Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Краткая характеристика цирковирусных инфекции 12
1.2. Таксономическое положение цнрковирусов свиней 14
1.3. Морфологические и структурные особенности цнрковирусов 15
1.4. Физико-химические свойства цнрковирусов 15
1.5. Молскулярно-биологические особенности строения ЦВС 16
1.6. Генетическая вариабельность геномов цнрковирусов свиней 19
1.7. Механизм репродукции цнрковирусов свиней 20
1.7.1. Чувствительность клеток к заражению ЦВС-2 в условиях in vivo 21
1.7.2. Культивирование ЦВС-2 in vitro 23
1.8. Распространение ЦВС-1 и ЦВС-2 24
1.9. Цнрковирус человека 27
1.10. Синдром мультисистемного истощения отьёмышей 30
1.11. Патологоанатомичсские изменения при СМИО 31
1.12. Дерматит и синдром нефропатии (ДСНП) 33
1.13. Заболевания, ассоциируемые с цирковирусом свиней 2 типа 35
1.13.1. Инфекционный врожденный (конгенитальный) тремор 35
1.13.2. Нарушения репродуктивной функции 36
1.13.3. Комплекс респираторной патологии свиней 38
1.13.4. Смешанные инфекции 39
1.14. Методы диагностики цирковирусной инфекции свиней.. 40
1.15. Специфическая профилактика и лечение 43
Заключение по обзору литературы 44
2.Собственные исследования 47
2.1.Материалы и методы 47
2.1.1. Материалы 47
2.1.1.1. Вирусы и бактерии 47
2.1.1.2. Культуры клеток 47
2.1.1.3. Патологический материал 48
2.1.1.4. Сыворотки 48
2.1.1.5. Реактивы и растворы 48
2.1.1.6. Оборудование 50
2.1.2. Методы 51
2.1.2.1.Имунноферментный анализ 51
2.1.2.2. Выделение ДНК 51
2.1.2.3. Полимеразная цепная реакция 52
2.1.2.4. Гистологические исследования 53
2.1.2.5. Культивирование культур клеток 53
2.1.2.6. Концентрирование и очистка вируссодержащих суспензий 54
2.1.2.7. Методы электронной микроскопии 55
2.1.2.8. Культивирование вируса в культурах клеток 56
2.1.2.9. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени 57
2.1.2.10. Нуклеотидное секвенирование 58
2.1.2.11. Программное обеспечение 59
2.1.2.12. Статистическая обработка данных 59
3. Результаты исследований 60
3.1. Серологические исследования в хозяйствах Российской Федерации 60
3.2. Изучение патоморфологических изменений у поросят при цирковирусной инфекции 62
З.З.Макроскопичсскпс изменения 63
3.4. Гистологические изменения 67
3.5. Разработка полпмеразной цепной реакции для выявления цнрковнрусов свиней в пробах патологического материала и инфицированных культурах клеток 70
З.б.Обнаружсннс ЦВС-1 в культурах клеток методом ПЦР 77
3.7. Селекция субпопуляций клеток из перевиваемой линии клеток РК-15 78
3.8. Исследование патологического материала из хозяйств РФ на наличие генома цирковируса свиней 2-го типа 79
3.9. Выделение ЦВС-2 с использованием культур клеток 82
3.9.1. Подготовка вируссодержащего материала для заражения культур клеток 82
3.9.2. Подбор клеточных линий 83
3.10. Концентрирование и очистка цирковируса свиней 2-го типа 86
3.10.1. Выделение ЦВС-2 из культур клеток 86
3.10.2. Выделение ЦВС-2 из патологического материала 86
3.11. Электронно-микроскопические исследования 89
3.12. Изучение филогенетического родства цнрковнрусов свиней 1-го и 2-го типов..91
3.13. Разработка полпмеразной цепной реакции в режиме реального времени (метод TaqMan) 95
4. Обсуждение 102
5. Выводы
6. Практические предложения 113
7. Список литературы
- Физико-химические свойства цнрковирусов
- Патологический материал
- Изучение патоморфологических изменений у поросят при цирковирусной инфекции
- Исследование патологического материала из хозяйств РФ на наличие генома цирковируса свиней 2-го типа
Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы в связи с активным развитием свиноводства, большое значение приобретают заболевания, ранее не зарегистрированные на территории Российской Федерации. В ряде регионов страны значимой проблемой в промышленных свинокомплексах стала цирковирусная инфекция свиней (ЦИС). Результаты проведённых эпизоотологических исследований свидетельствуют о широком распространении цирковирусной инфекции свиней не только в зарубежных странах, но и в нашей стране (Орлянкин Б. Г. и др., 2003, 2006; Тимина A.M., 2006; Allan G.M. et al., 2000, 2003; Ellis J. et al., 2007; Krakowka S. et al., 2007; Segales J. et al., 2007; Stadejek T. et al., 2007).
