Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
1.1. Актуальность темы исследования 6
1.2. Степень разработанности темы исследования 7
1.3. Цель и задачи исследования 8
1.4. Научная новизна 8
1.5. Теоретическая и практическая значимость работы 9
1.6. Методология и методы исследования 9
1.7. Положения, выносимые на защиту 9
1.8. Степень достоверности и апробация результатов 10
2. Обзор литературы 12
2.1. Структурно-функциональная организация мрнк и механизмы регуляции экспрессии генов эукариот 12
2.1.1. Использование альтернативных промоторов 12
2.1.2. Роль 5 -НТО в регуляции трансляции
2.1.2.1. Вторичная структура 5 -НТО 75
2.1.2.2. IRES элементы 16
2.1.2.3. AUG кодоны в 5 -НТО (upstream AUG, uAUG) 18
2.1.2.4. uORFs (короткие открытые рамки считывания в 5 -НТО) 18
2.1.2.5. Терминальные олигопиримидиновые тракты 20
2.1.2.6. Взаимодействия РНК-белок 21
2.1.3. Альтернативный сплайсинг 22
2.1.4. Альтернативное полиаденилирование (АПА) 26
2.1.5. Роль 3 -НТО транскриптов в регуляции экспрессии генов
2.1.5.1. Цис-действующие регуляторные элементы в мРНК. 29
2.1.5.2. Контроль трансляции с использованием длины поли(А) последовательности 31
2.1.5.3 Роль З -НТО в локализации транскриптов 32
2.1.6. Нонсенс-опосредованная деградация мРНК
2.2. Ген SGMS1 человека 40
2.2.1. Структурная организация гена SGMS1 40
2.2.2. Белок SMS1 и катализируемая им реакция 43
2.2.3. Функции SMS1 в клетке 45
2.2.4. Влияние нарушения функционирования SMS1 на развитие болезней 51
3. Материалы и методы 56
3.1. Биоинформатические методы анализа 56
3.1.1. Конструирование гипотетических альтернативных транскриптов 56
3.1.2. Поиск и анализ гипотетических промоторных областей 56
3.1.3. Анализ структуры транскриптов 57
3.1.4. Поиск открытых рамок считывания и анализ гипотетических белковых продуктов 57
3.2. Выделение тотальной рнк из тканей человека 57
3.2.1. Выделение тотальной РНК 57
3.2.2. Обработка препаратов РНК ДНКазой I 3.2.3 Измерение концентрации РНК 59
3.2.4 Электрофоретическое разделение тотальной РНК 59
3.3 ОТ-ПЦР 60
3.3.1 Синтез одноцепочеченой кДНК 60
3.3.2 Полимеразная цепная реакция 60
3.3.3 Фракционирование продуктов ОТ-ПЦР в ПААГ 61
3.3.4 Фракционирование продуктов ОТ-ПЦР в агарозном геле 64
3.3.5 Оценка относительного содержания транскриптов с использованием ОТ-ПЦР 64
3.3.6 Обработка ДНК фага рестрицирующей эндонуклеазой Pst I 65
3.4. Секвенирование продуктов ОТ-ПЦР 65
3.4.1 Элюция продуктов ОТ-ПЦР из агарозного геля 65
3.4.2 Автоматическое секвенирование
3.5 Амплификация концов КДНК 66
3.6 ПЦР в реальном времени
3.6.1 Полимеразная цепная реакция 68
3.6.2 Статистический анализ данных ПЦР в реальном времени 68
3.7. Клонирование последовательностей КДНК 70
3.7.1 Получение компетентных клеток 70
3.7.2 Клонирование последовательностей кДНК в вектор pUC19 71
3.7.3 Конструирование рекомбинантной плазмиды pUC19 с участками кДНК, соответствующей ОРС транскриптов гена SGMS1 71
3.7.4 Трансформация клеток E.coli полученной рекомбинантной плазмидой на основе pUC 19 73
3.7.5 Конструирование рекомбинантной плазмиды pEGFP-С2 с участками кДНК, соответствующей ОРС транскриптов гена SGMS1 73
3.7.6 Трансформация клеток E.coli полученной рекомбинантной плазмидой на основе pEGFP-C2 75
3.8. Трансфекция и электропорация клеток hela и vero 76
3.8.1 Культивирование клеток 76
3.8.2 Липосомная трансфекция клеток HeLa и Vero 76
3.8.3 Электропорация клеток HeLa 76
3.9. Электрофорез белков в ПААГ 77
3.10. Вестерн-блоттинг и иммунофлуоресцентное окрашивание белков 78
3.11. Фиксация клеток vero на стеклах и иммунофлуоресцентное окрашивание белков 79
3.12. Микроскопия 80
3.13. Выделение РНК из клеток HeLa, ОТ-ПЦР 80
4. Результаты 81
4.1. In silico конструирование гипотетических альтернативных транскриптов гена sgms1 и определение их экзонной структуры 81
4.2. Выявление предсказанных транскриптов в тканях человека и установление их первичной структуры
