Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Функциональный анализ продуктов генов mcc-подобных кластеров из геномов бактерий Bacillus amyloliquefaciens DSM7, Yersinia pseudotuberculosis IP32953, Streptococcus equinus JB1 Цибульская Дарья Сергеевна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Цибульская Дарья Сергеевна. Функциональный анализ продуктов генов mcc-подобных кластеров из геномов бактерий Bacillus amyloliquefaciens DSM7, Yersinia pseudotuberculosis IP32953, Streptococcus equinus JB1: диссертация ... кандидата Биологических наук: 03.01.07 / Цибульская Дарья Сергеевна;[Место защиты: ФГБУН Институт биологии гена Российской академии наук], 2018

Содержание к диссертации

Введение

Обзор литературы 11

1. Бактериоцины 11

2. Микроцин С 17

2.1. Строение и регуляция синтеза микроцина С 17

2.2. Созревание и экспорт микроцина С 19

2.3. Импорт и механизм действия микроцина С 25

2.4. Иммунность клетки-продуцента к микроцину С 30

2.5. Биологическая активность микроцина С 32

3. mcc-подобные кластеры генов 35

3.1. Филогенетическое дерево предсказанных членов MccB/PaaA семейства белков 35

3.2. Аденилирование гомологов MccAEco in vitro и проверка их биологической активности. 38

3.3. Ингибирование Asp-RS гомологами микроцина С in vitro 39

Материалы и методы 40

1. Материалы 40

1.1. Штаммы 40

1.2. Питательные среды и антибиотики 41

1.3. Геномная ДНК 42

1.4. Плазмиды 42

2. Методы 43

2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 43

2.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (кПЦР) 43

2.3. Электрофорез в агарозном геле 47

2.4. Электрофорез белков в денатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ) 47

2.5. Выделение РНК и обратная транскрипция 48

2.6. Выделение геномной и плазмидной ДНК 49

2.7. Очистка ДНК-фрагментов 49

2.8. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 49

2.9. Лигирование ДНК 49

2.10. Приготовление компетентных клеток E. coli 49

2.11. Трансформация E. coli 50

2.12. Приготовление компетентных клеток B. subtilis 168 и трансформация 51

2.13. Нокаут hns гена в E. coli 51

2.14. Выделение и очистка рекомбинантного белка 52

2.15. Реакции in vitro 53

2.16. Выделение и очистка McC и микроцин-С-подобных соединений 54

2.17. Приготовление клеточного лизата S30 54

2.18. Реакция ингибирования Asp-RS in vitro в лизатах клеток 55

2.19. Масс-спектрометрический анализ 55

2.20. Тест на чувствительность к McCYps 56

2.21. Компьютерные программы и приложения 57

Результаты и обсуждение 58

1. Описание mcc-подобных кластеров, кодирующих гомологи MccBЕco с дополнительным С-концевым доменом 58

2. Исследование функций генов кластера mccBam. 62

2.1. Проверка предсказания mcc-подобного кластера из B. amyloliquefaciens DSM7 in vivo 62

2.2. Сравнение нуклеотидной специфичности MccBX0Bam и MccBEco 64

2.3. Функция С-концевого домена MccBX0Bam белка MccX1Bam 67

2.4. Активность синтезированных пептидил-нуклеотидов 70

3. Исследование функций генов, входящих в кластер mccSeq 74

3.1. Белок MccBX0Seq и С-концевой домен белка MccE2X1Seq катализируют каскад реакций биосинтеза карбоксиметилированного пептидил-цитидилата 74

3.2. N-концевой домен белка MccE2X1Seq обеспечивает иммунность к пептидил нуклеотидным антибиотикам 77

4. Исследование функций генов, входящих в кластер mccYps 79

4.1. Белки MccBX0Yps и MccX1Yps осуществляют биосинтез карбоксиметилированного пептидил-цитидилата 79

4.2. Гетерологическая экспрессия mccYps-кластера 82

4.3. Делеционный анализ функции генов кластера mccYps 86

4.4. Выделение биоактивного микроцин-С-подобного соединения из Y. pseudotuberculosis IP 32953 89

4.5. Иммунность к McCYps. 93

4.6. Сравнение механизмов токсичности микроцинов С из E. coli и Y. pseudotuberculosis IP 32953 . 95