Обнаруженный впервые I. Tisher, N. Rasch и G. Tochterman в 1974 г. цирковирус свиней 1-го типа (ЦВС-1) был охарактеризован как нецитопатогенный контаминант перевиваемой культуры клеток почек поросят РК-15.
Первые сведения о патогенном цирковирусе свиней появились в 1991 г., когда в Канаде было выявлено новое заболевание — синдром мультисистемного истощения отъемышей (СМИО). У поросят 6-14 недельного возраста наблюдали истощение, одышку, диарею, желтушность кожи. Полученные впоследствии данные охарактеризовали новый вирус, как цирковирус свиней 2-го типа (ЦВС-2) (Сатина Т.А., 2003; Allan G.M. et al., 1998; Clark E. et al., 1997; Ellis J. et al., 1998; Gagnon C. et al., 2007).
Изучение роли ЦВС в инфекционной патологии свиней, свидетельствует об участии ЦВС-2 в патогенезе таких заболеваний, как СМИО, дерматит и синдромом нефропатии (ДСНП) (Сатина Т.А., 2003; Allan G. М. et al., 2000; Drolet R. et al., 1997; Elbers A.R., 2000; Kiupel M. et al., 2005). К этому списку также относят конгенитальный (врожденный) тремор, некротизирующие и пролиферативные плевропневмонии, эксудативные эпидермиты и энтериты. Существуют предположения о способности ЦВС-2 вызывать нарушения репродуктивных функций у свиноматок.
8 Возникновению данного комплекса заболеваний способствует развитие смешанных инфекций ЦВС-2 с другими патогенами вирусной и бактериальной природы (Drolet R. et al., 1999; Lainson L.A. et al., 2002; Grasland B. et al., 2005; Rapp-Gabrielson V. J. et al., 2008; Keith H. West et al, 1999; Meehan B.M. et al., 2006).
Первые сведения о наличии цирковирусов в популяциях свиней на территории Российской Федерации были получены Щербаковым А.В. в 2000 г. В дальнейших исследованиях представлены генетические характеристики изолятов вируса, циркулирующих на территории России, разработаны методы лабораторной диагностики цирковирусной инфекции свиней на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА) (Тимина A.M. и др., 2005, 2006; Кукушкин С.А. и др., 2006, Шкаева М.А., 2006).
Тем не менее, в отечественной литературе отсутствуют данные о биологических свойствах изолятов цирковируса свиней 2-го типа, циркулирующих в популяциях домашних свиней.
Исследования репродукции вируса в условиях in vitro также являются важным этапом в разработке диагностических систем для индикации цирковирусов свиней.
Остаются не выясненными вопросы клинического проявления болезней, ассоциированных с цирковирусами при смешанной инфекции. Патологические изменения при полиэтиологичном инфекционном процессе, с участием ЦВС, являются чрезвычайно разнообразными, в связи с чем, необходимо их детальное изучение для установления диагностического значения.
Цель работы и задачи исследования. В связи с вышеизложенным основной целью наших исследований являлось изучение патоморфологических изменений при цирковирусной инфекции свиней, биологических свойств возбудителя и генетического родства изолятов
9 цирковируса 2-го типа, циркулирующих в популяциях свиней на территории Российской Федерации.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить патологоанатомические и гистологические изменения у поросят при СМИО и ДСНП;
адаптировать цирковирус свиней 2-го типа для репродукции в перевиваемых клеточных линиях;
- выделить цирковирус свиней 2-го типа из патологического материала
от больных животных;
- изучить морфологию вирионов ЦВС-2 методом электронной
микроскопии;
- разработать набор препаратов для обнаружения и дифференциации цирковирусов свиней 1-го и 2-го типов на основе полимеразной цепной реакции и её модификаций;
- изучить филогенетические взаимоотношения изолятов ЦВС-2,
циркулирующих в популяциях свиней на территории РФ.