4.3. Определение первичной структуры 5 - и з -концов альтернативных транскриптов 92
4.4. Особенности структурной организации 5 - и 3 - нто альтернативных транскриптов гена SGMS1 93
4.4.1. 5 - НТО альтернативных транскриптов 93
4.4.2. 3 - НТО транскриптов альтернативных транскриптов 94
4.5. Анализ гипотетических белковых продуктов, кодируемых альтернативными транскриптами 96
4.6. Определение внутриклеточной локализации белков, кодируемых транскриптами гена sgms1 98
4.7. Поиски и характеристика гипотетических промоторных областей гена sgms1 101
4.8. Особенности экспрессии гена sgms1 в разных тканях человека 103
4.9. Анализ экспрессии гена sgms1 в опухолях легкого и пищевода 1 4.9.1. Экспрессия гена SGMS1 в нормальных тканях легкого и пищевода 108
4.9.2. Снижение экспрессии гена SGMS1 в опухоли легкого 108
4.9.3. Разнонаправленное изменение содержания транскриптов гена SGMS1 в опухоли пищевода ПО
5. Обсуждение результатов 112
6. Заключение 127
7. Выводы 129
8. Список основных сокращений 130
9. Список литературы
- Цель и задачи исследования
- Роль 3 -НТО транскриптов в регуляции экспрессии генов
- Поиск открытых рамок считывания и анализ гипотетических белковых продуктов
- Трансформация клеток E.coli полученной рекомбинантной плазмидой на основе pEGFP-C2
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Современные методы секвенирования и биоинформатического анализа позволили достичь значительного прогресса в исследовании генома и транскриптома человека. Накопленная информация имеет огромное значение для изучения структурной организации генов, что чрезвычайно важно для понимания особенностей их функционирования в норме и при патологии. Наиболее актуальным, представляющим большой интерес для научного познания, является исследование генов, играющих важную роль в обеспечении жизнедеятельности организма.
В клетках большинства эукариотических организмов значительную роль
играет фермент сфингомиелинсинтаза 1 (SMS1). Функционирование данного
фермента необходимо для жизни и роста клеток. Фермент обеспечивает синтез
сфингомиелина (СМ) и диацилглицерина (ДАГ) из церамида и
фосфатидилхолина (Ullman et al. 1974; Voelker et al. 1982; Marggraf et al. 1984). Также SMS1 может катализировать обратную реакцию (Marggraf et al. 1984; van Helvoort et al. 1994). Таким образом, активность фермента необходима для синтеза СМ, являющегося компонентом клеточных мембран, а также для регулирования баланса гибели и выживания клеток в результате регуляции синтеза анти-апоптотического медиатора ДАГ и про-апоптотического медиатора церамида.
Показано, что SMS1 участвует в регуляции многих жизненно важных
процессов: в регуляции везикулярного транспорта белковых молекул, в
клеточной пролиферации, апоптозе, метаболизме холестерина, некоторых
аполипопротеинов (Barcel-Coblijn et al. 2011; Shakor et al. 2011; Subathra et al.
2011; Yan et al. 2011). Многообразие и сложность биологических процессов,
опосредованных SMS1, предполагает высокую степень специфичности
контроля экспрессии соответствующего гена в отдельных клетках и тканях
организма. Исследование особенностей функционирования гена SGMS1 и, в
частности, структурной организации его транскриптов, является актуальным и
фундаментально значимым для понимания механизмов регуляции важных
физиологических процессов клетки. Нарушение систем регуляции активности
данного гена будет неизбежно приводить к патологическим процессам. В
настоящее время показана существенная роль изменения уровня
сфингомиелина в развитии атеросклероза (Park et al. 2004; Dong et al. 2006; Li et al. 2012) и опухолей ряда тканей (Van Blitterswijk et al. 1982; Merchant et al. 1991; Van der Luit et al. 2007). Изучение основ регуляции функционирования
гена SGMS1 необходимо для понимания молекулярных механизмов данных патологических процессов.