Заключение 98

Выводы 105

Список использованной литературы 106

Список сокращений и условных обозначений 117

Приложение 1 120

Приложение 2 124

Благодарности 132

Введение к работе

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

С момента открытия в 1928 году Александром Флемингом пенициллина начался золотой век антибиотиков [1]. Благодаря антибиотикам средняя продолжительность жизни людей в мире заметно выросла. Антибиотики помогли справиться с такими серьезными заболеваниями, как холера, чума и туберкулез. Однако совсем скоро появилась проблема распространения микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам. Многие из существующих препаратов уже не способны справиться с различными патогенными бактериями. Именно поэтому исследование и разработка новых классов антибактериальных соединений является важной и актуальной задачей современных научных исследований.

Существует несколько подходов при разработке антибактериальных препаратов: поиск природных антибиотиков, химическая модификация природных антибиотиков и скрининг химических комбинаторных библиотек. Самым продуктивным способом на данный момент является поиск новых классов природных антибиотиков. Прямой поиск штаммов микроорганизмов, продуцирующих антибактериальные соединения, сейчас не является эффективным, в связи с большой вероятностью обнаружения ранее открытых соединений. Более перспективным подходом является биоинформатический поиск кластеров генов, ответственных за синтез антибиотиков. С помощью такого подхода недавно были обнаружены и описаны генные кластеры синтеза различных микроцин-С-подобных соединений [2]. Микроцин С – это рибосомально-синтезированный и посттрансляционно модифицированный антибиотик, действие которого в основном направленно на штаммы семейства Enterobacteriaceae [3]–[7]. Микроцин С ингибирует одну из аминоацил-тРНК-синтетаз, тем самым блокируя трансляцию [8]. В этой работе описаны новые кластеры генов, в которых закодирован путь биосинтеза новых микроцин-С-подобных соединений. Цели и задачи исследования

Целью данной работы было изучение функций генов, входящих в биоинформатически предсказанные mcc-подобные кластеры генов из бактерий Bacillus amyloliquefaciens DSM7, Yersinia pseudotuberculosis IP32953, Streptococcus equinus JB1.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

  1. Исследование функции продуктов генов mccBX0 и mccX1, закодированных в геномах B. amyloliquefaciens DSM7, Y. pseudotuberculosis IP 32953 и генов mccBX0, mccE2X1, закодированных в геноме S. equinus JB1.

  2. Проверка биоинформатических предсказаний функций дополнительных генов mccD, mccE1 и mccE2, входящих mcc-подобный кластер генов из Y. pseudotuberculosis IP32953.

  3. Получение микроцин-С-подобного соединения Y. pseudotuberculosis IP32953 и исследование его антибактериальной активности. Научная новизна. Теоретическая и практическая значимость работы

На примере mcc-подобных кластеров из B. amyloliquefaciens DSM7 и Y. pseudotuberculosis IP 32953 впервые было показано, что mcc-подобные кластеры генов с

геном mccBX0, продукт которого является двудоменным ферментом, кодируют путь синтеза карбоксиметилированного пептидил-цитидилата. Впервые показано, что N-концевой домен двудоменного белка MccBX0, закодированного в mcc-подобных кластерах B. amyloliquefaciens DSM7, Y. pseudotuberculosis IP32953 и S. equinus JB1, осуществляет реакцию цитидилирования пептида-предшественника. Впервые было показано, что продукты генов mccX1, присутствующих в кластерах B. amyloliquefaciens DSM7, Y. pseudotuberculosis IP 32953 и С-концевой домен продукта гена mccE2X1 S. equinus JB1 синтезируют карбокси-S-аденозилметионин (карбокси-SAM) из S-аденозилметионина (SAM) и префеновой кислоты. Было установлено, что С-концевой домен MccBX0 из организмов B. amyloliquefaciens DSM7, Y. pseudotuberculosis IP32953 и S. equinus JB1 осуществляет перенос карбоксиметильной группы с карбокси-SАМ на остаток цитозина цитидилированного пептида.

Было показано, что ферментативно созданный пептидил-цитидилат MccA из Escherichia coli и карбоксиметилированный пептидил-цитидилат MccA из E. coli функционально схожи с микроцином С из E. coli: в чувствительные клетки они проникают через клеточный транспортер YejABEF, а мишенью этих соединений является аспартил-тРНК-синтетаза (Asp-RS).

