе с длиной волны 302 нм, перед искомым фрагментом ДНК в геле вырезали соответствующую лунку. В образовавшееся пространство заливали 1,5 %-ную легкоплавкую агарозу (тип VII), содержащую бромистый этидий и повышенную (1,2 х кратную) концентрацию ТАЕ-буфера, необходимую для торможения движущихся фрагментов ДНК при входе в зону легкоплавкой агарозы. Вследствие этого концентрация молекул ДНК, приходящихся на единицу объема геля, увеличивалась. После застывания легкоплавкой агарозы и превращения ее в гель продолжали электрофорез в том же направлении, периодически контролируя процесс перехода фрагмента ДНК из обычной агарозы в легкоплавкую с помощью трансиллюминатора. По завершении этого процесса кусочек легкоплавкой агарозы, содержащий требуемый фрагмент ДНК, вырезали и помещали в пробирку, соответствующую объему вырезанного кусочка геля. К расплавленной на водяной бане при 65С легкоплавкой агарозе добавляли равный объем дистиллированной воды и раствор 7,5 М ацетата аммония до конечной концентрации 0,5 М, встряхивали с фенолом и расслаивали в микроцентрифуге MPW-50 при 12000 g в течение 10 мин. Фенол удаляли встряхиванием супернатанта с равным количеством хлороформа в течение 5 минут с последующим центрифугированием. Водно-солевой слой, содержащий ДНК, осаждали 2,5 объемами этанола при температуре -20С в течение 2 часов. Сформировавшийся осадок собирали центрифугированием, растворяли в 200мкл воды, и качество и количество препарата проверяли аналитическим электрофорезом в 0,8 - 2 % агарозных гелях в зависимости от размера элюируемых фрагментов ДНК.
Электроэлюцию фрагментов ДНК из препаративного агарозного геля проводили в специально изготовленной камере из оргстекла с платиновыми электродами, расположенными на близком расстоянии друг от друга. Вырезанный кусочек агарозного геля, содержащий требуемый фрагмент ДНК, помещали в диализную трубку «Visking», наполняли ее 0,5 кратным ТАЕ-буфером, герметизовали специальными зажимами для диализных трубок, поставляемых фирмой «Pierce» (США). Подготовленную таким образом диализную трубку располагали между платиновыми электродами и подавали напряжение 20 В/см.. Во избежание образования нежелательного градиента рН, буфер в элюционной камере постоянно перемешивался с помощью двух магнитных мешалок. Процесс элюции контролировали, периодически просматривая диализную трубку над трансиллюминатором ТМ-36. При необходимости продолжения электроэлюции диализную трубку с гелем возвращали в камеру, строго следя за ее правильной ориентацией (т.е. прежней ориентацией) относительно электродов. По завершении элюции на короткое время (15 сек) менялась полярность электродов, что было необходимо для выхода обратно в буфер ДНК, сорбировавшейся в процессе элюции на внутренней поверхности диализной трубки со стороны катода. В связи с тем, что концентрация ДНК, получаемой этим методом, в элюционном буфере бывала весьма низка, дополнительно проводился этап концентрирования ДНК бутанолом (Stafford and Bieber, 1975)