Степень разработанности темы исследования
Белок SMS1 имеет высокую степень сходства у разных организмов (степень гомологии молекул данного белка у млекопитающих не менее 96%) (Guillen et al. 2007). Структурная организация гена SGMS1 человека, кодирующего SMS1, была определена еще до выявления аминокислотной последовательности самого белка. Ранее в нашей лаборатории был идентифицирован ген MOB (номенклатурное название ТМЕМ23), включающий последовательность из клонотеки кДНК продолговатого мозга (medulla oblongata) человека. Ген МОВ протяженностью 320 т.п.н., локализованный на 10 хромосоме человека в области 10q11.2, кодировал гипотетический белок, последовательность которого включала 413 аминокислот и полностью совпала с аминокислотной последовательностью идентифицированного позже фермента сфингомиелинсинтазы 1 (SMS1) (Дергунова и др., 2003; Vladychenskaya et al., 2002, 2004). Таким образом, ген МОВ фактически являлся геном SGMS1, кодирующим фермент SMS1.
Особенности функционирования гена, кодирующего фермент SMS1, были исследованы у мыши, свиньи и курицы (Guillen et al. 2007, Man et al. 2011, Yang et al. 2005). Было выявлено, что транскрипт, кодирующий белок SMS1, экспрессируется во всех исследованных тканях животных, при этом его уровень варьирует между органами. Анализ кДНК гена Sgms1 мыши показал, что данный ген участвует в синтезе четырех различных мРНК. Были определены структура и последовательность этих мРНК, их экспрессия в разных тканях. По данным исследователей, транскрипты гена Sgms1 могут обеспечивать синтез трех гипотетических белков (Yang et al. 2005). Данная работа явилась продолжением исследования особенностей функционирования гена SGMS1 человека.
Цель и задачи исследования
Целью исследования явилось выявление особенностей структурно-функциональной организации гена SGMS1 человека. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести биоинформатический поиск последовательностей, высоко
гомологичных последовательности гена SGMS1, в базах данных
экспрессирующихся последовательностей GenBank;
2. Определить нуклеотидную последовательность альтернативных
транскриптов гена SGMS1, уточнить структурную организацию данного гена;
3. Оценить уровень экспрессии выявленных альтернативных
транскриптов гена SGMS1 в разных тканях человека;
4. Провести поиск возможных промоторных областей гена SGMS1;
5. Провести клонирование кодирующих областей обнаруженных
альтернативных транскриптов гена SGMS1 в эукариотический вектор pEGFP-
С2, определить клеточную локализацию белков, кодируемых альтернативными
транскриптами гена;
6. Выявить особенности экспрессии гена SGMS1 в опухолях пищевода и
легкого человека.
Научная новизна исследования
В данной диссертационной работе впервые показано наличие множества альтернативных транскриптов гена SGMS1 человека, описана их структурная организация. Предложены механизмы синтеза выявленных транскриптов и выдвинута гипотеза об их функции в клетке. Определен уровень представленности альтернативных транскриптов в разных тканях человека. Оценен уровень экспрессии транскриптов гена SGMS1 в опухолях различного тканевого генеза. В клеточной системе Vero впервые определена внутриклеточная локализация белкового продукта уменьшенного размера, кодируемого укороченными с 3'-конца транскриптами гена SGMS1.
Теоретическая и практическая значимость работы
Информация о существовании альтернативных транскриптов, об их структуре, представленности, а также о локализации кодируемых ими белков могут быть необходимы для дальнейшего исследования функционирования гена SGMS1 человека в норме и при патологии. Данные об организации альтернативных транскриптов позволяют предположить механизм регуляции активности гена SGMS1. Оценка уровня экспрессии гена SGMS1 в опухолях может быть полезна для установления механизма развития данных опухолей, их диагностики.
Положения, выносимые на защиту
1. Ген SGMS1 человека состоит не менее чем из 24 экзонов и обеспечивает синтез 16 альтернативных транскриптов. В их число входят изоформы мРНК,
отличающиеся участком 5'-НТО и кодирующие полноразмерный белок, а также
транскрипты, возникающие в результате альтернативной комбинации экзонов,
затрагивающих кодирующую область гена и 3'- НТО.
2. Ген SGMS1 экспрессируется в разных тканях человека. Альтернативные
транскрипты гена в тканях человека представлены на разном уровне; наиболее
представлены транскрипты, кодирующие полноразмерный белок SMS1.
3.В синтезе транскриптов гена SGMS1 участвуют альтернативные промоторы.
Во всех исследованных тканях человека наиболее представлены транскрипты,
синтез которых происходит под контролем дистального промотора,
включающего экзон 1. Транскрипты, синтез которых обеспечивают
промоторы, локализованные в интронах гена, представлены на низком уровне.
-
В синтезе транскриптов гена SGMS1, укороченных с 3'-конца, участвуют механизмы тканеспецифического интронного полиаденилирования.
-
В клетках Vero белок, полученный в результате клонирования кодирующей области транскриптов гена SGMS1, укороченных с 3'-конца, и последующей трансформации рекомбинантных векторов, локализуется, как и полноразмерный белок, в аппарате Гольджи.
