Введение к работе
Актуальность проблемы. Современное состояние вопроса инактивации вирусного генома для получения неинфекционных вирусных препаратов характеризуется отсутствием научного обоснования выбора агентов, а также строгого контроля условий процесса инактивп'-ми. Лаже для ультрафиолетового (УФ) облучения, широко применяемого в медицинской практике для стерилизации и инактивации возбудителей инфекционных заболеваний (в том числе и вирусов), отсутствуют систематические исследования. Изучение фотохимических процессов инактивации интересно и важно по і- .ду причин: 1) УФ-иалучение -естественный фактор внешней среды и нельзя понять многих вопросов происхождения, эволюции и экологии живых организмов, не зная механизма действия УФ лучей на белки и нуклеиновые кислоты; 2) понимание основных механизмов действия УФ-облучения на биологически важные соединения необходимо, как теоретический фундамент практического использования УФ лучей; 3) методы и результаты фотохимических исследований нашли должное применение в современной молекулярной биологии. Среди всех УФ-индуцированных фотоповреждений, возникающих в нуклеопротеидах, нуклеиново-белковые межмолекулярные ковалентные сшивки занимают особое место. В настоящее время этот эффект широко используется для исследования взаимного пространственного расположения молекул нуклеиновых кислот и белков в нуклео-протеидных комплексах и изучения механизмов белково-нукіеинового взаимодействия. УФ-облучение является удобным инструментом для изучения структурной организации вирусных частиц. Использование этого подхода позволяет определить белковые структуры, формирующие вирусный нуклеопротеид, и пространственную локализацию отдельных компонентов вириона. В данном докладе будут рассмотрены результаты ряда работ, посвященных изучению роли возникновения РНК-белковых * сшивок в процессе УФ-инактивации нескольких РНК-содержащих вирусов
и идентификации участков белковых ыолекул, непосредственно вовлеченных в формирование таких сшивок.
Цель и вадачи исследования.
Основная цель настоящей работы состояла в изучении молекулярных основ действия УФ-облучения на РНК-содерхащие вирусы человека и животных.
В вадачи исследования входило:
-
Исследовать характер взаимодействие РНК с белком в составе вирусных нуклеокапсидов.
-
Определить количественные соотношения вирусных компонентов, образующих УФ-индуцированные РНК-белковые ковалентные свяви и идентифицировать белок сшивающийся с РНК.
-
Изучить феномен частичной защиты макромолекул в составе РНП от действия гидролитических ферментов.
-
Изучить процесс инактивации инфекгионности представителей нескольких вирусных семейств под действие і УФ-облучения и отработать условия данного воздействия, гарантирующие надежность и глубину инактивации инфекционной активности исследуемых вирусов и сохранение антигенных и иммуногенных овояств вирусных белков.
-
Исследовать основные механизмы действия УФ-облучения на РНК-содержащие вирусы и определить для каждого основное летальное фотоповреждение вирионой РНК, приводящее к вирусной инактивации.
Научная новизна и практическое аначение работы.
Впервые с достоверностью показано возникновение ковалентних РНК-белковых связей в РНП вируса гриппа при УФ-облучении. Впервые дано экспериментальное обоснование представлению об участии азотистых оснований в РНК-белковом взаимодействии в РНП вируса гриппа А. Впервые показано, что евШе 802 азотистых оснований Ь РЖ
вируса гриппа либо не контактируют с NP белками, или ориентированы в таком направлении, что образование сшивки, как результат фотохимической реакции, невозможно. Впервые показано, что достаточное количество NP белка - не менее, чем 50Z - может быть связано с вирионной РНК УФ-облучением. Показана защитная роль белка РНП в процессе гидролиза вирусной РНК панкреатической РНК-ааой и «^клеевой S1, которая возрастает после УФ-облучения. РНК в составе РНП не экранирует белки от действия пронааы.
Определены параметры режима инактивации вируса гриппа, кинетика которой была многоударной. УФ-инактивация гетерогенной популяции вируса гриппа показала,что и' *екционность филаментозных ви-рионов менее чувствительна к действию УФ-света, чем сферических. Различие в их кинетике УФ-инактивации предполагает, что филамен-тозные вирионы являются мультиггномкыми. Показано, что УФ-инактивация инфекционности вирусов гриппа А связала с образованием РНК-белковых ковалентних связей и соответствует количеству РНК-белковых сшивок на геном. УФ-облучеки" (в пределах использованных доз) не влияет на гемагглютинирупцую активность вируса гриппа. Нейра-минидаза при этом частично деградирует. Показана корелляция ыежду УФ-инактивацией инфекционности вируса гриппа А и снижением синтеза вирусной РНК, что связано с изменением условий РНК-полимеразн-ой функции и с фотоповреждениями.
Изучено действие УФ-облучения и прогревания на вирус энцефа-ломиокардита (ВЗЫ) мышей. Показана большая стабильное: ВЗЫ к этим воздействиям, чем у других пикорнавирусов. Впервые показано при УФ-облучении образование РНК-белковых ковалентних связей для кардиовирусов, в котором приню«ают очень ограниченная часть молекулы вирионной РНК и не более двух капсидных субъедквицы (2Х всех вирусных белков).