К 8 мл растворенной в буфере ТЕ плазмидной ДНК добавляли равный объем н-бутанола и хорошо размешивали. Центрифугировали при 3 000 g. две минуты и удаляли верхнюю фазу с бутанолом. Повторяли процесс несколько раз, пока объем растворенной ДНК не уменьшился до 100 мкл. Дважды эстрагировали пробу водонасыщенным эфиром, чтобы удалить бутанол. Эфир удаляли выпариванием, оставив пробирки открытыми на 40 мин. Для приготовления компетентных клеток 1 мл ночной культуры определенного штамма Е. coli вносили в колбу на 500 мл с 200 мл среды LB (содержащей для штамма XL-Blue 12,5 мкг/мл тетрациклина и без антибиотиков для штамма JM109). Клетки наращивали до D6oo 0,7 при 37С, при интенсивной аэрации на орбитальном шейкере УВМТ 12-250 с частотой вращения 120 об./мин. Затем клетки охлаждали до 4С и собирали центрифугированием в стерильных центрифужных пробирках в центрифуге ОПН-8 при 4 000 g в течение 5 минут. Удаляли супернатант, осадок подсушивали, перевернув пробирки на фильтровальную бумагу. Клетки осторожно ресуспендировали в 25 мл инкубационного (0С) буфера 1(10 мМ СаСЬ, 50 мМ МпС12, 100 мМ КС1, 30 мМ ацетат калия, рН 5,8), помещали в ледяную баню на 10 минут. Повторно проводили центрифугирование при 4 000 g - 5 минут. Удаляли супернатант как можно более полно, подсушивали, перевернув пробирки на фильтровальную бумагу, и осторожно ресуспендировали клетки в 5 мл холодного буфера II (75 мМ СаСЬ, 10 мМ КС1, 20 %-ный глицерин, 10 мМ MOPS, рН 6,5). Компоненты буфера стерилизовали отдельно автоклавированием при 120С - 15 минут и готовили в стерильных условиях. Клеточную суспензию компетентных клеток разливали по 300 мкл в предварительно охлажденные стерильные полипропиленовые микропробирки и замораживали при -85С (Sambrook et al., 1989). Все операции выполнялись на холоде в стерильных условиях в ламинарном боксе горизонтального типа («Flow», Шотландия). Клонирование амплифицированного фрагмента ДНК М-сегмента гена G2 хантавируса серотипа Пуумала проводили в векторе pGEMEasy, Bluescript II SK - и в векторної! системе pPinPoint. Плазмиды pBluescript II SK- и pPinPoint линеезовали, проинкубировав в течение 2 часов с рестриктазой EcoRV, очистили от белков фенол-хлороформной экстракцией и, используя Taq- полимеразу и dTTP, навесили Т-нуклеотид на 3 конца, приготовив вектор для клонирования ГЩР продукта с выступающими dT-концами.
Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
При сравнительном анализе нуклеотидной последовательности клонированного нами фрагмента с первичной структурой соответствующего участка М-сегмента штамма хантавируса CG-1820 было обнаружено, что на всем протяжении исследуемого фрагмента имеются отдельные несовпадения в нуклеотидной последовательности. Уровень гомологии сравниваемых участков составил 94,7%. Были выявлены замены в следующих положениях: 1990 - C-»G, 1997 - G-»A, 2063 - A- G, 2109 - А С, 2143 - A G, 2215 -G-+A, 2443 - A- G, 2602 - C- T, 2724 - C-+G, 2763 - C- T, 2781 - A- T, 2829 - A-+G, 2837 - T- C, 2863 - C-+T, 2866 - T-»C, 2893 - T-+C, 2896 - A-»G, 3269-3270 - CC— GG. Соответственно в белке часть из них приводит к замене аминокислот: 2063 - R- G, 2109 - Q- P, 2724 - P- R, 2763 - A- V, 2781 -Q L, 2829 - K-+R, 2837 - F- L, 3269 - P-+G.
Половина нуклеотидных замен в открытых рамках считывания исследованного М сегмента, соответствующего гену G2, сосредоточена в 3-ей позиции кодонов, вследствие чего они не оказывают влияния на аминокислотные последовательности вирусного белка. Обнаруженные изменения в аминокислотных последовательностях белков хантавируса сводятся к взаимным заменам гидрофобной аминокислоты с короткой боковой цепью - аланина на валин, основной аминокислоты лизина на аргинин. Однако наблюдаются и значимые для сохранения конформации и общего заряда белка замены гидрофобных аминокислот на полярные и наоборот, в следующих положениях: 2063 (аргинин на глицин), 2109 и 2781 (глютамат на пролин и лейцин, соответственно), 2837 (пролин на аргинин) и 2724 (фенилаланин на лейцин).
