Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 12
2.1 Африканская чума свиней, историческая справка 12
2.2 Факторы распространения АЧС 13
2.3 Структура вируса АЧС и его геном 17
2.4 Функциональные особенности генов вируса АЧС 26
2.5 Перспективы возможности создания средств специфической профилактики при АЧС 33
2.6 Заключение по обзору литературы 42
3 Собственные исследования 44
3.1 Материалы 44
3.2 Методы 46
4 Результаты и обсуждение результатов 49
4.1 Анализ возможности экспресс-оценки уровня репродукции вируса АЧС с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени 49
4.1.1 Построение калибровочной кривой для определения количества копий гена B646L вируса АЧС 50
4.1.2 Определение титра вируса АЧС изолята Krasnodar 07/17 в реакции гемадсорбции и ПЦР-РВ 53
4.1.3 Определение титра вируса по показателю Ct 56
4.2 Изучение консервативности генов вируса АЧС российских изолятов 60
4.2.1 Анализ расположения и направления открытых рамок считывания генов O61R, CP204L, X69R, A179L, B646L, I215L, E248R, EP402R и DP96R 61
4.2.2 Оптимизация условий амплификации выбранных генов с использованием подобранных праймеров 62
4.2.3 Определение нуклеотидных последовательностей генов российских изолятов и филогенетический анализ 65
4.3 Пополнение библиотеки генов вируса АЧС 73
4.3.1 Клонирование генов вируса АЧС 73
4.3.2 Библиотека генов вируса АЧС изолята Krasnodar 07/17 75
4.4 Получение клонов-продуцентов рекомбинантных белков вируса АЧС 78
4.5 Синтез рекомбинантных белков p30 и p54 в клетках E.coli 84
4.6 Изучение влияния рекомбинантных белков p30 и р54 вируса АЧС на репродукцию вируса in vitro 86
4.7 Синтез рекомбинантных белков pX69R, pE248R и CD2v в клетках CV- 90
4.7.1 Анализ экспрессии генов вируса АЧС в клетках CV-1: оценка специфичности рекомбинантных белков и определение их локализации 91
4.7.2 Накопление и очистка рекомбинантного белка CD2v 92
4.8 Изучение влияния рекомбинантного белка CD2v вируса АЧС на репродукцию вируса in vitro 93
4.9 Изучение влияния рекомбинантных гликопротеинов pX69R и pE248R вируса АЧС на его репродукцию in vitro 96
5 Заключение 99
5.1 Выводы 100
6. Принятые сокращения 103
7. Список литературы 106
8. Приложения 127
- Структура вируса АЧС и его геном
- Перспективы возможности создания средств специфической профилактики при АЧС
- Определение нуклеотидных последовательностей генов российских изолятов и филогенетический анализ
- Изучение влияния рекомбинантных гликопротеинов pX69R и pE248R вируса АЧС на его репродукцию in vitro
Структура вируса АЧС и его геном
Вирус АЧС имеет икосаэдрическую форму со средним диаметром 200нм и состоит из внутреннего кора (ядра), образованного центральным геном-содержащим нуклеоидом и окружнного несколькими концентрическими слоями: плотным белковым слоем ядерной оболочки, внутренней липидной оболочкой и капсидом, который является внешним слоем внутриклеточных вирионов [33, 48, 83].
Внеклеточные вирионы обладают внешней оболочкой, полученной почкованием из плазматической мембраны [56]. Двумерный анализ очищенного внеклеточного вируса выявил 54 структурных белка с молекулярным весом от 10 кДа до 150 кДа [79]. Как и другие сложные ДНК-содержащие вирусы, у возбудителя АЧС есть ряд механизмов, чтобы обойти защитные системы хозяина, включая врожднные и приобретнный иммунные механизмы, такие, как подавление продукции интерферона I типа, регуляция апоптоза, развитие гиперергического воспаления и активация экспрессии иммуномодулирующих генов клетки-хозяина [24, 52].
Как видно на рисунке 2, вирион вируса АЧС имеет икосаэдрическую форму, сформированную 5 группами белков, к каждой группе относятся два и более структурных белка.
Общепризнанно, что вирус АЧС является выходцем из Восточной Африки, поскольку болезнь была впервые описана в Кении в 1921 г. после первой вспышки в 1903 г. Однако анализ скорости замещения привл к получению очень интересных показателей TMRCA (Time to the most recent common ancestor – время до самого последнего общего предка), позволивших определить, что наиболее близкий предок всех изолятов вируса АЧС, циркулирующего в настоящее время, появился примерно три столетия назад, т.е. в 1700 г.