Научная новизна результатов исследований.
Показано, что патоморфологические изменения у поросят при СМИО и ДСНП характеризуются продуктивными воспалениями кровеносных сосудов мелкого и среднего диаметра во всех системах органов. Гистологические изменения в органах лимфоидной системы проявляются исчезновением зоны лимфатических фолликулов и замещением её ретикулярной основой.
Установлена способность ЦВС-2 к репродукции в перевиваемой культуре клеток А4С2 с развитием клеточных альтераций.
Разработан набор препаратов для обнаружения цирковируса свиней 2-го типа с применением полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (TaqMan).
Установлено филогенетическое родство изолятов ЦВС-1, выделенных из перевиваемых культур клеток РК-15, SK-6, ПСГК, ПСГК-60, а также
10 изолятов цирковируса свиней 2-го типа, выявленных от поросят с синдромом мультисистемного истощения отъемышеи и дерматитом с синдромом нефропатии на территории Российской Федерации.
Практическая значимость работы.
Представленные данные патологоанатомических и гистологических изменений при синдроме мультисистемного истощения отъемышеи и дерматите с синдромом нефропатии важны для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний свиней.
Разработанные методы выявления генома цирковирусов свиней на основе ПНР и ПНР в режиме реального времени применяются в ГНУ ВИЭВ и ГНУ ВНИИВВиМ при диагностике цирковирусной инфекции свиней.
Публикации результатов исследовании. По теме диссертационной работы опубликовано 6 научных статей, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИТИБП (г. Щёлково, 20-21 декабря 2007 г.), на международном семинаре «Porcine circovirus diseases: towards improved food quality & safety within new member states & associated candidate countries.Workshop №3» (Budapest, Hungary, 18th-20th May 2008), на международной конференции « Laboratory diagnostics today and its future challenges. Dedicated to the 90 anniversary of the Food and veterinary Service of Latvia (Riga 28-29 August 2008), заседаниях ученого совета ГНУ ВИЭВ и ГНУ ВНИИВВиМ в 2006-2008 гг.
Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту:
1. Патоморфологические изменения у поросят с СМИО и ДСНП;
2,Особенности репродукции ЦВС-2 в перевиваемых клеточных культурах;
3. Морфологические характеристики цирковируса свиней 2-го типа;
4. Метод выявления ДНК ЦВС-2 с использованием полимеразной
цепной реакции в режиме реального времени;
5. Филогенетическое родство изолятов ЦВС-1, выделенных из
перевиваемых культур клеток, и изолятов цирковируса свиней 2-го типа,
циркулирующих в популяциях свиней на территории Российской Федерации.
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 131 странице и содержит следующие главы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и приложения. Работа иллюстрирована 29 рисунками, 8 таблицами. Список литературы включает 161 источник, в том числе 145 иностранных.
Личный вклад. Основная часть работы выполнена автором самостоятельно, личный вклад составляет не менее 70%. При разработке наборов для выявления и дифференциации цирковирусов свиней 1-го и 2-го типа с использованием ПЦР и ПЦР в режиме реального времени, оказывали консультативную и методическую помощь сотрудники лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ; при патоморфологических исследованиях -сотрудники сектора патоморфологии ГНУ ВИЭВ (г.Москва).
Физико-химические свойства цнрковирусов
Генетический материал вирусов представлен односпиральной кольцевой ковалентнозамкнутой молекулой ДНК длиной 1759 (ЦВС-1) и 1768 (ЦВС-2) нуклеотидов. Однако в работе Герилович А. П. (2007) высказано мнение о существовании ЦВС, содержащих 1860-1910 нуклеотидов. Установлено, что нуклеотидные последовательности ЦВС-1 и ЦВС-2 имеют около 70% гомологии (Kim Y., 2002). Согласно одним данным геном ЦВС содержит в себе от 6 (Mankertz А., 1996) до 11 (Kim Y., 2002) потенциально возможных открытых рамок считывания (ОРС), кодирующих белки размерами крупнее 5 кДа. Однако все исследователи сходятся во мнении, что функционально значимыми являются ОРС 1 и ОРС 2.