Было выделено и очищено антибактериальное соединение, закодированное в mcc-подобном кластере генов Y. pseudotuberculosis IP32953. Было показано, что оно представляет собой процессированный С-концевой 11-аминокислотный аминопропилированный карбоксиметилированный цитидилированный фрагмент пептида MccAYps и его окисленный вариант (McCYps). McCYps, как и другие короткие пептидил-нуклеотиды, попадает в клетку через транспортер YejABEF, процессируется клеточными аминопептидазами и ингибирует Asp-RS. Было показано, что N-концевой домен белка MccE2X1 из S. equinus JB1 (MccE2Seq,) и RimL из E. coli (RimLEco) обуславливают устойчивость к действию McCYps и McCEco, а продукт гена mccE2 из Y. pseudotuberculosis IP32953 (MccE2Yps) – к McCYps.

Таким образом, впервые была описана группа рибосомально-синтезированных и посттрансляционно-модифицированных цитозин-содержащих антибиотиков, а также идентифицированы белки, участвующие в уникальных биохимических реакциях. Результаты, полученные в данной работе, могут быть применены в дальнейшем для разработки нового класса пептидил-нуклеотидных антибиотиков. Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием современного оборудования и широкого спектра методов молекулярной биологии и генетики, микробиологии, биохимии. В работе были применены такие методы как: полимеразная цепная реакция, выделение и очистка плазмидной и геномной ДНК, выделение и очистка РНК, обратная транскрипция, электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле, продукция и очистка рекомбинантных белков, методы молекулярного клонирования, нокаут генов, микробиологические методы работы с бактериальными культурами, методы хроматографии и другие. Положения, выносимые на защиту

1. N-концевые домены белков MccBX0, закодированных в mcc-подобных кластерах генов из B. amyloliquefaciens DSM7, S. equinus JB1 и Y. pseudotuberculosis IP32953, являются

ЦМФ-трансферазами. Реакция цитидилирования пептидов-предшественников MccABam, MccASeq и MccAYps проходит через образование сукцинимидных производных.

  1. Продукты генов mccX1 из mcc-подобных кластеров генов из организмов B. amyloliquefaciens DSM7 и Y. pseudotuberculosis IP32953, а также С-концевой домен продукта гена mccE2X1 из mcc-подобного кластера из S. equinus JB1 являются карбокси-S-аденозилметионин синтазами. В качестве субстратов для синтеза карбокси-S-аденозилметионина MccX1Bam, MccX1Seq и MccX1Yps используют префеновую кислоту и S-аденозилметионин.

  2. C-концевые домены белков MccBX0, закодированных в mcc-подобных кластерах генов из B. amyloliquefaciens DSM7, S. equinus JB1 и Y. pseudotuberculosis IP32953, являются карбоксиметилтрансферазами. MccX0Bam, MccX0Seq и MccX0Yps катализируют реакцию переноса карбоксиметильной группы с карбокси-S-аденозилметионина на цитозин пептидил-цитидилатов.

  3. Продукты генов mccD и mccE1 из mcc-подобного кластера генов из Y. pseudotuberculosis IP32953 катализируют реакцию аминопропилирования карбоксиметилированного цитидилированного MccAYps пептида.

  4. Микроцин-С-подобное соединение, закодированное в mcc-подобном кластере из Y. pseudotuberculosis IP 32953, представляет собой 11-аминокислотный аминопропилированный карбоксиметилированный цитидилированный пептид и его окисленное по цитозину производное (McCYps). McCYps подавляет рост штаммов E. coli B и Y. pseudotuberculosis 3526.

  5. Продукт гена mccE2 из mcc-подобного кластера из Y. pseudotuberculosis IP32953 и MccE2 из S. equinus JB1 являются белками иммунности.

  6. Микроцин-С-подобные соединения, содержащие карбоксиметилированный цитидилат, ингибируют аспартил-тРНК-синтетазу E. coli. Степень достоверности и апробация результатов

По результатам диссертационной работы были опубликованы 2 статьи в рецензируемых научных журналах. Основные результаты были представлены также на 6 научных конференциях (см. перечень в разделе «Список работ, опубликованных по теме диссертации»). Личное участие автора в проведении исследований

Автором самостоятельно была выполнена бльшая часть in vivo и in vitro экспериментов, были получены плазмиды и исследуемые рекомбинантные белки, используемые в экспериментах, был осуществлен нокаут гена hns в штамме E. coli BW25113, была осуществлена пробоподготовка для масс-спектрометрического анализа, обработка и оценка полученных результатов, подготовка иллюстрационного материала. Имена соавторов, участвовавших в проведении экспериментов, указаны в соответствующих опубликованных работах. Масс-спектрометрический анализ образцов был проведен Серебряковой Мариной Васильевной (МГУ имени М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского).

