Введение к работе
Актуальность проблемы.
Известно, что основную роль в регуляции экспрессии генов играют транскрипционные факторы, участвующие на разных стадиях данного процесса. Для правильного функционирования механизмов регуляции транскрипции в геноме высших эукариот исключительно важна пространственная структура хроматина. Большинство генов регулируется при помощи удаленных элементов - энхансеров и репрессоров, которые специфично сближаются с промоторами целевых генов, вызывая изменение их активности. Существуют также геномные элементы - инсуляторы, обеспечивающие специфичность таких взаимодействий, разобщая геном на независимые домены и препятствуя влиянию «чужих» энхансеров на промоторы генов.
Механизм того, каким образом происходит специфичное сближение промоторов и энхансеров на больших дистанциях (свыше 1000 пн) до сих пор остается неизвестным. Интересно, что многие известные инсуляторы обладают способностью специфично взаимодействовать друг с другом на больших дистанциях подобно взаимодействию энхансеров и промоторов, по всей видимости, используя сходные механизмы, и в определенных случаях даже участвуя в установлении энхансер-промоторных контактов. Аналогичной активностью обладают изолированные сайты связывания инсуляторных белков Drosophila (Su(Hw), Zw5 и CTCF) Очевидно, что для этого важны избирательные белок-белковые взаимодействия между транскрипционными факторами. На основании наблюдений, сделанных ранее при изучении белков-репрессоров транскрипции у прокариот (сі фага \ deoR), а также белков Zeste и GAGA Drosophila, было сделано предположение о необходимости формирования белковых мультимеров высокого порядка (по меньшей мере, октамеров) для осуществления взаимодействий между удаленными геномными элементами. Факторы, перечисленные выше, формируют мультимеры и способны сближать свои сайты связывания на значительных расстояниях. Применимость такого механизма к объяснению специфичных взаимодействий, осуществляемых инсуляторными белками, остается неясной.
Изучение механизмов работы инсуляторов, таким образом, может помочь пролить свет на фундаментальную проблему изучения механизма дальних взаимодействий в геноме.
Это и определяет актуальность данной работы, посвященной изучению доменов инсуляторных белков, выполняющих функции белок-белковых взаимодействий, и анализу их потенциальной роли в установлении и поддержании дальних геномных взаимодействий.
Цель и задачи исследования.
Основной целью работы является проверка гипотезы о необходимости формирования белковых мультимеров высокого порядка для осуществления геномных взаимодействий на расстоянии более 1 т.п.н. Для достижения этой цели в работе были поставлены следующие задачи:
1) Подтвердить способность В ТВ-домена GAGA-фактора и гомологичных доменов
других ВТВ-содержащих белков формировать мультимеры высокого порядка.
Проверить способность GAGA-фактора поддерживать энхансер-промоторные взаимодействия в модельной системе Drosophila melanogaster на расстоянии 5.5 т.п.н.
Провести поиск доменов, способных к мультимеризации в структуре всех известных инсуляторных белков Drosophila melanogaster - Su(Hw), dCTCF, Zw5, CP190.
Провести сравнительный анализ белковых партнеров белков CTCF Drosophila и человека.
Изучить функции мультимеризующих доменов инсуляторных белков, не связанные напрямую с поддержанием дальних взаимодействий, оценить их влияние на потенциальные коммуникаторные функции инсуляторных белков.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В работе впервые напрямую показана способность целого семейства ВТВ-доменов формировать мультимеры порядка более тетрамера. На примере GAGA-фактора продемонстрирована недостаточность кооперативного эффекта формирования мультимера высокого порядка для установления стабильного взаимодействия энхансера и промотора на дистанции 5.5 т.п.н. В структуре белка CTCF Drosophila melanogaster, эффективно осуществляющего взаимодействие между удаленными геномными элементами, идентифицирован димеризующий домен, охарактеризован внутримолекулярный контакт между доменом «цинковые пальцы» и С-концевым доменом, показана способность CTCF взаимодействовать с РНК-полимеразой П. ВТВ-домен инсуляторного белка СР190 охарактеризован как димеризующий, показана его роль во взаимодействии с CTCF и регуляторное влияние на контакт CTCF и РНК-полимеразы П. Участие ВТВ-домена белка СР190 в установлении дальних геномных взаимодействий по результатам данного исследования подвергается сомнению.
Результаты данной работы вносят существенный вклад в развитие представлений о роли доменов белок-белкового взаимодействия у транскрипционных факторов в структурно-функциональной организации эукариотического генома.
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы были представлены на школе-конференции молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Звенигород, 2010), 14-й и 15-й международных конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010, 2011), на международных конференциях "Control of gene expression and cancer" (Москва, 2010), ESF-EMBO Research Conference "Molecular Perspectives on Protein-Protein Interactions" (Sant-Feliu de Guixols, 2010), EMBO Workshop "Chromatin structure, organization and dynamics" (Prague, 2011), 36th FEBS Congress "Biochemistry for Tomorrow's Medicine" (Turin, 2011).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Из них статей - 1, материалов конференций - 8.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 103 страницах, содержит 29 рисунков и состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов исследования, Обсуждения, Выводов и Списка литературы, включающего 172 источника.