ОРС 1 ЦВС 1 содержит 936 нуклеотидов и кодирует белок, состоящий из 312 аминокислот (35,7 кДа). ОРС 1 ЦВС 2 насчитывает 942 нуклеотида, кодирующих белок из 314 аминокислот. ОРС 1 была названа Rep-геном, в связи с участием кодируемого белка в цикле репликации вируса.
ОРС 2 для ЦВС обоих типов имеет одинаковый размер - 600 нуклеотидов и кодируют основной капсидный белок (Сар) состоящий из 233 аминокислот (27,8 кДа) (Jue L., 2006; Mahe D. et al., 2000).
При экспрессии ОРС 2 в бакуловирусной системе, синтезируется белок идентичный белку, выделенному из очищенного вируса, который обладает способностью к самосборке с образованием капсидоподобных частиц. Эти данные свидетельствуют о том, что основной структурный белок кодируется ОРС 2.
Изучение репродукции вируса на перевиваемой линии клеток РК-15 показало, что вирусный антиген обнаруживается через 18 часов после заражения, при этом Cap-белок главным образом локализуется в ядрах инфицированных клеток (Cheung, Bolin, 2002).
Процент гомологии нуклеотидных последовательностей ОРС 1 у ЦВС 1 и ЦВС 2 составляет 83 %, а аминокислотных - 86%, что указывает на консервативность данного участка генома. При этом нуклеотидная последовательность ОРС-2 является более вариабельной, так как процент гомологии составляет 67%, а для аминокислотной последовательности 65%. (Morozov 1.,1998; Meehan М., 1998).
О функциональной значимости остальных рамок считывания известно не много. Однако, в работе J. Liu (2006) сообщали об обнаружении нового белка, кодируемого ОРС 3, который является необходимым компонентом в механизме репликации ЦВС-2 и играет важную роль в развитии индуцированного вирусом апоптоза.
В работе Mankertz А. (1996) описано картирование области ДНК, определяющей начало репликации ЦВС, длинной 111 п.о. Данный фрагмент содержит последовательности нуклеотидов, которые могут выступать как cis-элементы при репликации ДНК. Мотив, состоящий из 6 пар оснований. (51-CGGCAG-3 ), представляет собой инвертированный повтор, встречающийся 3 раза в данном фрагменте. Роль мотива до конца не известна, но существует предположение о возможности его функционирования как сайта связывания в кодирующей области Rep-белка. Второй мотив, представляющий собой нонануклеотид (5 AGTATTAC-3 ), был обнаружен на верхушке шпильки сформированной ДНК при репликации. Обнаруженный нонануклеотид оказался гомологичен нуклеотидам входящим в состав одноцепочечной кольцевой молекулы ДНК вирусов растений семейств Gemeniviridae и Nanoviridae (Meehan В.М. et al., 1997; Palmer K.E. et al., 1998) (табл. 2).
Так как мутация в данном мотиве приводила к блокировке репликации ДНК вируса, описанный нонануклеотид был определен как точка начала репликации ДНК ЦВС (Meehan В.М. et al., 1997; Niagro F.D. et al., 1998; Boevnik P., 1995). Эти данные свидетельствуют об уникальности ЦВС, так как они образуют отдельную промежуточную группу между вирусами животных и растений (Mankertz А., 1996). На основании этого было сформировано представление о пути эволюции ЦВС. По мнению отдельных авторов (Gibbs W., 1999), потенциальным родоначальником ЦВС может являться нановирус растений, инфицировавший животного и ассимилировавшийся с присутствующим в то время у хозяина, вирусом позвоночных (возможно калицивирус).
Недавно было доказано существование Rep - белка, состоящего из 168 аминокислот, также принимающего участие в цикле репликации вируса, образуя с Rep-белком так называемый Rep-комплекс (Cheung А., 2003).