Размер генома вируса АЧС варьирует в зависимости от изолята от 170 до 190 кб (т.п.н.) и кодирует от 150 до 167 открытых рамок считывания (ОРС). Геном вируса имеет центральный консервативный регион, а также правую и левую вариабельные области.
Первоначально дифференциация вариантов вируса АЧС проводилась на основе рестрикционных карт и определении размера генома [89]. Высокий уровень изменчивости наблюдался, главным образом, в пределах 38-47 т.п.н. на левом конце и 13-16 т.п.н. на правом конце генома (рисунок 3) [89, 158, 160]. Эти две вариабельные области содержат мультигенные семейства (MGF), которые играют существенную роль в регуляции экспрессии генов и различаются по количеству тандемных повторов. Кроме того, многообразие вариантов вируса АЧС порождается также варьированием количества аминокислотных повторов в 14 белках, включая центральный вариабельный регион (CVR), кодируемый геном B602L, и белок оболочки p54, кодируемый геном E183L [29, 61, 86, 91, 118].
По сравнению с другими крупными ДНК-содержащими вирусами такими, как гамма-герпесвирус позвоночных (10-9 замен/позиция/год), и мелкими ДНК-содержащими вирусами (например, вирус Каннингема) (10-7 замен/позиция/год), вирус АЧС обладает очень высокой эволюционной скоростью изменчивости (3.31 10-4 замен/позиция/год и экспоненциальный рост 0,01 в год -1).
Как было установлено, при анализе нуклеотидных последовательностей генома вируса АЧС, скорость замен у него варьировала от 10-4 до 10-5, что приближает его к РНК-содержащим вирусам, которые обычно имеют близкий показатель эволюционной скорости: от 10-2 до 10-5 замен/позиция/год [72, 93, 127]
С помощью селекционного клонирования доказано, что природные популяции вируса АЧС представлены различными генетическими и антигенными вариантами [98]. Клональный анализ природных изолятов вируса АЧС показал, что их популяции могут быть гетерогенны по составу, поэтому, по мнению Blasco R. и др. (1989 г.), любая классификация изолятов вируса должна базироваться на данных о центральной области молекулы ДНК [158].
Сложность классификации изолятов вируса АЧС Восточной и Южной Африки обусловила разработку системы генетического группирования на основе анализа последовательности высоко консервативного гена B646L, кодирующего мажорный вирусный белок VP72 [91]. Первоначально все имевшиеся на тот момент изоляты были распределены на 10 генотипов [86]. Однако на настоящий момент в Мозамбике идентифицировали уже XXIV генотип вируса АЧС [85], выделенного из мягких клещей (рисунок 4). Высокая степень гомологии между западноафриканскими, европейскими и южноамериканскими изолятами, позволила сгруппировать их в I генотип.
Дальнейший филогенетический анализ вспышек АЧС показал, что I генотип продолжает распространяться в Западной и Центральной Африке [17, 87], а страны Уганда и Кения характеризуются постоянным присутствием вируса АЧС IX и X генотипов [35].
Изоляты Восточной и Южной Африки более разнообразны и подразделяются на 21 генотип [86, 91, 117]. Данный факт подтверждает, что разнообразие вариантов вируса АЧС, как правило, генерируется в сильватическом цикле [70].
Вирус АЧС II генотипа сохранил сво присутствие в Танзании, Мозамбике, Мадагаскаре и Замбии, и именно его распространение привело к эпизоотии в Грузии в 2007 г. [84]. Начиная с этого времени АЧС распространилась с Кавказа в Российскую Федерацию, страны Прибалтики (Эстония, Латвия и Литва), Украину и Польшу [21, 88].
В последние годы определены последовательности геномов штаммов различных генотипов [61, 90, 128], что позволяет не только идентифицировать некоторые геномные маркеры, которые могут быть использованы для внутригенотиповой дифференциации изолятов, но и гены, влияющие на вирулентность вируса АЧС.
Филогенетический анализ с использованием методов Байесовских определений (Bayesian estimation) и максимально ближайших соседей позволил установить, что естественная эволюция вируса АЧС может быть отслежена также по генам B646L и CP204L, в которых не выявлено множественных рекомбинаций, несинонимичных смещений или кодонов с положительным естественным отбором.
