Введение к работе
Актуальность проблемы
Краснуха – острое вирусное заболевание, широко распространенное как у детей, так и у взрослых. Вакцинация является наиболее эффективным, экономичным и доступным средством борьбы с краснухой. В России вакцинация против краснухи введена в календарь прививок с 1998 г. Несмотря на все более широкое применение вакцины против краснухи, среди женщин детородного возраста сохраняется значительная неиммунная прослойка, что сохраняет угрозу появления случаев синдрома врожденной краснухи (СВК). В связи с этим проблема профилактики СВК в настоящее время является весьма актуальной. В настоящее время в Российской Федерации для иммунизации населения против краснухи используется вакцина зарубежного производства, созданная на основе штамма Wistar RA27/3 и впервые зарегистрированная в Европе в 1971 г. [Plotkin S.A., 1976]. Для проведения широкомасштабной вакцинации в России и снижения издержек на закупку зарубежной вакцины требуется создание вакцины, основанной на отечественном вакцинном штамме.
С учетом массовости и повторности прививок против этой инфекции важны надлежащее качество применяемых вакцин и их низкая реактогенность. Особое значение имеет контроль генетической стабильности вакцинных штаммов. Такой контроль необходим, так как в процессе производства вакцин возможно накопление в геноме вакцинного вируса мутаций, способных привести к снижению или потере иммуногенных свойств вследствие гиператтенуации, а также к реверсии аттенуированного вируса к дикому штамму. Согласно рекомендациям ВОЗ, в особенности, для живых аттенуированных вакцин, следует проводить контроль генетической стабильности, поиск генетических маркеров аттенуации и подтверждение их наличия в вакцинных штаммах [WHO, Technical Report Series No 941, 2007; WHO Technical Report, Series №. 924 2004].
Механизмы аттенуации вируса краснухи изучены не полностью, поэтому актуальным является изучение механизмов ослабления диких вариантов вируса, поиск ключевых мутаций, ведущих к аттенуации, а также выявление характерных фенотипических проявлений, которые могут служить маркерами аттенуации и использоваться наряду с секвенированием для контроля генетической стабильности вакцинных штаммов.
Цели и задачи исследования
Целью настоящего исследования являлось выявление фенотипических и генетических детерминант аттенуации вируса краснухи на примере штамма С-77.
Для реализации поставленной цели требовалось решение следующих задач:
биологическая характеристика дикого и ослабленного вариантов штамма С-77 вируса краснухи и выявление фенотипических детерминант его аттенуации;
подбор праймеров для секвенирования генома вируса краснухи и оптимизация условий проведения ПЦР;
определение генотипа штамма С-77 вируса краснухи;
полноразмерное секвенирование генома дикого и холодоадаптированного (wt и ca) вариантов штамма С-77 вируса краснухи;
сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей wt и ca вариантов штамма С-77 вируса краснухи и поиск вероятных генетических маркеров его аттенуации.
Научная новизна работы
Впервые в России осуществлен анализ геномов дикого и холодоадаптированного вариантов (ca и wt варианты) вируса краснухи. Было проведено сравнение последовательностей геномов ca и wt вариантов штамма С-77, а также других известных последовательностей геномов вируса краснухи. На основании этого сравнения были установлены вероятные генетические маркеры аттенуации, согласующиеся с современными представлениями о механизмах аттенуации вируса краснухи. В частности, была обнаружена аминокислотная замена в позиции 1042 домена, кодирующего протеазу, которая играет ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа ca варианта штамма С-77. С использованием современных вирусологических, иммунохимических и молекулярно-биологических методов установлены фенотипические маркеры аттенуации холодоадаптированного варианта штамма С-77 вируса краснухи.
Практическая значимость работы
Отработанные методические приемы выявления генетических и фенотипических маркеров аттенуации вируса краснухи, выявленные генетические и фенотипические маркеры аттенуации штамма С-77 могут быть использованы в научных исследованиях, а также для контроля вакцинных штаммов на производстве, разработки и характеристики новых вакцинных штаммов вируса краснухи.
Полученные в работе данные о механизмах аттенуации вируса краснухи могут быть использованы при разработке вакцинных препаратов.
Вариант штамма С-77 на 39 пассаже обладает биологическими маркерами аттенуации: пониженной иммуногенностью на кроликах по сравнению с диким вариантом и холодоадаптированным фенотипом, что позволяет рассматривать его в качестве кандидата для разработки на его основе отечественной вакцины.
Положения, выносимые на защиту
-
Варианты штамма С-77 вируса краснухи на 39 и 46 пассажах обладают холодоадаптированным фенотипом, то есть способны к эффективной репродукции при пониженной температуре.
-
Сa и wt варианты штамма С-77 обладают фенотипическими различиями, выражающимися в сниженной иммуногенности на кроликах и более интенсивной репродукцией холодоадаптированного варианта штамма С-77 при пониженной температуре по сравнению с диким вариантом.
-
В процессе холодовой адаптации штамма С-77 в геноме вируса произошло 13 нуклеотидных замен, 6 из которых вели к замене аминокислот. Часть из них уникальна и, возможно, определяет фенотипические отличия дикого и холодоадаптированного штамма.
-
Большая часть аминокислотных замен локализована в области, кодирующей неструктурные белки, в частности, протеазу и представляют особый интерес, так как мутации в этом регионе, по данным литературы, приводят к возникновению холодоадаптированного фенотипа и связаны с аттенуацией вируса краснухи. Замена Tyr на Cys в позиции 1042 ОРС НСБ области, кодирующей протеазу, играет ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа ca варианта штамма С-77.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы представлены на Всероссийском ежегодном конгрессе «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика» (Санкт-Петербург, 2010 г.), конференции молодых ученых «НИИВС им И.И. Мечникова» РАМН (Москва, 2011 г.), 11-ом международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011 г.).
Апробация диссертации состоялась 07.06.2012 г. на научной конференции отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.
Публикации результатов исследования
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 6 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 136 источника, из которых 11 отечественных и 125 зарубежный. Работа выполнена на 123 страницах машинописного текста и иллюстрирована 10 таблицами и 23 рисунками.