Впервые показано, что УФ-облучение вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЗЛ) приводит к образованию урациловых фо-тодимеров и ковалентному связыванию нуклеокапсидного бел- '.Ос
- 4 -вирионной РНК. УФ-инактивация инфекционности ВЭЛ связана с образованием пиримвдиновых димеров. Анализ ковалентно-связанных РНК-белковых комплексов показал, что не менее 1Z генома связано с С белком ( в "чличестаенном отношении не более 25 молекул белка на молекулу РНК), что указывает на интенсивный контакт РНК с белком внутри вирусного нуклеокапсида.
Впервые показано, что при УФ-облучении вируса вал происходит агрегация вирионов, что прямо зависит от доза УФ-света. Образующийся фотопродукт представляет собой прошитый УФ-индуцированными РНК-белковымк и белок-белковыми ковалентними связями агрегат нескольких вирионов.
Впервые изучено действие УФ-облучения различной интенсивности (включая, нано- и пикосекундным УФ-лазером) на инфекционность вируса ВЭЛ. Показан экспоненциальный характер зависимости инфекционной активности вируса от дозы УФ-облучения и интенсивности светового потока. Основной летальный фотопродукт образуется по одноквантовому механизму. Определены квантовые выходи инактивации инфекционности, образования урациловых димеров и РНК-белковых сшивок.
Впервые изучено действие УФ-облучения на инфекционность ро-тавируса SA11. Инактивация вируса происходила в основном с одно-ударной кинетикой. Показано,что образование урациловых фотодиме-ров является основным механизмом инактивации ротавируса. РНК-белковые сшивки зарегистрированы только при высоких дозах облуче-н.... и не играют существенной роли в инактивации.
Работа имеет в основном теоретический характер. Однако, полученные результаты .хины и в практическом применении, поскольку являются теоретическим фундаментом для разработки производственной фотоинактивации РНК-содержащих вирусов человека и животных. Экспериментально отработанные условия и режимы инактивации инфекционности данных вирусов могут служить основой для производства неинфекционных, иммуногешшх вирусных препаратов, необходимых для
- 5"-дкагностики и профилактики определенных вирусных инфекций.
Основные положения выносимые на защиту:
-
Метод индукции РНК-белковых ковалентных сшивок впервые применен для характеристики РНК-белковых контактов в вирусах гриппа, энцефаломиокардита мышей, венесуэльского энцефаломиелита лошадей и ротавируса SA11, характеризующихся разным типом симметрии и имеющих разный тип укладки РНК в белковом чехле. Впервые выявлено, в различной степени, участие авотистых оснований в этом взаимодействии у вышеобоэначенных г -русных моделей. Данные создают основу для понимания процесса специфичности взаимодействия РНК и белка при сборке нуклеокапсида.
-
Определены условия и оптимальные режимы инактивации ин-фекционности изученных вирусов. Для эффективной инактивации необходимы строгий контроль условий процесса УФ-облучения вирусной суспензии относительно интенсивности падающего светового потока и ее оптической плотности.
-
Определены механизмы фотсинактивации и основные летальные фотоповреждения вирусных РНК, ответственных ва УФ-инактивацию вирусов: образование пиримиднновых дилеров - для пикорнавирусов, альфавирусов и ротавирусов; образование РНК-белковых ковалентных связей - для вирусов гриппа.
Публикация работ. Основные положения диссертации отражены в 20 опубликованных научных работах. Подробное изложение выполнения этапов работы было представлено также в ежегодных отчетах и обзорах ПО проблеме (1980-1992 ГГ.).
Апробация работы. Основные экспериментальные материалы и по- -ложения диссертации были доложены и обсуждены на научта сессиях НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского по обшей, молекулярной ме-
- в -дицинской вирусологии (1380-1992 гг.). Пленумах проблемной комиссии "Химиотерапия и химиопрофилактика вирусных инфекций",Минск,
-
г., 1932 г., I конференции вирусологов Казахстана, Алма-Ата,
-
г., Меуународном семинаре по биотехнологии, Куба, Гавана,
*
1936 г., международном симпозиуме "Арбовирусы и арбовирусные инфекции", Москва, 1989 г., Всесоюзной конференции "Энтеровирусы. Общетеоретические и медицинские аспекты", Киев, 1991 г.
X X X
Автор вырадает благодарность за продуктивное сотрудничество научным сотрудникам Института вирусологии им. Л.И. Ивановского РАМН А.М.Махосу, Н.Ф.Правдинои.Г.А.Галегову, Е.А.Говорковой, Я.Я. Цилинскому, М.А. Кузнецовой; сотруднику Института спектроскопии РАН Д.Н.Нккогосяну; сотрудникам НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов Н.Н.Амитиной, В.А.Гиневской; сотрудникам Белоруского НИИ эпидемиологии и микробиологии С.П.Капитульцу, В.Л.Колодкиной, сотрудникам Национального центра научных исследований (Гавана,Куба) М.П.Родригес-Мольто.М.Тейхело, сотрудник; ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи Н.В. Клицуновой.Автор выражает глубокую признательность чл.-корр.РАМН, профессору Н.В.Каверину за_постоянное внимание и консультативную помощь в процессе вылолнения работы.