6. В опухолях различного тканевого генеза транскрипты гена SGMS1
экспрессируются на разных уровнях.
Степень достоверности и апробация результатов
Результаты работы были представлены на ежегодных научных конференциях ИМГ РАН (2009-2014), а также на 4-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), на европейской конференции по генетике человека (Вена. Австрия, 2009), на 59-ом ежегодном съезде Американского Общества Генетики Человека (Гонолулу, Гавайи, 2009), на 4-ой международной конференции молодых ученых “Molecular Biology: advances and perspectives” (Киев, Украина, 2011) и 5-ой Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома», (Звенигород, Россия, 2012). Диссертационная работа была представлена на заседании Ученого совета ИМГ РАН 18 июня 2015г., протокол №7.
Публикации
По результатам работы опубликовано 9 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 5 материалов симпозиумов и конференций.
Структура и объем диссертации
Цель и задачи исследования
Использование альтернативных промоторов Более половины генов человека содержат больше одного промотора. Альтернативные промоторы обеспечивают разнообразие транскриптов в клетке. Для многих генов показано отсутствие взаимосвязи количества транскриптов, синтезируемых с альтернативных промоторов одного гена. Это указывает на различную регуляцию их активности в пределах одной ткани и различие функций данных транскриптов [21]. Для альтернативных промоторов некоторых генов было показано, что различия в их активности обусловлены наличием в данных промоторах сайтов связывания разных активаторов и репрессоров, а также различной степенью метилирования [21-26]. Содержание транскриптов, синтезируемых с альтернативных промоторов, различается в разных тканях, что указывает на высокий уровень контроля регуляции активности данных промоторов [21, 27].
Таким образом, обеспечивая синтез определенных изоформ мРНК в нужное время в нужном месте, альтернативные промоторы обеспечивают тонкую регуляцию уровня экспрессии содержащих их генов на уровне транскрипции [22, 28] 60-80% генов млекопитающих с альтернативными промоторами обеспечивают синтез транскриптов с одинаковыми открытыми рамками считывания (ОРС) [29]. Однако данные транскрипты отличаются 5 -НТО, что влияет на экспрессию гена на уровне трансляции [28]. Известно, что переключение активности одного промотора на другой может приводить к многократному изменению концентрации белка в клетке. Наличие альтернативные промоторов млекопитающих, обеспечивающих синтез транскриптов с ОРС различной длины, приводит к появлению белков укороченных с N-конца, или наоборот, содержащих дополнительные домены на N-конце. Подчас эти субформы белка имеют противоположные функции. В некоторых случаях альтернативные промоторы обеспечивают синтез белков с различной аминокислотной последовательностью. Использование данных альтернативных промоторов повышает разнообразие белков [22].
Доля альтернативных промоторов среди генов мыши и человека, участвующих в регуляции транскрипции и развития организма непропорциональна велика. Большая часть этих транскриптов синтезируется в основном на ранних стадиях развития [22].
Как уже упоминалось, использование различных промоторов часто приводит к появлению транскриптов с различными 5 -НТО. 5 -НТО содержит различные регуляторные элементы и играет основную роль в контроле инициации трансляции [30]. Именно инициация является этапом трансляции, лимитирующим ее скорость [31].
Процесс продвижения малой субъединицы рибосомы вдоль 5 -НТО транскрипта с целью поиска инициаторного кодона называется сканированием [32]. Сканирование начинается со связывания инициаторного комплекса, состоящего из факторов инициации, со структурой кэпа. Далее происходит присоединение 40 S субъединицы к кэпу. Малая субъединица сканирует 5 -НТО до первого AUG кодона, после чего сразу к нему присоединяется 60S субъединица рибосомы для формирования 80S рибосомы. Освобождаются факторы иициации и формируется первая пептидная связь [32, 33].
Кэп-зависимая модель сканирования объясняет инициацию трансляции большинства эукариотических мРНК. Длинные 5 -НТО, содержащие вторичные структуры, формируемые парами оснований C-G, A-U и G-U, uAUGs (upstream AUG, AUG кодоны в 5 -НТО) и uORF (upstream open reading frames, короткие открытые рамки считывания в 5 -НТО) ингибируют сканирование рибосомами и таким образом снижают эффективность трансляции мРНК [34].