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение»), выводов и двух приложений. Работа изложена на 132 страницах, содержит 32 рисунков в основной части и 8 рисунков в приложении 2, а также 2 таблицы в основной части и 2 в приложении 1. Список литературы включает 141 источник.

Созревание и экспорт микроцина С

Созревание McCEco происходит в несколько этапов при участии белков MccB, MccD и MccE. На первом этапе MccB катализирует реакцию присоединения остатка аденозинмонофосфата к формилированному пептиду MetArgThrGlyAsnAlaAsn. Реакция проходит в две стадии (рис. 3). Вначале MccB катализирует связывание С-конца пептида с -фосфатом молекулы АТФ по -карбокси положению с образованием гидролитически лабильного пептидил-CO-АМФ и пирофосфата. После этого аминогруппа аспарагина (первый с С-конца аминокислотный остаток пре-микроцина) внутримолекулярно связывается с атомом углерода, в результате чего образуется пептидил-сукцинимид и аденозинмонофосфат (АМФ). Пептидил-сукцинимид является стабильным соединением и может накапливаться как промежуточное соединение в реакции при условии слабой активности фермента, или при недостаточном количестве времени прохождения реакции. Далее происходит связывание второй молекулы АТФ с ферментом, и в результате чего происходит образование пептидил-сукцинимид-аденилата. Затем С-N связь гидролизуется, сукцинимидное кольцо раскрывается, а аминогруппа остается связанной с остатком фосфорной кислоты АМФ с одной стороны и – карбоксильным атомом пептида с другой стороны, а боковой радикал соответственно становится аспартамидом. В результате этой реакции образуется соединение MetArgThrGlyAsnAla-аспартамид-аденилат, где пептидная часть и нуклеотид соединены через N-P связь. Для прохождения реакции необходим ион Mg2+, в реакции расходуются две молекулы АТФ, а побочными продуктами реакции являются одна молекула АМФ и две молекулы пирофосфата соответственно [116]. Такой формилированный пептидил-аденилат с молекулярной массой 1119,5 Да (McC1119) может ингибировать рост бактерий, однако его активность ниже, чем у полностью модифицированного микроцина С [43, 86].

Белок MccB работает в виде гомодимера. Полипептидная цепь состоит из 351 аминокислоты. В 2009 году были разрешены и опубликованы структуры MccB в комплексе с различными лигандами. Первые N-концевые 87 аминокислот MccB участвуют в образовании домена, который называется «элемент распознавания пептида-предшественника» (RRE домен) [112]. RRE домен – это консервативный домен распознавания пептидов у многих ферментов, участвующих в биосинтезе рибосомально-синтезированных и посттрансляционно-модифицированных пептидов [21]. С-концевой фрагмент MccB гомологичен аденилирующим доменам [112] суперсемейства ThiF/HesA/MoeB/E1 [22]. Особенностью этого домена является пяти– -тяжевая укладка Россмана, которая формирует АТФ-связывающий сайт. Кроме того, -слой укладки стабилизирован участком связывания иона цинка, расположенным вблизи. В активном центре присутствует Gly-Cys-Gly-Gly-Ile-Gly нуклеотид-связывающий мотив Уолкера А, рядом с которым локализуется С-концевая часть MccA. В связывании АТФ участвуют оба протомера MccB гомодимера. Гидрофобный карман, состоящий из аминокислот одного протомера Leu121, Ile194, Ala213, Leu219, связывает аденин молекулы АТФ. Полярные остатки этого же протомера Asn154, Arg157, Gln158, Lys170 взаимодействуют с рибозой и фосфатом молекулы АТФ. А принадлежащий второму протомеру Arg94 участвует в гидролизе АТФ. В активном центре расположен ион Mg2+, который координирован тремя фосфатами АТФ и Asp214 [112]. Интересно, что у некоторых представителей ThiF/HesA/MoeB/E1 суперсемейства аспартат в активном центре является консервативным остатком и необходим для функционирования фермента, например, у бактериального фермента MoeB, участвующего в синтезе молибдоптеринового кофактора [74], и у человеческого убиквитин-активирующего фермента NEDD8 E1 [131]. Уникальной особенностью MccB является наличие тирозина в позиции 239, который взаимодействует как с молекулой АТФ, так и с С-концевой частью пептида. Tyr239 расположен с противоположной стороны MccA напротив Asp214. Таким образом, Tyr239 принимает участие в ориентировании С-конца пептида MccA по направлению к молекуле АТФ [112]. Как было отмечено выше, особенностью реакции аденилирования является использование двух молекул АТФ в одном каталитическом цикле: одну для активации MccA, вторую для аденилирования сукцинимидного производного MccA [116]. Анализ структуры фермента и анализ активности мутантов Tyr239Ala, Asp214Ala показал, что, по-видимому, и первая, и вторая реакции происходят в одном аденилирующем сайте [112].