Патологический материал
Применение в современной трансплантологии органов животных является альтернативным путем решения проблемы нехватки донорских органов человека. Наиболее предпочтительными донорами являются поросята. Однако основную опасность вызывает возможность потенциальной ксеногенной передачи вирусов от животных человеку через орган, ткань, клеточную трансплантацию или при воздействии на человека ex vivo свиных биологических материалов.
Учитывая обнаружение в 2001 г. ТТ-вируса человека, имеющего родственное происхождение с ЦВС, а также повсеместное распространение ЦВС-1 и ЦВС-2 среди популяций свиней, следует отнестись к применению органов поросят для трансплантологии с особой осторожностью, так как возможность возникновения смешанной инфекции не определена.
Важным достижением в изучении ЦВС стала разработка современных высокоэффективных диагностических методов обнаружения и дифференцировки ЦВС-1 и ЦВС-2. Применение методов лабораторной диагностики совместно с комплексом ветеринарно-санитарных мероприятий позволяет на ранних стадиях купировать развитие болезни и предотвратить распространение ЦВС среди здоровых животных.
В настоящее время опубликовано большое количество научных работ о ЦВС, тем не менее, до сих пор не удалось ответить на многие важные вопросы. Не смотря на значительный прогресс в области изучения цирковирусов свиней, в отечественной литературе отсутствуют данные о выделении вируса от животных с признаками СМИО или ДСНП. Данные о патологических изменениях при ЦИС представлены единичными работами.
В качестве референтного положительного контроля использовали ЦВС-2 штамм Stoon 1010 р.34 любезно предоставленный Dr. Т. Stadejek и Dr. К. Podgorska (National Veterinary Institute, Pulawy, Poland).
При проверке специфичности методов ПЦР и ПЦР в реальном времени в качестве гетерологичных агентов были использованы наиболее часто встречающиеся у свиней патогены: вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС), вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ВТГЭС), ротавирус свиней, энтеровирус вирус свиней, вирус классической чумы свиней (КЧС), вирус болезни Тешена, вирус болезни Ауески, ДНК вируса африканской чумы свиней (АЧС), М. hyopneumoniae, Pasteurella multocida.
Для заражения культур клеток использовали полевые изоляты ЦВС-2, выделенные от поросят из свиноводческих хозяйств Тульской и Белгородской областей.
В работе использованы клеточные линии представленные в коллекции культур клеток ГНУ ВИЭВ и рабочей коллекции культур клеток ГНУ ВНИИВВиМ: В работе использованы клеточные линии представленные в коллекции клеточных культур сельскохозяйственных животных РАСХН (ГНУ ВИЭВ) и рабочей коллекции культур клеток ГНУ ВНИИВВиМ: перевиваемая линия клеток почки свиньи (РК-15 (Португалия)), 19 клональных сублиний РК-15, перевиваемая линия клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки (CV-1), перевиваемая линия клеток почки свиньи (SK-6), перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки (Vero), перевиваемая линия клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК), ПСГК-60, гибридная внутривидовая перевиваемая клеточная линия СПЭВ и спленоциты свиньи (А4С2), первичная культура клеток тестикул поросенка (ПТП).
Материалом для выполнения исследований являлись органы и ткани от подсвинков из хозяйств РФ. Животные с клиническими признаками, характерными для цирковирусной инфекции свиней и серопозитивные к ЦВС-2 подвергались диагностическому убою. Пробы органов от здоровых животных также были использованы в работе для проверки достоверности получаемых результатов.
В качестве референтного положительного контроля использовали положительную сыворотку к ЦВС-2 любезно предоставленную Dr. Т. Stadejek и Dr. К. Podgorska (National Veterinary Institute, Pulawy, Poland).