В целом, 5 -НТО генов с низким выходом белка обычно длиннее (длина более 100 нуклеотидов в 95% случаев), более богаты GC-основаниями и содержат стабильные вторичные структуры со свободной энергией ниже 50 ккал/моль (более чем в 90% случаев), uORF (в 32%) и uAUG (в 42% случаев) [35]. Большое количество данных мРНК кодирует белки транскрипционных факторов, протоонкогенов, ростовых факторов, их рецепторов и другие регуляторные белки. Напротив, 5 -НТО траенскриптов с эффективной трансляцией, являются короткими (средняя длина 73 нуклеотида), характеризуются низким содержанием GC-оснований, являются относительно неструктурированными (практически не содержат стабильные вторичные структуры) и редко содержат uAUG кодоны (частота встречаемости ниже в три раза). Эти мРНК составляют 90% клеточных мРНК и кодируют такие белки как миозин, актин и тубулин [35]. Существуют гены позвоночных, транскрибирующиеся в некоторых тканях с промоторов, обеспечивающих синтез транскриптов, 5 -НТО которых содержит большое число uAUG кодонов, что снижает их трансляцию в этих тканях. В тканях, которые являются основным местом экспрессии этих генов, другие промоторы продуцируют мРНК, 5 -НТО которых не столь “загружена” uAUG кодонами. Примером может служить отличный уровень мРНК гена препроэнкефалина крысы в семенниках по сравнению с мозгом. У некоторых генов в ответ на прохождение определенных этапов развития организма (например, созревание Т клеток) или воздействие стимулов окружающей среды (эндотоксин) происходит переключение на синтез транскриптов с более короткими, более эффективными лидерными последовательностями. В основе этого явления может быть как переход на транскрипцию с другого промотора, так и на другой тип альтернативного сплайсинга [36]. Так, арсенит в клетках гепатомы человека HepG2 индуцирует образование в основном мРНК гена hTRB3 (human tribbles homolog 3) с укороченным вариантом 5 -НТО, который имеет более высокую эффективность трансляции благодаря отсутствию ингибиторной uORF. Это обеспечивает повышение синтеза белка hTRB3 в условиях стресса [37].
Роль 3 -НТО транскриптов в регуляции экспрессии генов
кДНК синтезировали на матрице суммарной РНК, обработанной ДНКазой I, с использованием набора реактивов «RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit» («Fermentas», Литва). 5 мкг РНК в спиртовой взвеси осаждали центрифугированием, промывали 75% спиртом и растворяли в 12 мкл воды, обработанной 0.1% DEPC. К раствору РНК добавляли 0.5 мкг 6-нуклеотидного праймера (random hexamer primer), инкубировали при 650С в течение 5 мин. Затем к смеси добавляли коммерческий буфер для обратной транскрипции, дезоксирибонуклеотиды (dNTP) до 1 мМ каждого и 20 ед. ингибиторов РНКаз. Смесь перемешивали и инкубировали при 370С в течение 5 мин, добавляли 200 ед. обратной транскриптазы M-MuLV и инкубировали при 420С в течение 1 ч. Реакцию останавливали инкубацией при 700С в течение 10 мин и последующим охлаждением на льду. Препараты кДНК хранили при -200С.
Препараты кДНК опухолевых образцов были любезно предоставлены старшим научным сотрудником ИБХ РАН Зиновьевой М.В.
ОТ-ПЦР, используя кДНК, синтезированную на матрице мРНК, полученной из мозжечка, лобной коры, гиппокампа, таламуса, печени, семенников, почки, лимфатического узла и селезенки. Олигонуклеотидные праймеры были подобраны с использованием программы «OLIGO» и синтезированы фирмой «Синтол» (Россия). Нуклеотидные последовательности использованных праймеров приведены в табл. 1. Реакции проводились в амплификаторе «Терцик МС2» («ДНК технология», Россия). ПЦР проводилась в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл продукта реакции обратной транскрипции, 10 мкл 2,5хкратного буфера, по 5 пкм прямого и обратного праймеров и 1,25 единицы Taq ДНК полимеразы («Синтол», Россия). Амплификацию проводили в следующем режиме: начальная денатурация (950C – 5мин), 30 циклов «денатурация-отжиг-элонгация» (950С – 1 мин., 650С – 1 мин., 720С – 1 мин), и этап конечной элонгации (720С – 10 мин.). Для каждой ткани содержание транскриптов оценивалось в результате трех повторов ПЦР с последующим анализом продуктов на полиакриламидном геле (ПААГ).
Для детекции транскриптов гена GAPDH, который использовали в качестве контроля, проводили 25 циклов «денатурация-отжиг-элонгация» при тех же условиях. При данном числе циклов наблюдается экспоненциальный рост количества продукта ПЦР для гена GAPDH. Чтобы определить условия, при которых выход продуктов амплификации гена GAPDH находится в пределах фазы экспоненциального роста, аликвоты ПЦР-продуктов фракционировали с использованием электрофореза в 1ТАЕ в 1.5%-ном агарозном геле с добавлением бромиcтого этидия. Количество наработанного ПЦР-продукта определялось при помощи программы ImageQuantTM Tools («Amersham Biosciences», США). 10трис-боратный буфер (TBB) (1 литр): 108 г трис, 55 г борной кислоты, 4 мл 0.5 М ЭДТА. Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров, соответствующих транскриптам гена SGMS1. Название праймера совпадает с названием экзона, на котором отжигается данный праймер. F и R перед названием праймера указывают на его направление: прямой и обратный соответственно. Подстрочные цифры после названия прамера указывают на номер праймера к данному экзону.