Между 261 и 287 аминокислотами MccB располагается особый участок, называемый кроссоверной петлей. При димеризации белка N-концевой RRE домен одной полипептидной цепи взаимодействует с кроссоверной петлей другой полипептидной цепи, в результате чего образуется домен, названный «пептидные клещи». Этот домен отвечает за связывания пептида с ферментом (рис. 4). Было показано, что значительную роль в связывании субстрата играют аминокислоты Lys10 и Glu26, которые напрямую взаимодействуют с аминокислотами пептида. Аминокислотные остатки аденилирующего домена формируют карман, с которым связывается N-конец пептида: N-концевой метионин располагается в гидрофобном канале, сформированном остатками Ile243, Val245, Trp326, His333. Карбонильная группа метионина образует водородные связи с Arg322 и Gln 335. Таким образом, аденилирующий С-концевой домен и домен «пептидные клещи» образуют уникальную структуру, подобную створкам раковины пластинчатожаберных моллюсков, в борозде между которыми располагаются субстраты реакции – АТФ и пептид. Еще большее сходство с двухстворчатой раковиной придает конформационная подвижность фермента: белок может принимать «открытую» или «закрытую» конформацию, что, по-видимому, необходимо для катализа реакции [112].

Позиция в активном сайте Mg-АТФ смоделирована путем совмещения отдельных кристаллических структур комплексов МссВ с сукцинимидным производным MccA и комплекса МссВ с Mg-АТФ. Два протомера MccB изображены розовым (цепь А) и пурпурным (цепь В) цветом с обозначенными N и С-концевыми фрагментами. Пунктирными линиями обозначены соединения между последовательностями, которые не видны в электронной плотности. Части MccB, образующие аденилирующий домен и домен «пептидные клещи» подписаны соответствующим цветом каждой цепи. Цветовая кодировка атомов АТФ и сукцинимидного производного MccA: атомы азота голубые, кислорода – красные, фосфора - оранжевые углерода – серые (в случае АТФ) и желтые (в случае сукцинимидного производного MccA). Ионы Mg2+ и Zn2+ изображены бирюзовым и серым цветами соответственно. [112].

Следующий шаг в созревании микроцина С – присоединение аминопропильной группы. Эту реакцию катализируют продукты генов mccD и mccE [86]. Она проходит в два этапа: на первом этапе MccD осуществляет перенос 3-карбокси-3-аминопропил группы на кислород остатка фосфорной кислоты незрелого микроцина, в результате чего образуется вещество с молекулярной массой 1220,5 Да. В качестве донора карбоксиаминопропильной группы в этой реакции используется S-аденозилметионин (SAM) [70]. В результате этой реакции кроме продукта McCEco1119 образуется 5-метилтиоаденозин (МТА), являющийся продуктом переноса карбоксиаминопропильной группы с молекулы SAM. Для каталитического протекания реакции необходим клеточный белок Mtn (5-метилтиоаденозин/ S-аденозилгомоцистеин нуклеозидаза), также называемый Pfs, который гидролизует MTA. Далее 3-карбокси-3-аминопропилированный микроцин декарбоксилируется N-концевым доменом белка MccE с образованием зрелого микроцина с молекулярной массой 1176,5 Да (McC1176) (рис. 5) [70].