Для выявления AT к ЦВС-2 и AT к ВРРСС в работе исследовали сыворотки крови от животных разных возрастных групп и пород отобранные в свиноводческих хозяйствах. - 5х реакционный буфер Амплисенс Blue (Интерлабсервис, г. Москва). - 5х реакционный ПЦР буфер (Fermentas, Латвия). - смесь нуклеозидтрифосфатов dNTP mix 25mM (Fermentas, Латвия). - специфические олигонуклеотиды и флуоресцентные зонды (ЗАО «Синтол», г. Москва). - гуанидин тиоцианат (Fluka Biochemika №50990); - деионизированная вода; - сорбент нуклеиновых кислот (силика) («Helicon», г. Москва); - Taq-ДНК-полимераза (5 ед./мкл);
Изучение патоморфологических изменений у поросят при цирковирусной инфекции
По мнению зарубежных исследователей, занимающихся изучением заболеваний, ассоциируемых с цирковирусами свиней, существует 3 основных критерия на основании которых можно поставить диагноз на ЦИС: наличие цирковируса свиней 2-го типа в органах и тканях больного животного, клинические признаки заболевания и характерные изменения в лимфоидных органах.
В связи с этим изучение патоморфологических изменений у поросят, как наиболее восприимчивой к инфекции возрастной группе, являлось немаловажным аспектом в исследованиях данного заболевания.
С этой целью, в одном из хозяйств Тульской области были отобраны 10 животных с характерными для ЦИС поражениями. Ярко выраженные клинические признаки отмечали у животных в группе отъёма (35-50 дней). У поросят наблюдали отставание в росте, отдышку, отказ от корма, вялость, конъюнктивиты, субфебрильную лихорадку, появление множественных петехий на коже животного. В ряде случаев, геморрагические поражения могли сливаться и формировать разлитые пятна различной формы и размера. Чаще всего пятна локализовались в области поясницы, медиальной поверхности задних конечностей, в области хвоста, вдоль живота и ушей. У отдельных животных отмечали посинение морды и кончиков ушей (рис. 4).
При патологоанотомическом обследовании вынужденно убитых животных отмечали множественные поражения в различных системах органов.
В легких обнаруживали ателектазные участки верхушечных долей (рис. 5). Легочная плевра несколько отечна. Миокард, как правило, увеличен, отечен (рис. 6а) У одного подсвинка в перикарде содержалось большое количество свернувшегося фибрина (рис. 66). Бронхиальные лимфатические узлы увеличены. Рыхлая соединительная ткань средостения отечна.
Брюшная полость содержала повышенное количество экссудата, у отдельных животных он был мутным. Печень у всех животных несколько увеличена, светлее обычной, дряблая на ощупь. Желчный пузырь у всех обследованных животных наполнен густой, темно-зеленого цвета желчью. Портальные лимфатические узлы бугристые, гиперплазированные, кровенаполненные и имели жёлто-красный цвет. В ряде случаев присутствовало значительное увеличение стенки лимфатических сосудов (рис. 7).
Стенка желудка и отдельных петель кишечника утолщена за счет отека соединительной ткани брыжейки. Кровоизлияний на слизистой оболочке в области пилоруса и илеоцекального клапана не отмечали.
Для проведения дифференциальных диагностических исследований методом ПЦР использовали органы от каждого из 5 больных животных. Во всех исследованных образцах была обнаружена ДНК ЦВС-2, при отсутствии геномов ВКЧС, ЦВС-1, ВТГЭС и микоплазм. У 4 из 10 животных был обнаружен геном ВРРСС. Полученные результаты свидетельствуют о циркуляции в хозяйстве двух инфекционных агентов. Следует отметить, что выявленные патологические изменения не являются характерными для РРСС, что может свидетельствовать о первопричинности болезни вызванной ЦВС-2, либо об изменении патологоанатомической картины РРСС вследствие развития смешанной инфекции.
Таким образом, обнаруженные нами макроскопические изменения в широком спектре органов подтверждают данные о мультисистемном характере заболевания.
Основными гистопатологическими изменениями в тканях являлись системные продуктивные васкулиты кровеносных сосудов мелкого и среднего диаметра.
Патологические изменения были обнаружены в почках, печени, сердце, кишечнике, легких, лимфатических узлах, коже, селезенке. В почках отмечали очаговые и диффузные гломерулонефриты с лимфогистиоцитарной инфильтрацией в периваскулярном пространстве (рис. 10 а, б). В ряде случаев наблюдали атрофию почечных канальцев.