Электрофоретическое разделение продуктов ОТ-ПЦР проводили в вертикальной пластине 8%-ного неденатурирующего полиакриламидного геля. Гель готовили из стокового раствора 40%-ного акриламида и 10ТВВ, заливали блок-форму (1001500.7мм3). После полимеризации гель подвергали преэлектрофорезу (600 В, 15 мин). Далее на гель наносили по 10 мкл каждой амплификационной смеси, смешанной с буфером для нанесения (1:5). В качестве маркеров использовали фрагменты ДНК фага , рестрицированную эндонуклеазой PstI, и/или коммерческий маркер ДНК FastRulerTM Low Range DNA Ladder («Fermentas», Литва). Электрофорез проводили в 1ТВВ при 600 В до момента достижения фронотом бромфенолового синего нижнего конца геля. После электрофореза гель снимали со стекол и окрашивали серебром [144]. Для этого гель последовательно обрабатывали 1%-ной азотной кислотой и раствором серебра по 8 мин. Далее гель помещали в проявитель до появления хорошо различимым полос ДНК. Окрашенные гели сканировали.
Поиск открытых рамок считывания и анализ гипотетических белковых продуктов
Для определения локализации гипотетических белков SMS 1_2а, SMS 1_3 и белка SMS1 в клетках было проведено клонирование амплификатов кДНК, содержащих открытые рамки считывания транскриптов SMS1_2а, SMS1_3а, SMS1_1а в эукариотический вектор pEGFP-C2. Этот вектор обеспечивает синтез химерного белка с GFP на N-конце. Полученными рекомбинантными плазмидами были трансфецированы клетки HeLa и Vero. Иммуноблот лизата клеток HeLa, окрашенный антителами к GFP, использовали для подтверждения наработки в клетках химерных белков GFP-SMS1, GFP-SMS1_2а, GFP-SMS1_3. В качестве контроля использовали лизат нетрансфецированных клеток HeLa. Иммуноблот лизата клеток HeLa, трансфецированных плазмидой pEGFP-C2-SMS1 и плазмидой pEGFP-C2-SMS1_3, выявил наличие химерных белков GFP-SMS1 и GFP-SMS1_3 соответственно (рис. 11). В клетках HeLa, трансфецированных плазмидой pEGFP-C2-SMS1_2а, синтез белка GFP-SMS1_2а выявлен не был. Микроскопия клеток Vero, трансфецированных этой же плазмидой, также не выявила накопления белка GFP- SMS1_2а. Чтобы устранить возможный негативный эффект наличия последовательности белка GFP на N-конце химерного белка GFP- SMS1_2а на синтез данного белка в клетке, было проведено клонирование амплификатов кДНК, содержащих открытые рамки считывания транскрипта SMS1_2а, в эукариотический вектор pEGFP- N2. Данный вектор предусматривал наработку белка SMS1_2а, слитого с GFP на С-конце молекулы. Полученными рекомбинантными плазмидами были трансфецированы клетки HeLa и Verо.
Кроме того, эти же конструкции были электропорированы в клетки HeLa. Вестерн-блоттинг лизата данных клеток HeLa снова не подтвердил синтез химерного белка SMS1_2а-GFP, как и микроскопия соответствующих клеток Vero. Так как нам не удалось наблюдать синтез химерных белков GFP-SMS1_2а и SMS1_2а-GFP в клетках Vero и HeLa, трансфецированных или электропорированных плазмидами pEGFP-C2-SMS1_2а и pEGFP-N 2-SMS1_2а, мы применили метод ОТ_ПЦР для выявления в них соответствующих транскриптов. Препараты кДНК, полученные путем обратной траскрипции тотальной РНК, выделенной из клеток HeLa, электропорированных рекомбинантными плазмидам pEGFP-C2-SMS1_2а и pEGFP- N2-SMS1_2а, использовали в качестве матрицы при ОТ-ПЦР. В присутствии праймеров, специфичных последовательности гена GFP и экзонам 8 и 9 гена SMS1, был детектирован синтез транскрипта GFP-SMS1_2а (Рис. 12), тогда как продукт ПЦР, соответствующий транскрипту SMS1_2а-GFP, мы не обнаружили (данные не представлены).