Описание mcc-подобных кластеров, кодирующих гомологи MccBЕco с дополнительным С-концевым доменом

Среди членов MccB/PaaA семейства белков были предсказаны два белка-гомолога MccBEco4, содержащих дополнительный С-концевой метилтрансферазный домен. Эти белки закодированы в геномах Y. pseudotuberculosis IP 32953 и B. amyloliquefaciens DSM7 в составе mcc-подобных кластеров генов[10]. Для удобства мы обозначили фрагмент, кодирующий С-концевой домен, как X0. mcc-подобные кластеры этих бактерий помимо генов mccA, mccBX0 и mccC также содержат ген, обозначенный нами как mccX1 (рис. 9).

Кластер из Y. pseudotuberculosis IP 32953 состоит из восьми генов и является одним из самых длинных обнаруженных на данный момент mcc-подобных кластеров. Ген mccAYps кодирует 42 аминокислотный пептид. Далее по направлению рамки считывания следует гомолог гена mccCEco. Между генами mccAYps и mccCYps находится некодирующая область, в последовательности которой присутствует участок длиной 22 нуклеотида, для которого предсказано формирование шпилечной структуры (с помощью программы OligoAnalyzer). После гена mccCYps расположен ген, кодирующий MccBX0Yps. За ним следуют два гена с неизвестной функцией, обозначенных как mccX1Yps и mccX2Yps. MccX1Yps имеет гомологию с членами суперсемейства SAМ-зависимых метилтрансфераз, а продукт гена mccX2Yps - с членами неохарактеризованного семейства YqcI/YcgG белков [10]. За ними следуют гомологи генов mccDEco и mccEEco, причем гомологи С и N-концевых доменов MccEEco кодируются двумя генами. mccE1Yps кодирует гомолог N-концевого декарбоксилазного домена (MccE1Yps), и mccE2Yps кодирует гомолог C-концевого ацетилтрансферазного домена (MccE2Yps) белка MccEEco.

Стрелками схематично изображены гены кластеров. На стрелках приведены названия соответствующих генов. Структурой в виде шпильки схематично изображены потенциальные внутренние терминаторы транскрипции. Под генами указаны идентификационные номера аннотированных продуктов этих генов из базы данных NCBI. Гомологичные гены окрашены одинаковым цветом. Исключением являются гены, окрашенные серым цветом: это гены, обозначенные как Xn. Цветовая легенда белков, кодируемых кластерами, расположена слева. Под схематично нарисованными кластерами указаны наименования организмов, в которых были обнаружены эти кластеры.

Кластер генов из генома B. amyloliquefaciens DSM7 устроен проще. В нем предсказывается всего 4 гена, причем, ген mccABam расположен не в начале, а в середине кластера. Первым геном является mccBX0Bam ген, продукт которого также обладает дополнительным метилтрансферазным доменом. Затем следует ген mccX1Bam, далее располагается ОРС, кодирующая предполагаемый пептид-предшественник MccABam размером в 19аминокислот. После гена mccABam, находится 33 нуклеотидная последовательность, для которой предсказывается формирование шпилечной структуры. Следующий за mccABam ген, кодирующий экспортный насос, гомологичный mccCEco, предположительно также является частью mcc кластера и обозначен как mccCBam. В результате нового биоинформатического поиска в геноме S. equinus JB1 нами был обнаружен mcc-подобный кластер генов. В состав этого кластера также входит удлиненный mccBX0Seq ген. Гены в этом кластере еще сильнее «перемешаны» относительно кластера Y. pseudotuberculosis IP 32953. Первым геном, как и в случае кластера B. amyloliquefaciens DSM7, является удлиненный mccBX0Seq, за ним нами предсказан ген mccASeq, который кодирует 19-аминокислотный пептид. После mccASeq, как и в других случаях, присутствует область, для которой предсказывается формирование шпилечной структуры. Далее по направлению рамки считывания расположен ген, который представляет собой два слитых гена: гомолог mccE2Yps и гомолог mccX1Yps. За ними следуют две ОРС, каждая из которых потенциально кодирует фрагмент MccCSeq белка. В процессе работы все последовательности генов были повторно секвенированы, в результате чего была обнаружена ошибка секвенирования в базе данных GenBank NCBI (рис. 10), которая привела к ошибочно возникшему стоп-кодону внутри гена mccCSeq. С учетом этой ошибки после гена mccE2X1Seq располагается только один ген – mccCSeq.

Звездочкой отмечены одинаковые позиции. Над последовательностью из GenBank указана соответствующая аминокислотная последовательность. Стоп кодон выделен красным цветом. Под последовательностью, полученной в процессе работы, указана соответствующая аминокислотная последовательность.