Исследование патологического материала из хозяйств РФ на наличие генома цирковируса свиней 2-го типа
Животные с положительными антительными профилями к ЦВС-2, ПЦР-положительные, а также с выраженными клиническими признаками подвергались диагностическому убою. От вынужденно убитых животных отбирали лимфатические узлы с целью дальнейшего вирусвыделения. Лимфатические узлы измельчали и гомогенизировали в TNE буфере с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, используя гомогенизатор MPW 302 для получения 10 % суспензии. Полученный гомогенат трижды обрабатывали ультразвуком и осветляли низкоскоростным центрифугированием при 2500 g в течении 20 минут.
С целью освобождения от присутствующих в гомогенате тканей посторонних инфекционных агентов вирусной и бактериальной природы проводили обработку вирусной суспензии фреоном 113. Обработанный супернатант использовали для заражения культур клеток. Подбор клеточных линий для культивирования ЦВС-2 в условиях in vitro проводили основываясь на чувствительности культур клеток к репродукции вируса, а также учитывая тропизм цирковируса к клеткам лимфоидного типа.
Для размножения ЦВС-2 отбирали культуры клеток свободные от контаминации цирковирусом свиней 1-го типа: CV-1, Vero, РК-15 (клон А9), А4С2. Наличие ЦВС-2 в инфицированных культурах клеток подтверждали постановкой ПЦР. Результаты исследований представлены в табл. 7.
Таблица 7 Как видно из данных представленных в табл. 7 после проведения 12 пассажей, ДНК ЦВС-2 обнаруживали лишь в культурах клеток А4С2 и РК-15 (клон А9). Однако многочисленные данные, а также результаты наших исследований свидетельствуют о наличии ЦВС-1 в культуре клеток РК-15.
Таким образом, использование клонов РК-15 потенциально может приводить к появлению ЦВС-1 в процессе культивирования. В результате чего для нашей дальнейшей работы более приоритетным и безопасным было использование клеточной линии А4С2.
Введение вирусного материала осуществляли на стадии формирования 50-60% монослоя, а также в суспензию клеток при посеве культуры. Внесение вируса на данных стадиях клеточного цикла обусловлено тесной взаимосвязью репродукции вируса и ферментов, участвующих в делении клетки, активно образующихся в S-фазе.
Культивирование инфицированных клеток осуществляли при 37 С в питательной среде И-МЕМ, с добавлением 5% фетальной сыворотки (HyClone), 5% сыворотки крупного рогатого скота (ПанЭко) и 2 мМ L-глютамина путем последовательных пересевов.
Пассирование культуры клеток РК-15, зараженной ЦВС-2 в монослой проводили с обработкой 300 мМ D-глюкозамина по методу, описанному Allan G.M.. ( ) в модификации Lagan Р. (2007). Применение глюкозамина способствует увеличению вирусного потомства примерно в пятьдесят раз по сравнению с необработанной культурой.
Присутствие ЦВС-2 в инфицированных культурах клеток контролировали постановкой стандартной ПЦР.
Проведенные исследования позволили выявить наличие ДНК ЦВС-2 в культурах клеток Vero и CV-1 до. уровня 3-го пассажа. Полученные данные могут быть результатом выявления следовых количеств первоначально внесенной инфицирующей дозы ЦВС-2, пассирующейся вместе с культурой и ни как не связанной с репродукцией вируса. Данные культуры клеток были исключены из дальнейшей работы.
Обнаружение цирковируса свиней 2-го типа в культурах клеток А4С2 и РК-15 (А9) на уровне 12 пассажа свидетельствует о размножении вируса в данных клеточных системах.
Следует отметить, что размножение вируса в культуре клеток А4С2 вызывало образование деструктивных изменений в клетках, при отсутствии таковых в контроле культуры. Изучение влияния вируса на клетки перевиваемой линии А4С2 проводили в динамике (24, 72 и 96 часов). После проведения 4-х последовательных пассажей, в культуре клеток наблюдали постепенное развитие альтераций в клетках. Первые изменения обнаруживали на 2 сутки после заражения. В отдельных участках монослоя клетки сильно преломляли свет, в перинуклеарном пространстве отмечалась зернистость цитоплазмы. В ядрах отдельных клеток наблюдали маргинацию хроматина. На 4 сутки после пересева, клетки округлялись и отслаивались от стекла с образованием пустот в монослое (рис. 21).