Введение к работе
Актуальность проблемы. В 1992 году исполнилось 55 лет с момента открытия отечественными учёными на Дальнем Востоке нового для медицины тяжёлого вирусного инфекционного заболевания - клещевого энцефалита. В настоящее время очаги этой инфекции найдены во многих географических зонах России, странах СНГ, Европы, Азии и Америки. Несмотря на интенсивность изучения данного заболевания, разработку и использование новых лечебно-профилактических и диагностических препаратов, клещевой энцефалит по-прежнему представляет серьёзную проблему для органов здравоохранения, так как уровень заболеваемости имеет постоянную тенденцию к росту.
В борьбе с клещевым энцефалитом ведущим мероприятием является эффективная вакцинопрофилактика. Выпускаемая в настоящее время инактивированная сорбированная культураль-ная вакцина готовится из 2-х штаммов: 205 (НПОВирион», г.Томск) и «Софьин» (ИПВЭ РАМН, г. Москва).
Преимуществом штамма 205 являются более выраженные иммуногенные и антигенные свойства по сравнению со штаммом Софьин, а так же высокая репродуктивная активность в клеточных культурах и организме восприимчивых животных [М.СВо-робьёва,1981; ЛАВерета, М.С.Воробьёва,1990]. Штамм 205 подробно охарактеризован по ряду генетических маркёров [М.С.Воробьёва, 1981,1984; М.НРасщепкина,1984; ИДКотыхов, 1989,1990]. Вместе с тем, совершенно неизучена стабильность вакцинного штамма 205 в процессе длительного пассирования в лабораторно-произ-водственных условиях. Обладание данной информацией позволит более детально проводить обязательный ежегодный контроль штамма 205 и более длительно пассировать посевной вирус при приготовлении вакцины, что даст возможность более продолжительное время использовать штамм в качестве производственного.
Цель работы - получение детальной характеристики стабильности биологических и антигенных свойств производственного штамма 205 вируса клещевого энцефалита с помощью комплекса генетических маркёров в процессе серийного пассирования.
Основные задачи исследования. В соответствии с поставленной целью в задачи исследования входило:
1 Получить варианты производственного штамма 205 вируса КЭ, прошедшие разное количество пассажей через мозг белых мышей линии BALB/c.
-
Охарактеризовать исходную популяцию производственного штамма и его вариантов в тестах in vivo и in vitro.
-
Изучить антигенные взаимосвязи производственного штамма и его вариантов с другими штаммами вирусов, входящих в группу клещевого энцефалита.
-
Оценить чувствительность различных линий инбредных мышей и сирийских хомячков к исходному производственному штамму 205 и его пассажным вариантам.
-
На основе полученных пассажных уровней вируса приготовить экспериментальные серии вакцины и оценить ее иммуноген-ные и антигенные свойства.
Научная новизна и практическая значимость.Впервые изучена генетическая стабильность основных свойств производственного штамма 205 вируса КЭ в процессе серийного пассирования. Показана стабильность штамма по признакам терморезистентности, чувствительность к детергентам, бляшкообразованию, нейровирулентности для мышей при интрацеребральном и внут-рибрюшинном инфицировании в течении 20 внутримозговых пассажей на мышах линии BALB/c.
Изучена зависимость нейровирулентных свойств производственного штамма 205 и его пассажных уровней от генотипа лабораторных животных.
Впервые получены данные по возможности использования мышей линии A/Sn в качестве модели для изучения ВКЭ. Выявлена ста-бильностьнейровирулентных свойств производственного штамма 205 в отношении мышей линий BALB/c, A/Sn и C57BL/6 при серийном пассировании.
Исследована патогенность производственного штамма 205 и его пассажных уровней для сирийских хомячков. Установлено, что пассирование вируса повышает его вирулентные свойства при
-3-интрацеребральном заражении животных, начиная с 10
Изучены патогенетические механизмы инфекции у сирийских хомячков при заражении их вариантами штамма 205. Данные результаты включены в разработанный ГНИИСК им. ЛАТарасе-вича рабочий документ по требованиям к стандартизации и аттестации штаммов флавивирусов, предназначенных для производства вакцин и диагностических препаратов.
Проведено изучение антигенных свойств производственного штамма 205 и его вариантов при помощи моноклональных антител. Для этой цели в эксперименте были подобраны условия и компоненты для тест-системы ИФА Обнаружены изменения связывания MICA к нескольким эпитопам белков Е и NS3 со штаммом 205 после проведения 20 последовательных пассажей в мозгу мышей.
Получена инактивированная вакцина из вариантов производственного штамма ВКЭ и дана оценки её антигенных и иммуноген-ных свойств.
Результаты исследования носят экспериментальный характер, но могут быть использованы для контроля стабильности свойств штаммов вируса, применяемых для приготовления вакцины клещевого энцефалита.
На защиту выносятся следующие основные положения:
-
Стабильность генетических свойств штамма 205 ВКЭ (mNic+, mNip+,II+,T50+,S+, увствительности к дезоксихолату натрия) в процессе длительного пассирования в мозгу мышей линии BALB/c.
-
Изменение антигенной структуры штамма 205 в результате пассирования.
-
Новые биологические модели (линия мышей A/Sn и перевиваемая линия клеток почки Масаса Rhesus LLCMK-2) для экспериментальных исследований вируса клещевого энцефалита.
-
Антигенные и иммуногенные свойства экспериментальной вакцины, приготовленной из вируса, прошедшего 20 внутри-мозговых пассажей на мышах линии BALB/c.
Апробация диссертации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на итоговых конференциях молодых ученых Си-
-4-бирского Государственного медицинского Университета за 1990 -1992 годы. В завершённом виде диссертационная работа апробирована на заседании Экспертного Совета Томского НИИ вакцин и сывороток НПОВирион» в июне 1992 года.
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 4 научных статьи.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 226 работ. Экспериментальные данные иллюстрированы 13 рисунками и 24 таблицами.