Учитывая низкий уровень генетических изменений, обнаруженных в p72 среди изолятов вируса АЧС, полученных при вспышках у домашних свиней, исследование более изменчивых геномных областей, таких как центральная вариабельная область (CVR) гена B602L [126] и гена E183L [76], использовалось для внутригенотиповой дифференциации изолятов в пределах одного генотипа [34, 118]. Причины вариабельности белка рB602L все ещ не ясны. Установлено, что он является шапероном, который активно участвует в сборке капсида, хотя сам не включается в вирионы [118].
Исходя из вышеизложенного, для установления происхождения вируса АЧС и оценки скорости его эволюции, целесообразно проводить анализ нуклеотидных последовательностей генов B602L, B646L, CP204L и E183L, кодирующих шаперон и основные структурные белки (p72, p30 и p54).
Вариабельная область ОРС B602L содержит тандемные повторы двенадцати нуклеотидов и кодирует различающиеся по количеству тетрамеров аминокислоты. Так, например, недавно в Эстонии у изолятов II-го генотипа в популяции дикого кабана были идентифицированы два генетических варианта (CVR-1 и CVR-2) [116].
Перспективы возможности создания средств специфической профилактики при АЧС
Использование живых аттенуированных вакцин (ЖАВ) против АЧС сдерживалось негативными результатами крупномасштабного опыта по вакцинации в Португалии и Испании в начале шестидесятых годов, когда не было учтено наличие векторов передачи и распространения вируса. Поскольку полевые условия проведения вакцинации не исключали присутствия инфицированных диких кабанов и клещей, многие животные, вероятно, подвергались неоднократному реинфекцированию.
Как результат, после вакцинации у многих свиней выявляли клиническую картину, характерную для хронической формы АЧС. Поэтому из-за требований биобезопасности, связанных с особенностями инфекционной природы возбудителя АЧС, эта ЖАВ больше не использовалась для мастштабной вакцинации животных [114].
Тем не менее, поиски перспективных ЖАВ продолжались. Так, в серии опытов свиней вакцинировали естественно ослабленными штаммами OURT88/3 или NH/Р68 вируса АЧС. Иммунизированные свиньи были защищены от заражения гомологичным вирулентным штаммом вируса АЧС [60, 100, 102, 154], причм также была получена и частичная перекрстная защита для гетерологичных штаммов [23].
Уровни защиты варьировали от 66% до 100% в зависимости от дозы вируса, путей введения, возраста, а также иммунного статуса животных и вируса, использованного для контрольного заражения [60, 69, 104, 129, 130].
Эксперименты показали, что при использовании ЖАВ специфические антитела [125] и активированные CD8+ Т-клетки [102] играют решающую роль в защите от вируса. В случае иммунизации OURT88/3 перекрстная защита при заражении вирулентными изолятами разных генотипов коррелировала со способностью вируса эффективно стимулировать выработку IFN- лимфоцитами иммунизированных свиней [130].
Однако при применении ЖАВ наблюдали и ряд побочных эффектов: у определнной части вакцинированных свиней проявлялись осложнения после вакцинации, включая пневмонию, локомоторные нарушения, некротические очаги, аборты и даже гибель подопытных животных. В лучшем случае у свиней не проявлялись значительные клинические признаки, за исключением перемежающейся лихорадки и низкого уровня виремии, которая сочеталась с незначительным ринитом у некоторых вакцинированных животных [104, 129, 154].
Таким образом, несмотря на корреляцию между индукцией специфических ответов Т-клеток и приобретнной защитой [59, 82, 130], наличие специфических антител и активированных CD8+ Т-клеток далеко не единственное условие выработки устойчивости.
На сегодняшний день доказано, что инактивированные вакцины против АЧС не обеспечивают защиту даже при наличии адъювантов. Сложность структуры вириона, содержащего более 50 белков, и тот факт, что существует две инфекционные формы вируса АЧС: внутриклеточная и внеклеточная форма, скорее всего, является причиной неудач применения инактивированных вакцин.
В 2014 г. Blome S. и др. изучали возможность применения нескольких инактивированных образцов вакцины с современными адъювантами для специфической профилактики АЧС [115]. Хотя до контрольного заражения АЧС-специфические антитела были обнаружены почти у всех вакцинированных животных, никакого защитного эффекта от иммунизации не наблюдалось. При контрольном заражении у всех животных развивались симптомы АЧС, и они пали или были подвергнуты эвтаназии в течение одиннадцати дней после заражения. Интересен тот факт, что в экспериментах наблюдалось антителозависимое усиление инфекции (АЗУ) [115, 144].