Для локализации химерных белков клетки Vero, трансфецированные рекомбинантными векторами pEGFP-C2-SMS1_1а и pEGFP-C2-SMS1_3а, фиксировали и окрашивали антителами к Маннозидазе II, которая является маркером аппарат Гольджи. Как видно на рис. 13, EGFP-SMS1_3 и EGFP-SMS1_1а локализуются преимущественно в комплексе Гольджи. На рис. 13 приведено также распределение самого белка EGFP в клетках, трансфецированных плазмидой pEGFP-C2 без вставки: в отличие от химерных белков EGFP распределяется в ядре и цитоплазме клеток относительно равномерно. Рисунок 11. Иммуноблот лизата клеток HeLa, окрашенный антителами к ЕGFP.
Локализация белков EGFP-SMSl_la и SMS1_3 в комплексе Гольджи. Красный цвет показывает окрашивание аппарата Гольджи антителами к маннозидазе–II. Флуоресценция от белка EGFP (зеленый цвет) выявляет локализацию самого белка GFP, а также слитых с ним белков SMS1_1a и SMS1_3. Наложение показывает, что EGFP-SMS1_1a и EGFP-SMS13 локализуются в аппарате Гольджи, тогда как EGFP диффузно распределен в цитозоле и ядре. Отрезок на рисунке соответствует 10 мкм.
Трансформация клеток E.coli полученной рекомбинантной плазмидой на основе pEGFP-C2
К числу обнаруженных нами альтернативных транскриптов гена SMS1 относятся полноразмерные мРНК SMSlJd- SMSl_3g, в последовательность которых включены новые экзоны 7а1, 7а2, 7b, сохранившиеся участки интрона VII. Данные транскрипты были выявлены на очень низком уровне. Суммарное количество транскриптов этой группы относительно суммарного количества полноразмерных мРНК составляет менее 5% во всех исследованных тканях. 5 - и 3 - концы транскриптов этой группы совпадают с соответствующими концами транскрипта SMSlla. В последовательности этих транскриптов присутствует экзон 7b, имеющий высокое сходство с экзоном 11 гена SMS1 мыши [20]. Подобно мышиному транскрипту SMSly обнаруженные нами транскрипты SMSlJd- SMSlJg имеют преждевременный терминирующий кодон (premature terminator codon, PTC), появляющийся в результате интеркаляции участков интрона VII в последовательность мРНК. Компьютерный поиск открытой рамки считывания показал, что в отличие от белка SMS13 гипотетические белки, кодируемые транскриптами SMSlJd- SMSlJg, имеют дополнительные C-концевые аминокислотные последовательности длиной от 6 до 33 аминокислотных остатков. Возможно, данные транскрипты участвуют в синтезе белковых молекул, укороченных с С-конца. Однако известно, что не все мРНК, имеющие преждевременный терминирующий кодон, участвуют в трансляции [176-178]. Описан механизм, с помощью которого осуществляется распад мРНК, имеющих PTC. Согласно механизму нонсенс-опосредованной деградации мРНК (NMD), транскрипты, содержащие PTC на расстоянии более 50-55 н. от последней экзон-интронной границы, могут подвергаться деградации и не участвовать в трансляции [179-181]. Транскрипты SMSlJd- SMSlJg содержат стоп-кодон на расстоянии более
120 н. от последней экзон-интронной границы. Нельзя исключить, что за счет механизма NMD происходит деградация транскриптов из этой группы, и они не участвуют в трансляции. Появление в результате альтернативного сплайсинга транскриптов, кодирующих укороченный белок или же подвергающихся деградации, в любом случае приведет к снижению уровня транскриптов гена, отвечающих за полноразмерный продукт. В настоящее время достоверно показано, что взаимодействие альтернативного сплайсинга и NMD позволяет клеткам регулировать количество функционально активных транскриптов [182, 183] Можно предположить, что в регуляции экспрессии гена SGMS1 также участвует взаимодействие этих механизмов, а низкий уровень транскриптов данного гена, включающих экзоны 7а1, 7а2, 7b, возможно, обусловлен именно их деградацией за счет NMD.