В настоящее время эволюционная взаимосвязь хантавирусов устанавливается на основе сравнительного анализа соответствующих нуклеотидных последовательностей М, S и L сегментов генома вируса (Vapalahti, 1996; Antic et al., 1992; Spiropoulou et al., 1994). Antic и соавт. (Antic et al., 1992) выделяют два различных эволюционных направления хантавирусов: один включает вирусы, переносимые Apodemus и Rattus (семейство Мышиные Muridae), такие как HTN (Хантаан) и SEU (Сеул) серотипы, а другой включает серотипы, переносимые (семейство Хомякообразные Cricetidae) Clethreonomys и Microtus, такие как серотипы РЦиУ(Пуумала) и PHV (Проспект Хилл). В последние годы были выделены вирусы, впоследствии классифицированные как хантавирусы, переносимые землеройками (семейство Землеройковые Soricidae), которые отделились и эволюционировали самостоятельно гораздо в более ранний период по сравнению с другими хантавирусами. Открытия новых хантовирусов (Kang, 2009; Song, 2009) несколько изменило точку зрения на эволюцию хантавирусов, предложенную Antic и соавт.
Филогенетический анализ, проведенный на основе компьютерного выравнивания нуклеотидных последовательностей М-сегментов, зарегистрированных в электронном банке нуклеотидных последовательностей GenBank (NCBI, США), показал, что изолированный нами вирус на дендрограммах находится в общем кластере хантавирусных штаммов, выделенных ранее на территории Республики Башкортостан. Исследователи по-разному оценивают роль географического фактора в эволюции хантавирусов. Например, Plyusnin с соавт. (Plyusnin et al., 1994) считают, что штаммовые различия хантавирусов связаны с их географической удаленностью друг от друга.
Взаимосвязь между генетической и географической отдаленностью штаммов была также показана для PUU штаммов из Центральной Европы, для HTN штаммов из Китая, из Кореи, для SNV и других хантавирусов из США (Schmaliohn et al., 1988;Xiao et al., 1993; Liang et al., 1994; Bowen et al., 1995; Rowe et al., 1995; Hielle et al., 1995; Song et al., 1996).
Расположение штаммов на приведенных дендрограммах А и В (рис.7) для N гена S-сегмента и на А и В (рис. 8), для гена G2 (Gc) фрагмента М сегмента подтверждает и дополняет выводы, сделанные Plyusnin с соавт. (Plyusnin et al., 1995), о географической кластеризации штаммов и изолятов хантавирусов. Уровень выведенных нами аминокислотных различий для S-сегментов штаммов, изолированных в разных странах, составил 13- 8%, для штаммов, изолированных в одной и той же стране составил 6-12% и для штаммов, изолированных в одной и той же популяции грызунов - 3-4%. Определенный нами уровень нуклеотидных различий для М-сегментов штаммов, изолированных в разных странах, составил 25- 40%, для штаммов, изолированных в одной и той же стране, - 12-18%, и для штаммов, изолированных в одной и той же популяции грызунов, - 4-8%. Штаммы ,формируют отдельные группы в соответствии с местом их изоляции: в Сербии, Греции, Словении - серотип DOBV; в Гемании, Норвегии, Финляндии- PUU, на Дальнем Востоке России, в Китае, в Южной Корее -Amur, HTN, SEU, в США, в Панаме, в Мексике, в Боливии - хантавирусы, вызывающие ГЛЛС ( геморрагическая лихорадка с легочным синдромом). В группе российских штаммов для серотипа Пуумала были выделены несколько подгрупп: вирусные изоляты из Ижевска, Уфы, Омска, Тюмени. Необходимо отметить, что в Тюменской области циркулируют помимо серотипа PUUV, серотипы DOBV, TopografovV, TULV (Якименко и др., 2008); на территории Омской области циркулируют серотипы хантавируса -PUUV, DOBV, TULV (Дзагурова и др., 1999; Якименко и др., 2001); в Германии и Словакии - PUU, TULV. Имеются данные, что на территории республики Башкортостан также циркулируют два серотипа вируса - PUUV, DOBV (Ткаченко Е.А., 2006), что согласуется с исследованиями Antic с соавт. (Antic et al., 1992), которые считают, что географический фактор не играет большой роли в эволюции этих вирусов, и, как пример, приводят изоляцию PUU- , и HTN-подобных вирусов из одних и тех же географических регионов Восточной Европы, а также SEU- и HTN-подобных вирусов из одного и того же региона Кореи.