Однако, следует отметить, что после заражения свиней вирусом АЧС ослабленных штаммов пассивный перенос сывороточных антител от выживших животных реципиентным свиньям защищал их от контрольного заражения вирулентным штаммом вируса АЧС [125].
Как было отмечено ранее, Gomez-Puertas P. и др. (1998 г.) продемонстрировали, что белки p54 и p30 вируса АЧС способны индуцировать образование протективных антител у иммунизированных свиней [121, 148].
Однако дальнейшее изучение защитного потенциала нейтрализующих антител дало противоречивые результаты. Хотя совместная иммунизация p54 и p30 обеспечивала значительную защиту от контрольного заражения вирулентным штаммом E75 [148], комбинация белков p54 + p30 + p72 не защищала и от заражения гетерологичным штаммом Malawi Lil 20/1 [121].
Дальнейший поиск протективных белков показал, что иммунизация CD2v также приводит к формированию частичной защиты от заражения вирулентным штаммом. Недавние исследования подтвердили, что белки CD2v и/или C-типа лектина являются важными для защиты от инфицирования гомологичным вирусом АЧС [39].
Определение нуклеотидных последовательностей генов российских изолятов и филогенетический анализ
Определение нуклеотидных последовательности отобранных генов российских изолятов проводили секвенированием по общепринятой методике (раздел 3.2 Методы).
Для сравнительного анализа уровня изменчивости анализируемых генов полученные результаты секвенирования российских изолятов выравнивали с последовательностями 8 Европейских изолятов (I генотип) и 6 изолятов из Африки (I - X генотипов), взятых из GenBank (таблица 4, раздел 3.1 Материалы).
На основе проведнного анализа были построены дендрограммы для 9 генов (рисунки 12 - 17).
Как уже отмечалось ранее, сравнительный анализ последовательности С-конца гена B646L служит методом установления генотипа изолята вируса АЧС. Согласно филогенетическому анализу все изоляты из Российской Федерации вместе с референтным штаммом Georgia 2007/1 относятся ко второму генотипу. В то же время европейские изоляты и изолят Benin 97/1 принадлежат к первому генотипу. Изолят Tengani 62 принадлежит к пятому генотипу, Malawi Lil-20/1 – к восьмому генотипу, Ken06.Bus – к девятому и Ken05/TK1 и Kenya 1950 – к десятому, что соответствует литературным данным (рисунок 12).
Для определения изолятов, максимально соответствующих по своей генетической структуре исходному изоляту Georgia 2007/1, использовали анализ центрального вариабельного региона (CVR) гена B602L, который состоит из 665 п.н. и служит маркером дифференциации изолятов, относящихся к одному генотипу. Исходя из этого, CVR 54 изолятов, выделенных на территории РФ в 2013-2017 гг., исследованы методом секвенирования с дальнейшим сравнительным анализом этого региона референтного изолята Georgia 2007/1.
Как видно из рисунка 13, в результате анализа обнаружены однонуклеотидные мутации в 4 локусах: замена «С» на «Т» в положении 994 гена B602L в 6 изолятах (Sudogda-Vladimir 16-DP, Arkhangelsk 16-DP, Tambov 2016, Krasnodar 2016, Gorokhovets-Vladimir 17-WB/325, Orel 17-WB/337), замена «A» на «T» в положении 1136 в 5 других изолятах (Anino-67 Moscow 13-WB, Karamzinover 13-WB, Shihobalovo-Vladimir 13-WB, Sobinka-Vladimir 15-WB, Sobinka-Vladimir 16-WB), а также две одновременные замены «С» на «Т» в позиции 979 и «A» на «G» в позиции 1115 в 14 изолятах (Che 07, Abk 07, Arm 07, Az 08B, Az 08D, Oren 08, Ing 08, StPet 09, Kalmykia 09, Rostov 09, Dagestan 09, Ukr12/Zapo, Krasnodar 07/15, Crimea 01/16 Martins). К чевертой группе были отнесены изоляты Irkutsk 03/2017, Krasnodar 07/17, Omsk 10/2017, Belgorod 10/17, Krasnoyarsk 10/2017, Kaliningrad 12/17, Belgorod 12/17.
Анализ нуклеотидных последовательностей двух трансмембранных белков E248R и EP402R показал высокую консервативность нуклеотидных последовательностей генов российских изолятов, так как они оказались сгруппированы в один клад (100% гомология), а изолят Benin 97/1 и европейские изоляты I генотипа принадлежали к другой группе и, как и ожидалось, африканские изоляты V-Х генотипа располагались отдельно от первых двух кладов и друг от друга (гомология 65% до 96%) (рисунок 14).