Мы выявили также транскрипты SMS1_2a и SMS1_2b, общей чертой которых является отсутствие экзона 7. Поиск аналогичных транскриптов у других организмов в базе данных EST GenBank выявил только одну последовательность EH206797, соответствующая клону кДНК Bos taurus (Bos taurus cDNA clone), которая имела сходство 85% с AY364088, представляющей в GenBank мРНК SMS1_2a (Mob1) человека и не содержала участка, соответствующего экзону 7 человека. Трансляция транскриптов SMS1_2a и SMS1_2b может приводить к синтезу белков, укороченных с N-конца. У этих белков, как и у полноразмерного белка, имеется реакционный центр, располагающийся в трансмембранных доменах 4 и 6. Можно предположить, что эти белки обладают сфингомиелинсинтазной активностью. Однако клонирование участков гена, соответствующих открытой рамке считывания одного из этих транскриптов (SMS1_2a) в плазмиды pEGFP-C2 и pEGFP-N2 и последующая трансфекция полученными плазмидами клеток HeLa и Vero, а также электропорация клеток HeLa не выявили синтеза гипотетического белка SMS1_2a. Обнаружение в клетках HeLa после электропорации химерных транскриптов pEGFP-C2-SMS1_2a свидетельствовало о прохождении трансфекции. Однако мы не смогли обнаружить химерный белок в этих клетках, возможно, из-за дефектов трансляции рекомбинантной плазмиды или быстрой деградации вновь синтезированных дефектных молекул белка с помощью механизма контроля качества белков в эндоплазматическом ретикулуме, описанном в работе [184]. Мы не исключаем также возможности, что токсичность химерного белка могла убить трансфецированные клетки.
Низкое содержание этих транскриптов в исследованных тканях (не более 1,5 % от уровня соответствующих полноразмерных транскриптов) дает основание предположить, что они возникают в результате ошибок сплайсинга. Однако детекция транскрипта SMS1_2b в данном исследовании, а также детекция транскрипта SMS1_2a в работе [16] во всех исследованных тканях позволяет предположить, что появление таких транскриптов не является простой ошибкой сплайсинга. Альтернативный сплайсинг может регулировать экспрессию генов путем синтеза непродуктивных мРНК-мишеней, предназначенных для деградации [48]. Возможно, к таким мишеням относятся транскрипты SMS1_2a и SMS1_2b, утратившие экзон 7. Отсутствие соответствующих белковых продуктов в клетках, трансфецированных плазмидами pEGFP-C2–SMS1_2а и pEGFP-N2–SMS1_2а может служить непрямым доказательством быстрой деградации таких транскриптов. Возможно, это является частью пост-транскрипционной регуляции экспрессии гена SGMS1, когда альтернативный сплайсинг приводит к появлению делеционных вариантов транскриптов и, таким образом, приводит к снижению уровня транскриптов, кодирующих полноразмерный белок.
Идентифицированные нами экзоны 1a, 2a, 7u, 6a, 7d и 7b гена SGMS1 человека выявляют высокую степень сходства с отдельными участками альтернативных транскриптов гена Sms1 мыши, а также с анонимными EST крысы, свиньи, макаки, бабуина, овцы и быка, депонированными в базе данных GenBank и, вероятно, представляющими области гена Sms1 у этих организмов. Эти данные позволяют предположить высокое сходство организации гена Sms1 и, возможно, механизмов его функционирования, обеспечивающих синтез высоко консервативного белка у млекопитающих, необходимого для поддержания их жизненной активности.
Изменения экспрессии гена SGMS1 связано с развитием ряда паталогических состояний, в том числе с развитием раковых опухолей. Результаты нашего исследования показывают, что уровень содержания транскриптов гена SGMS1 в контрольных образцах тканей (здоровые), а также в тканях легкого и пищевода, прилежащих к опухоли, существенно варьирует. В связи с этим изменение уровня транскриптов SGMS1 в каждом образце опухоли мы исследовали относительно прилежащей к нему ткани. Уменьшение экспрессии гена SGMS1 в образцах тканей рака легкого относительно прилежащей ткани наблюдается в большинстве исследованных образцов - независимо от стадии заболевания, метастазирования или TNM-индексов опухолей. Исследование образцов РНК из разных типов рака легкого позволяет предположить, что уменьшение экспрессии гена SGMS1 является типичной характеристикой опухолей рака легкого, а также, возможно, участвует в его развитии. Оказалось, что в образцах опухолей рака пищевода незначительное изменение уровня экспрессии гена SGMS1 разнонаправлено: примерно в половине рассматриваемых образцов наблюдается повышение экспрессии, а в трети– ее снижение, в оставшихся образцах - изменения несущественны. При этом зависимости между направлением изменения экспрессии и гистологическим типом опухоли, стадией заболевания, способностью к метастазированию или TNM-индексами не наблюдается.
Полученные нами результаты свидетельствуют о различающемся характере изменения уровня экспрессии гена SGMS1 в опухолях рака легкого и пищевода по сравнению с прилежащей тканью. Опубликованные ранее данные также указывают на различающиеся изменения содержания СМ в опухолях различного генеза. Так, уровень сфингомиелина и активность фермента SMS повышены при гепатоме, раке простаты, меланоме и других опухолях [132, 133, 185], а при раке пищевода и молочных желез уровень сфингомиелина понижен [12, 186].