Введение к работе
Актуальность проблемы. При заражении растений вирусы проникают в небольшое число первично-инфицированных клеток. Эффективность последующего транспорта инфекции в окружающие здоровые клетки является ключевым процессом, определяющим патогенность и симптоматику вирусных заболеваний, а также спектр хозяев вируса. Использование плазмодесм для транспорта инфекции, а не выход в межклеточное пространство - характерное эволюционное приобретение вирусов растений в отличие от вирусов животных и бактериофагов.
Традиционная точка зрения на проблему распространения фитовируса из клетки в клетку как на генетически пассивный процесс, происходящий без участия вирусспецифических лолипептидов, в последнее время была кардинально пересмотрена. Появились экспериментальные факты, свидетельствующие, что транспорт вирусного генетического материала является активным процессом, выполняющимся с участием кодируемых вирусом транспортных белков (ТБ) (Atabekov and Dorokhov, 1984).
Необходимость изучения механизма действия транспортных белков продиктована тем, что их функция в значительной мере определяет скорость распространения инфекции и степень поражения растения. Исследования этой проблемы в значительной степени сосредоточены на классическом объекте - тобамовирусе табачной мозаики (ВТМ). Обнаружено, что транспортный белок ВТМ размером 30 кДа способен модифицировать плазмодесмы, увеличивая их пропускную способность (Wolf et al, 1989), а также прочно связываться с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами (Citovsky et al., 1990). Предполагается, что межклеточный транспорт ВТМ осуществляется в форме вирусспецифических рибонуклеопротеиновых (РНП) комплексов, способных перемещаться по модифицированным плазмодесмам (Citovsky and Zambryski, 1991). Однако, отсутствуют экспериментальные подтверждения того, что РНП комплексы действительно предстаатают собой транспортные интермедиаты, перемещающиеся из клетки в клетку по плазмодесмам и не участвующие в репликации вируса. Остается также неизвестным механизм взаимодействия транспортных белков с компонентами плазмодесм.
Изучение транспортного белка in vitro долгое время было затруднено сложностью его выделения из тканей инфицированного растения, так как трансляция вирусной субгеномной РНК, кодирующей 30 кДа полипептид, дает in vivo очень малые количества белка и протекает в самом начале инфекционного процесса (Watanabe et al., 1984). Между тем, совершенно очевидно, что для исследования 30 кДа полипептида с помощью современных биохимических методов требуюся препаративные количества очищенного белка. Эта задача решалась в данной работе путем экспрессии в E.coli генов транспортных белков в виде гибридов с металл-связывающими пептидами.
Целью настоящей работы явилось:
1)получение бактериальных штаммов-продуцентов гибридных транспортных белков тобамовирусов, в структуре которых заложена возможность выделения и очистки их посредством металл-хелатной аффинной хроматографии;
2)разработка метода исследования комплексов транспортных белков с полноразмерными вирусными геномными РНК;
3)изучение влияния транспортных белков на трансляцию вирусных РНК;
4)поиск клеточных белков, специфически связывающихся с транспортными белками.
Научная новизна и практическая ценность работы. Получены очищенные препараты гибридных транспортных белков двух тобамовирусов: ВТМ штамма U1 и тобамовируса крестоцветных (кр-ВТМ) с N-концевыми аффинными доменами из шести остатков гистидина. Наряду с полноразмерным 30 кДа белком ВТМ U1, вьщелены два его делеционных мутанта: DEL4 и DEL10, у которых отсутствуют функционально важные участки аминокислотной последовательности.
Разработан новый метод исследования рибонуклеопротеиновых (РНП) и белок-белковых комплексов, основанный на нековалентной иммобилизации полипептида-мишени на металл-хелатном сорбенте. С помощью этого метода впервые показано, что транспортные белки ВТМ Ш и кр-ВТМ образуют устойчивые комплексы с полноразмерными вирусными геномными РНК.
Впервые установлено, что транспортные белки тобамовирусов эффективно подавляют трансляцию РНК in vitro, что показывает возможность существования внутри инфицированной клетки пула молекул вирусных РНК, участвующих в перемещении по плазмодесмам и полностью исключенных из репликации.
В настоящей работе обнаружены полипептиды клеточных стенок, способные связываться с транспортными белками тобамовирусов. Возможно, что обнаруженные полипептиды являются компонентами рецептора, взаимодействующего с вирусными транспортными белками.
Результаты данной работы позволяют глубже понять механизм межклеточного транспорта вирусной инфекции. Возможность с помощью методов молекулярной биологии повлиять на выражение функции транспорта имеет большое прикладное значение, так как фитопатогенные вирусы наносят серьезный экономический ущерб сельскому хозяйству. Обнаружение тесной взаимосвязи между транспортом инфекции и некоторыми видами устойчивости к фитопатогенным вирусам (Meshi et al., 1989; Calder and Palukaitis, 1992; Weber et al., 1993) открывает перспективы разработки новых подходов к получению вирусоустойчивых растений.
Апробадия работы. Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-
химической биологии им. А.Н.Белозерского 21 апреля 1997 года. Результаты работы докладывались на международных конференциях: "Fundamental and applied problems in phytovirology", Ялта, Украина, 1994; "Russian-german workshop on plant biotechnology", Гатерслебен, Германия, 1994; "Xth international congress of virology", Иерусалим, Израиль 1996; "16th annual meeting of american society for virology", Боземан, США, 1997.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7
печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из глав "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы". Работа изложена на 96 страницах, содержит 29 рисунков и 2 таблицы.