Для последовательности гена EP402R установлены некоторые различия у европейских изолятов I генотипа, причм гены штаммов 26544/OG10 и BA71 отличались от всех изолятов в данной группе (гомология 73% и 99%).
Филогенетический анализ генов A179L и DP96R, ответственных за вирулентность вируса АЧС, подтвердил их высокую консервативность. Для гена DP96R установлена значительная гомология между российскими и европейскими изолятами I генотипа (97% гомология первого и второго генотипа), а африканские изоляты V-Х генотипа отличались от всех анализируемых изолятов (гомология 48% до 80%) (рисунок 15).
Изучение влияния рекомбинантных гликопротеинов pX69R и pE248R вируса АЧС на его репродукцию in vitro
Для определения характера влияния pX69R и pE248R на репродукцию вируса АЧС in vitro рекомбинантные плазмиды pCI-neo/X69R и pCI-neo/E248R использовали для трансфекции с Lipofectamine 3000 перевиваемой линии клеток CV-1 в культуральном флаконе T-25. Через 24 часа для определения наличия синтеза белка пробы исследовали методом РПИФ (как описано 4.7.1).
После установления наличия синтеза белка культуру клеток остальных параллельных проб инфицировали вирусом АЧС штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» в дозе 100 ГАдЕ на флакон ( 0,01 ГАдЕ на клетку). Использование в работе этого штамма вируса АЧС обусловлено его способностью к репродукции в перевиваемой культуре клеток CV-1 и наличием детальной характеристики его культуральных свойств [приложение 2]. В качестве отрицательного контроля использовали заражнную вирусом культуру клеток, трансфецированную плазмидой pCI-neo без встройки. Каждый опыт проводили в 6-х параллелях.
Все пробы инкубировали в течение 7 суток при 37С, с первых по седьмые сутки из каждого флакона отбирали пробы культуральной жидкости для исследования методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Все результаты статистически обработаны (p 0,05) и представлены в графике на рисунке 34.
Как видно из рисунка 34, через сутки после заражения значение Ct ПЦР-РВ для всех проб составило 29 ( 2 lg ГАдЕ50/см3), а на 3 сутки наблюдалась значительная разница в уровне накопления вируса: в отрицательном контроле значение Ct составляло 24 цикла ( 2,8 lg ГАдЕ50/см3), при значениях Ct , равных 17 ( 4,3 lg ГАдЕ50/см3) и 18 циклов ( 4,0 lg ГАдЕ50/см3) в пробах с pX69R и pE248R, соответственно. На пятые сутки значение Ct ПЦР-РВ во всех пробах сравнялось и составило 15 циклов ( 4,8 lg ГАдЕ50/см3). Полученные данные демонстрируют важную роль белков pX69R и pE248R в репродукции вируса, поскольку они в значительной степени влияют на е уровень.
Исследования Rodriguez I. и др. (2009 г.) показали, что белок pE248R начинает функционировать непосредственно после входа вируса в клетку, участвуя в транспортировке вируса в цитоплазме [149]. Вследствие этого присутствие в клетках pE248R перед началом репликативного цикла инфекции, возможно, играет вспомогательную роль при транспортировке вируса в цитоплазме, что ускоряет его накопление.
Функция белка pX69R до сих пор не была определена, однако, в проведенных экспериментах удалось установить его позитивное влияние на репродукцию вируса АЧС, проявившееся в существенном ( 1,5 lg ГАдЕ50/см3 на 3 сутки) увеличении его уровня накопления.
В данном эксперименте феномен влияния рекомбинантных белков на репродукцию вируса in vitro, проявившийся в увеличении титра накопления, имел непродолжительный характер, поскольку наблюдался только до 3 суток от начала эксперимента.
Интерпретация данного явления может быть связана с несколькими факторами:
1. синтез данных белков происходит при экспрессии генов, встроенных в pCI-neo и сама по себе имеет непродолжительный характер (24 -96 часов);
2. общеизвестно, что при репродукции в клетках вируса АЧС его белки обладают способностью выключать синтез клеточных мРНК и активировать синтез собственных мРНК, транскрибируемых с вирусного генома;
3. данные белки могут оказывать влияние только на ранней стадии репродукции вируса АЧС (так, например, pE248R принимает активное участие в «раздевании» вируса и не является необходимым для дальнейших этапов его репродукции);
4. короткий период жизни (полураспада) белков.