Кроме этих трех кластеров, которые подробнее будут рассмотрены в этой работе, подобные кластеры генов с удлиненным mccBX0 были обнаружены и в других бактериях. Геном Staphylococcus delphini штамм 14S03318-1 (номер сиквенса в базе данных NCBI-NZ_MWUP01000011.1) кодирует кластер, включающий гомологи генов mccCYps, mccE2Yps, mccBX0Yps, mccXYps1, а также ген mccA, причем гомологи генов mccCYps и mccE2Yps транскрибируются в одном направлении, а остальные – в противоположном. В геноме Mycobacterium abscessus подвид massiliense штамм 616 (номер сиквенса в базе данных NCBI-NZ_FVWZ01000001.1) и в геноме Nocardia vaccinii NBRC 15922 (номер сиквенса в базе данных NCBI-NZ_BDCC01000070.1) были обнаружены кластеры, в том числе включающие в себя гомологи генов mccX2Yps, mccCYps, mccBX0Yps, mccAYps, mccDYps, mccE1Yps и mccX1Yps. Таким образом, существует ряд филогенетически далеких бактерий, в геномах которых закодированы mcc-подобные кластеры с удлиненным геном mccBX0. В случае mcc-подобных кластеров, в состав которых входит ген mccB, кодирующий белок только с аденилилтрансферазным доменом, минимальный набор генов составляет mccABC. Среди найденных mcc-подобных кластеров с удлиненным mccBX0 минимальный составляет mccABX0CX1.

Белки MccBX0Yps и MccX1Yps осуществляют биосинтез карбоксиметилированного пептидил-цитидилата

В работе Бантыш и соавторов была показана способность нуклеотидилтрансферазы MccBYps аденилировать 42-аминокислотный пептид-предшественник MccAYps [10]. Ген mccBX0Yps эволюционно гораздо ближе к уже изученным нами mccBX0Bam и mccBX0Seq, чем к гену mccBEco. Так же как и гомологичные белки из S. equinus JB1и B. amyloliquefaciens DSM7, MccBX0Yps состоит из двух доменов, нуклеотидилтрансферазного и метилтрансферазного. Нам удалось оптимизировать условия выделения полноразмерного белка MccBX0Yps, а также его N-концевого нуклеотидилтрансферазного домена. Было показано, что MccBX0Yps полноразмерный и его N-концевой домен, так же как и белки MccBX0Bam и MccBX0Seq, могут осуществлять модификацию пептида-предшественника при участии любого из НТФ (рис. 18). Однако, в случае ГТФ интенсивность сигнала, соответствующего пептидил-гуанилату была почти на фоновом уровне, но в реакции образовывалось сукцинимидное производное MccAYps. И, как и в случае других MccBX0, в реакции субстратного конкурирования с MccBX0Yps образовывался цитидилированный пептид. Спектры фрагментации аденилированного MccAYps (MccAYps-АМФ) m/z 4985, цитидилированного MccAYps (MccAYps-ЦМФ) m/z 4961 и уридилированного MccAYps (MccAYps-УМФ) m/z 4962 приведены в Приложении 2.

Продукты реакций были проанализированы МАЛДИ масс-спектрометрически. MccBX0Yps, либо MccBYps инкубировали c пептидом MccAYps пептидом (m/z 4656) в присутствие разных НТФ («+АТФ», «+ЦТФ», «+ГТФ», «+УТФ») и смеси НТФ в эквивомолярном соотношении («+НТФ»). На масс-спектрах указана разница массы между пиком пептида (m/z 4656) и пептидил-нуклеотида. Пик m/z 4638 является промежуточным продуктом реакции - сукцинимидным производным.

Для проверки эффективности прохождения нуклеотидилтрансферазных реакций MccBX0Yps, в реакционную смесь с пептидом добавляли равное количество MccBX0Yps и наблюдали временную динамику образования продуктов реакции. Эффективность прохождения реакций уменьшалась так же как и в случае MccBX0Bam в следующем порядке: ЦТФ АТФ УТФ ГТФ.. Как видно, на рисунке 19, в реакции с ЦТФ уже после десяти минут инкубации с ферментом начинает накапливаться промежуточный продукт нуклеотидилтрансферазной реакции – сукцинимидное производное пептида-предшественника MccAYps (m/z 4638), а уже через час обнаруживается пептидил-цитидилат (m/z 4961), в то время как в случае АТФ и УТФ образование пептидил-сукцинимида происходило только через 1-2 часа, а пик, соответствующий пептидил – нуклеотиду (m/z 4985 и m/z 4962, соответственно) появлялся только спустя 14 часов прохождения реакции. При добавлении ГТФ в реакцию проходила только первая стадия реакции – наблюдалось накопление сукцинимидного производного (m/z 4638).

Для проверки предсказания функции карбокси-SAM-синтазной активности белка MccX1Yps и карбоксиметилтрансферазной функции C-концевого домена MccBX0Yps были очищены рекомбинантные белки и проведены реакции in vitro. Как показано на рисунке 20, при добавлении в реакцию пептида-предшественника MccAYps, MccX1Yps, ЦТФ, SAM, префеновой кислоты и белка MccBX0Yps наблюдали образование цитидилированного пептида с m/z 4656 и соединения с m/z 5019, соответствующего карбоксиметилированному цитидилированному MccAYps. Использование MccBYps без С-концевого метилтрансферазного домена приводило к накоплению в реакции только цитидилированного продукта. В отсутствие в реакции либо префеновой кислоты, либо SAM, но при наличии MccBX0Yps наблюдали образование только цитидилированного пептида. Спектры фрагментации для соединений с m/z 4961 и m/z 5019 приведены в Приложении 2.

Продукты реакций были проанализированы МАЛДИ масс-спектрометрически. К пептиду MccAYps были добавлены компоненты, указанные слева от спектров. Звездочкой отмечены натриевые соли пептида MccAYps и его производных. m/z 4656 соответствует сигналу пептида, m/z 4961 и m/z 5019 соответствуют цитидилированному пептиду MccAYps и его карбоксиметилированному производному соответственно.

Сравнение механизмов токсичности микроцинов С из E. coli и Y. pseudotuberculosis IP 32953

McCYps ингибировал рост штаммов E. coli B и Y. pseudotuberculosis 3526 (рис. 29). Для штамма E. coli B МИК McCYps составляет 3 мкM, что в 8 раз выше, чем МИК McCEco. Однако, в отношении штамма Y. pseudotuberculosis 3526 оба вещества имеют близкий уровень ингибирующей активности.

Ранее нами было показано, что мишенью для действия пептидил-цитидилатных антибиотиков, так же как и для пептидил-аденилатов является аспартил-тРНК-синтетаза. Клетки сверхэкспрессирующие aspS были устойчивы к действию McCYps, в то время как клетки с индуцированной сверхэкспрессией proS были так же чувствительны к McCYps как и клетки, содержащие контрольную плазмиду (рис. 30). Таким образом, клеточной мишенью McCYps, очевидно, является, так же как и в случае McCEco, аспартил-тРНК-синтетаза.

МcCEco проникает в цитоплазму Е. coli через транспортер YejABEF. McCYps имеет более длинную пептидную часть, чем McCEco. Клетки Е. coli B, в которых отсутствовал ген, кодирующий субъединицу YejB, были устойчивы к действию McCYps. Для процессинга пептидной части МсСEco и высвобождения токсичного аспартамид-аденилата необходимо присутствие в клетках Е. coli BW28357 трех аминопептидаз PepA, PepB, PepN [64]. Клетки Е. coli В с делецией трех генов рерА, pepN, рерВ были устойчивы к действию McCYps, а чувствительность к McCEco у них была снижена в несколько раз. Таким образом, мы можем утверждать, что процессинг пептидной части McCYps необходим для высвобождения токсичного компонента антибиотика. Активность McCEco в отношении клеток Е. coli B АрерА, АрерВ, ApepN можно объяснить предположительным наличием четвертой пептидазы в клетках, которая способна процессировать микроцин С и отсутствует в штамме Е. coli BW28357, так как для этого штамма было показано, что отсутствие 3-х аминопептидаз придает клеткам полную устойчивость к McCEco [64].

Полученные данные показывают, что McCYps, так же как и McCEco, синтезируется клеткой-продуцентом в виде про-антибиотика, который попадает через клеточный олигопептидный транспортер YejABEF в цитоплазму Е. coli, где подвергается процессингу с высвобождением действующего вещества, ингибирующего работу аспартил тРНК синтетазы.